專利名稱：穩定表達植物甜味蛋白基因的哺乳動物細胞系及構建方法
技術領域：
本發明公開了一種穩定表達植物蛋白基因的哺乳動物細胞系，同時還提供了構建 該哺乳動物細胞系地方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
Thaumatin是一種來源于西非熱帶植物的天然的甜味蛋白質，主要由 (Thaumatinl, II)和(Thauamtin a, b，c)組成，其甜度按重量計是蔗糖的1600倍，按摩爾 計是蔗糖的100000倍。甜味蛋白是一類高甜度、低熱量無糖的天然蛋白質。但由于其生長 條件十分苛刻在原產地之外不能結實，使得通過天然途徑提取的Thaumatin產量很低，而 化學合成成本又十分昂貴。目前，甜味蛋白已經在大腸桿菌、酵母、絲狀真菌以及多種植物細胞包括黃瓜、西 紅柿、梨、番茄和草莓中進行了表達，哺乳動物細胞表達系統可克服原核生物不易折疊的空 間構象，能夠很好的形成二硫鍵與空間構象，且具有蛋白質后加工的優勢，又避免的植物作 物生長周期長的缺點。經檢索未見甜味蛋白基因在哺乳動物細胞中表達的文獻報道。
發明內容
本發明提供了一種穩定表達植物蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系，使植物 蛋白在哺乳動物細胞中得到了表達。本發明還提供了上述哺乳動物細胞系的制備方法，能夠制備帶有穩定表達植物甜 味蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系。本發明提供了穩定表達植物蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系，是一種帶有 穩定表達植物甜味蛋白Thaumatin基因的細胞系。本發明穩定表達植物蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系的構建方法，穩定表 達植物甜味蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系的制備方法，包括以下幾個步驟
(1)利用重疊延伸PCR方法合成Thaumatin基因；
(2)將Thaumatin基因插入真核表達載體的多克隆位點上，得到重組表達載體 pCAG-Neo—Thaumatin ；
(3)將重組表達載體pCAG-Neo-Thaumatin轉染并篩選出穩定表達Thaumatin基因的細 胞系。采用重疊延伸PCR的方法，合成了具有哺乳動物偏愛性的Thaumatin甜味蛋白基 因序列，基因序列見SEQ ID No. 1。本發明Thaumatin基因的合成引物見SEQ ID No. 2。具體步驟如下
1、真核表達載體的構建
根據Thauamtin在哺乳動物牛中的密碼子的偏愛性設計基因序列，且在前方添加了信號肽，設計了 36條引物(見SEQ ID No. 2)；通過重疊延伸PCR的方法獲得Thauamtin基因 序列見SEQ ID No. 1并且通過設計一對引物利用PCR的方法在其ATG前方添加了 Kozak序 列。上游引物Tl :5，CCGfi^7~7TGCCGCCACCatgaaggtcctgat3， (斜體為EcoKI酶切位點，下劃線為Kozak序列)
下游引物 T2: 5’ CCGCTCiS^TCAGGCTGTAGGGCAGAATGTCAC 3’ (斜體為損ο I酶切位點)
給Eam和煬Ol酶切將PCR擴增的基因與pCAG-neo載體相連，獲得了表達Thaumatin 基因的真核表達載體。2、穩定表達Thauamtin基因的HEK-293細胞系的構建。本發明采用基因工程的方法，將Thauamtin基因插入到真核細胞表達載體多克隆 位點處，得到重組表達載體。本發明在細胞水平上通過細胞轉染及細胞篩選技術篩選出可以表達植物蛋白 Thaumatin基因的細胞系。本發明的積極效果在于將構建的pCAG-neo-Thauamtin載體線性化后，利用脂質 體LipofectamineTM2000轉染HEK-293細胞，經G418壓力篩選10天后，獲得抗性細胞。采 用一系列的方法對所獲得的細胞在基因水平、轉錄水平和翻譯表達水平進行鑒定，獲得了 穩定表達Thauamtin基因的HEK-293細胞系，利用RT-PCR、Western blot在哺乳動物細胞 水平上檢測了植物甜味蛋白Thaumatin基因的表達。
圖1為重組表達載體pCAG-neo-Thaumatin和穩定表達細胞系的構建流程圖。
2 Thaumatin ^j^SS ；M :D2000 ；1 =Thaumatin圖3為Thaumatin陽性克隆PCR鑒定結果；1 空白基因組對照，2 :T水；3 :Τ3;4:Τ 5;5:Τ6;6:Τ8;7:Τ9;8:Τ10;9:Τ11; 10:Τ12; 11:Τ14; 12:Τ17; 13:Τ18; 14:Τ+0圖 4 為 RT-PCR HEK-293 細胞中 GAPDH 內參基因 258bp ；M :D2000, 1 水對照；2 :T5 ； 3 :Τ6 ；4 =TlO ；5 :Τ14 ；6 :Τ17 ；7 :Τ18。圖5為RT-PCR分析細胞株中Thaumatin基因反轉錄情況；M :D2000，1 反轉錄 CAG-neo 對照；2 :T5 ；3 :Τ6 ；4 =TlO ；5 :Τ14 ；6 :Τ17 ；7 :Τ18 ；8 :Τ+。圖6為穩定表達Thauamtin的各細胞株的GAPDH Western blot結果。圖7為穩定篩選293細胞Thaumatin基因細胞系Western blot結果；N CAG-neo 細胞；T5:T5 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；Τ6:Τ6 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞； Τ10:TlO 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；Τ14:Τ14 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；Τ17:Τ17 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；Τ18:Τ18 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；標準品陽性對照。圖8為穩定篩選293細胞Thaumatin基因細胞上清Western blot結果；N CAG-neo 細胞上清；T5:T5 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞上清；Τ6:Τ6 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞上 清；Τ10:Τ10 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞上清；Τ14:Τ14 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞上清； Τ17:Τ17 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞上清；Τ18:Τ18 株 CAG-NEO-Thaumatin 細胞；標準品 陽性對照。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背 離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改 動或改變都將落入本發明的待批權利要求范圍之內。實施例1 Thaumatin基因的獲得
1、以下通過引物進行延伸反應獲得 表1延伸模板
權利要求
帶有穩定表達植物甜味蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系。
2.具有哺乳動物細胞偏愛性Thaumatin基因序列見SEQID No. 1。
3.權利要求2所述Thaumatin基因的合成引物見SEQID No. 2。
4.實現權利要求1穩定表達植物甜味蛋白Thaumatin基因的哺乳動物細胞系的制備方 法，包括以下幾個步驟(1)利用重疊延伸PCR方法合成Thaumatin基因；(2)將Thaumatin基因插入真核表達載體的多克隆位點上，得到重組表達載體 pCAG-Neo—Thaumatin ；(3)將重組表達載體pCAG-Neo-Thaumatin轉染并篩選出穩定表達Thaumatin基因的細 胞系。
全文摘要
本發明提供了一種植物甜味蛋白基因穩定表達哺乳動物細胞系及構建方法，將構建的pCAG-neo-Thauamtin載體線性化后，利用脂質體LipofectamineTM2000轉染HEK-293細胞，經G418壓力篩選10天后，獲得抗性細胞。采用一系列的方法對所獲得的細胞在基因水平、轉錄水平和翻譯表達水平進行鑒定，獲得了穩定表達Thauamtin基因的HEK-293細胞系，利用RT-PCR、Westernblot在哺乳動物細胞水平上檢測了植物甜味蛋白Thaumatin基因的表達。
文檔編號C12R1/91GK101979509SQ20101029284
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月27日 優先權日2010年9月27日
發明者周楊, 宋娜, 李小平, 李莉, 歐陽紅生, 王海軍, 賴良學, 逄大欣, 閆森, 高飛 申請人:吉林大學