專利名稱：基于顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術檢測ev71病毒基因的制作方法
技術領域：
本發明是用基于HNB顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術檢測手足口病病原體-腸道病毒EV71型VPl基因。用于各級疾病預防控制機構，腸道病毒檢測網絡實驗室，哨點醫院對EV71病毒的檢測和監測。
背景技術：
手足口病(Hand-foot-mouth Disease, HFMD)是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、 口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數患者可出現無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經源性肺水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，可導致死亡。引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組、B組、腸道病毒71型(Human Enterovirus 71，EV71)、埃可病毒等。2008年以來引起國內爆發多次手足口病的病原主要為EV71型腸道病毒。為有效阻止疫情的爆發和發生疫情后的應急處置，根據衛生部應對手足口疫情防控要求，我國已決定在各地增加腸道病毒檢測實驗室和哨點醫院，擴大監測網絡的覆蓋范圍。將網絡實驗室擴大到整個地市一級，目標是使全國300多個地市都具備能夠進行腸道病毒檢測的能力，切實做到早發現、早報告、早處置。本專利成功建立的基于顏色的RT-LAMP 檢測人腸道病毒EV71基因方法，將為提高我國疾病監測網絡實驗室和哨點醫院的腸道病毒監測能力，實現對手足口病人的快速篩查提供了有力的技術保障。基于顏色的RT-LAMP技術在RNA病毒的檢測方面應該有著傳統基因診斷方法無法比擬的優勢，與一些常規的基因檢測手段相比，該技術在可操作性和檢測時間及設備要求方面具有更大的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，它的檢測時間可以縮短到兩小時以內，靈敏度可達到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子。除了應用一些常用聚合酶外，對硬件設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的質控工作。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，加之擴增反應在65°C等溫條件下進行，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了 RNA酶和擴增核酸的污染機會。第三，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善。第四，RT-LAMP的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸鎂白色沉淀，HNB染料在擴增前加入，因此肉眼也可觀察到陽性反應管中的白色混濁物和反應管內顏色的變化，可以直接判定檢測結果。
發明內容
1.本發明是對目前對EV71病毒檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、 靈敏、便捷的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式 PCR的二次擴增步驟，只需一步就可完成實驗操作，沒有核酸的變復性過程，減少了 RNA酶和擴增核酸的污染機會，提高了檢測的敏感性和安全性。第三，所有的擴增過程都可在65°C 同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求，由于HNB染料在擴增前加入，可以肉眼直接判定檢測結果，無需電泳。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。2.選擇人腸道病毒EV71型VPl基因的3(^8-32 位的相對保守區設計相應的 RT-LAMP引物，其中包括兩條外引物(F3、B!3)和兩條內引物(FIP、BIP)，兩條環結合引物 (LoopU Loop2)0所有引物的具體序列見表1。表1 :RT-LAMP檢測人腸道病毒EV71型VPl基因的引物序列
權利要求
1.一禾中用于手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)病原體Enterovirus 71 型(EV71)病毒VPl基因檢測的基于HNB顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)，其中包括用于EV71病毒VPl基因檢測的6條寡核苷酸引物和HNB(羥基萘酚藍)染料。
2.權力要求1所述的EV71病毒VPl基因檢測的環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP) 的引物包括表1所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3.權力要求1所述的EV71病毒VPl基因檢測的環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP) 包括EV71病毒及其變異株。
4.權力要求3所述的本發明的應用范圍包括各級疾病預防控制機構，腸道病毒檢測網絡實驗室，哨點醫院用于EV71病毒VPl基因的檢測和監測。
5.權力要求1所述的EV71病毒VPl基因檢測的基于HNB顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)的反應程序和檢測程序。
全文摘要
本發明屬于生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，腸道病毒檢測網絡實驗室，哨點醫院等用于對以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀的疑似手足口病病人的咽拭子、血清、糞便等標本的人腸道病毒EV71型VP1基因的檢測和監測。具體是應用基因顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)，通過生物信息學專業軟件分析人腸道病毒EV71型VP1基因的保守序列，設計出六條引物完全與識別的VP1靶序列中八個結合區匹配，省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，反應前加入HNB(羥基萘酚藍)染料，只需一步就可完成在65℃等溫環境中擴增1小時，最后用肉眼觀察顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結果，與傳統的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優勢。
文檔編號C12N15/11GK102417933SQ20101029446
公開日2012年4月18日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者張勇, 聶凱, 董小平, 許文波, 馬學軍 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所