銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素中的應用的制作方法

本發明涉及微生物領域，具體地說，涉及銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素中的應用。

背景技術：

棒曲霉素(patulin)，又稱展青霉素，是一種具有神經毒性的真菌代謝產物，廣泛存在于多種食品、飼料加工原料中，在以蘋果為加工原料的產品中尤為突出。大量的研究表明，棒曲霉素具有基因毒性、細胞毒性、免疫毒性和生殖毒性，能夠導致哺乳動物細胞的dna損傷，染色體畸變和微核形成，并且會損害動物的腎臟、肝臟和腸等器官組織，嚴重危害人及動物的健康。隨著蘋果汁、蘋果濃縮汁、蘋果酒等在人們日常飲食中所占比例的不斷增加，世界衛生組織(worldhealthorganization,who)對食品中棒曲霉素的最低限量做了嚴格規定(＜50μg·l^-1)，并有不斷降低的趨勢。

棒曲霉素去毒方法可分為物理、化學和生物三大類，其中生物法因具有效率高、特異性強以及對食品、飼料和環境沒有污染的特點，利用生物手段進行棒曲霉素的降解則成為近年來棒曲霉素毒素降解研究的熱點。

現有技術公開了銅綠假單胞菌在降解高效氯氰菊酯、玉米赤霉烯酮、黃曲霉素、赭曲霉素等方面的應用，但尚未見到銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素方面的研究和報道。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素中的新應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明首先提供了一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素中的應用。

本發明保護銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產物在降解棒曲霉素中的應用。

本發明還保護銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產物在制備產品中的應用；所述產品的用途為降解棒曲霉素。

本發明還保護一種降解棒曲霉素的方法，為使用銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產物對棒曲霉素進行降解處理。

所述方法中，降解處理的方式為將銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產物與含有棒曲霉素的樣品混合。

本發明還保護一種產品，其活性成分為銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產物；所述產品的用途為降解棒曲霉素。

在本發明的一個具體實施方式中，所述銅綠假單胞菌，具體為保藏編號為：cgmccno.8511的銅綠假單胞菌n17-1。

本發明涉及到的原料或試劑均為普通市售產品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領域常規操作。

本發明的有益效果在于：

本發明通過實驗證明，首次發現了銅綠假單胞菌可高效降解棒曲霉素。銅綠假單胞菌作為棒曲霉素降解的生物材料，在開發新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中lc檢測結果圖。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

銅綠假單胞菌n17-1(pseudomonasaeruginosa)：保藏編號：cgmccno.8511。記載并保護“銅綠假單胞菌n17-1”的專利的申請號為：201410001212.1，授權公告號為cn103710292b(授權公告日為2016.01.20)。

ppb：μg/l。

棒曲霉素，標準品:sigma-aldrich,產品編號：p1639。

棒曲霉素的結構式如下：

實施例1、銅綠假單胞菌n17-1對棒曲霉素的降解作用

nb液體培養基：由溶劑和溶質組成；溶質為蛋白胨、牛肉膏和nacl，溶劑為水；蛋白胨在nb液體培養基中的濃度為1g/100ml，牛肉膏在nb液體培養基中的濃度為0.3g/100ml，nacl在nb液體培養基中的濃度為0.5g/100ml。

1、將銅綠假單胞菌n17-1接種于液體nb培養基中至初始od600nm＝0.05，37℃條件下，200rpm(旋轉半徑20mm)震蕩培養24h，收集全部菌液(即含有菌體和上清在內的整個培養體系)。

2、將1mg棒曲霉素標準品溶解于10ml色譜純甲醇中獲得濃度為100ppm的棒曲霉素溶液。

3、制備實驗組溶液：

菌懸液充分混勻后，取1.0ml步驟1收集的菌液，置于1.5ml離心管中，10000g離心10min，棄上清，加入1mlpbs(ph4.0，0.05mol/l)，渦旋混勻，再次于10000g離心10min，反復洗滌3次。棄上清，加入0.99mlpbs溶液，渦旋混合使菌體分散開，向離心管中加入10μl步驟2得到的棒曲霉素溶液，充分混勻后于恒溫振蕩器中37℃，200r/min避光培養72小時，得到實驗組溶液。

4、制備對照組溶液：

以0.99mlpbs加入10μl的棒曲霉素溶液(100ppm)作為對照組，記作對照組溶液。

5、效果檢測：

實驗組溶液和對照組溶液分別作為待測溶液，進行如下步驟：

(1)待測溶液經過10000g離心10min后，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，避光凍存，以備hplc分析。

(2)取步驟(1)得到的上清液，進行lc(液相色譜)。

waters2695高效液相色譜系統(waters2478紫外檢測器)，色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，粒徑5μm；流動相：乙腈/水(10:90，v/v)；檢測波長：276nm；流速：1.0ml/min；柱溫：室溫；進樣量：20μl。

用棒曲霉素標準品的梯度稀釋液代替樣品液進行上述步驟。

計算棒曲霉素降解率，計算方法為：

降解率(％)＝(對照組棒曲霉素含量-實驗組棒曲霉素含量)/對照組棒曲霉素含量×100％。

實驗重復三次，結果取平均值。

lc檢測結果如圖1所示。圖1中，a為棒曲霉素標準品的分析結果，b為對照組溶液的分析結果，c為實驗組溶液的分析結果。結果表明，銅綠假單胞菌n17-1對棒曲霉素有較好的降解效果，經過統計降解率為93.4±0.4％。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

技術特征：

技術總結
本發明涉及微生物領域，具體公開了銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解棒曲霉素中的新應用。本發明通過實驗證明銅綠假單胞菌可高效降解棒曲霉素，銅綠假單胞菌作為棒曲霉素降解的生物材料，在開發新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很好的應用前景。

技術研發人員：劉陽;趙月菊;黃思琦;宗英;邢福國;王龑
受保護的技術使用者：中國農業科學院農產品加工研究所
技術研發日：2017.06.01
技術公布日：2017.09.29