基于顏色判定的環介導等溫擴增（LAMP）技術檢測雪松疫霉根腐病菌的制作方法

本發明涉及一種檢測雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物檢測雪松疫霉根腐病菌的分子檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

雪松疫霉根腐病菌是一用于種重要的毀滅性植物病原菌，可侵染美國扁柏Chamaecyparis lawsoniana(A.Murray bis)Parlatore引起嚴重的根腐病。病害最早于1923年在美國西雅圖、華盛頓附近的觀賞植物上有報道發生，直到1942年，病菌在美國俄勒岡州的威拉梅特谷被發現并命名，病菌造成俄勒岡州西北部和華盛頓西部觀賞植物的嚴重經濟損失，使極具價值的園藝栽培種幾乎全部毀滅，隨后病菌傳入加拿大、法國，對當地觀賞植物及林業貿易造成嚴重影響^[1]。由于該病害為害重、傳播快，而防治根除又極為困難，該病原菌已引起歐盟等許多國家的高度重視，紛紛采取措施嚴防其傳入。近年來，由于國際間苗木及其植物包裝材料的調運日趨頻繁，該病原菌極可能傳入我國，一旦傳入，將對我國農林業、生態環境等造成重大威脅。由于我國未有雪松疫霉根腐病菌發生的報道，國家質檢總局于2007年將該病菌列入新修訂的《進境植物檢疫性有害生物名錄》中。為了防止該病原菌傳入我國，需要對其進行快速、準確地檢測，因此針對雪松疫霉根腐病菌的檢測我們進行了一系列的研究。

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker&Milbrath)又名側生疫霉，隸屬藻菌界(Chromista)，卵菌門(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉屬(Phytophthora)，是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均很廣泛。病菌在V8培養基上生長速度較慢(2mm/d～4mm/d)，菌落平貼至中度的蓬松。最低生長溫度為3℃，最適生長溫度20℃，最高生長溫度26℃。菌絲無隔、分枝多而短，無色，常見的是光滑的，偶爾也有粗糙的，長時間培養后會在培養基上形成一層薄膜。可產生菌絲膨大體，最終形成厚垣孢子，厚垣孢子棕褐色，直徑22μm～77μm，平均40μm，無柄，單個生于孢子梗頂端。病菌孢子囊無乳突，叢生于孢囊梗上，卵圓形、倒卵形、倒梨形，20μm～60μm×12μm～20μm(平均26μm×15μm)，長寬比1.67～5:1，平均1.73:1，游動孢子有側生雙鞭毛，直徑為10μm～12μm。病菌為同宗配合，雄器側生，藏卵器球形、光滑，卵孢子滿器、壁厚約6μm，直徑28μm～46μm，平均40μm^[1]。

傳統病原菌的分類、鑒定主要基于形態學特性、致病性測定等，操作繁瑣，耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾^[2]，隨著分子生物學的發展，分子生物學技術已逐步應用到雪松疫霉根腐病菌的研究中。基于普通PCR的方法已經成功用于檢測雪松疫霉根腐病菌^[3,4]，雖然普通PCR法在特異性和靈敏度上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時普通PCR方法依賴精密的溫度循環裝置，檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是日本的榮研株式會發明的一種新的核酸擴增技術^[5]，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代普通PCR的新的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～65℃范圍60～70min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生^[6]。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。

靶標基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。目前，分子檢測常用的靶標基因有核糖體基因轉錄間隔區(Internal transcribed space,ITS)，然而許多學者認為該靶標沒有足夠的變異位點區分所有的疫霉種^[7]。本發明選用的新型靶標三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白基因(Ypt1)是一個與原癌基因Ras(Rat sarcoma)相關的基因，在酵母中，該基因編碼一個與Ras相關的GTP結合蛋白。Ypt1基因包含有多個內含子，非編碼區具有足夠多的特異性位點，并且其序列在種內高度保守，非常適合作為疫霉菌的分子檢測靶標^[8]。

參考文文獻如下：

1.Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367.

2.Daniells J,Davis D,Peterson R,et al..Goldfinger:not as resistant to sigatoka/yellow sigatoka as first thought.Infomusa，1995,4(1):6.

3.Winton,L.M.；Hansen,E.M.Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees,water,and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction.Forest Pathology,2001,31(5):275-283.

4.紀睿,王健生,廖太林,李百勝,張正光,鄭小波.雪松疫霉(Phytophthora lateralis)的快速分子檢測.植物病理學報,2014,44(2):113-120.

5.Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,and Hase,T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,2000,28:e63-e63.

6. 6.Yasuyoshi Mori,Kentaro Nagamine,Norihiro Tomita,and Tsugunori Notomi.Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289:e150-e154.

7.White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.,and Taylor,J.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.1990,Pages 315-322in:PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,and T.J.White,eds.Academic Press,San Diego,CA.

8.Chen Y,Roxby R.Characterization of a Phytophthora infestans gene involved in vesicle transport.Gene,1996,181(1-2):89-94.

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是解決現有技術中雪松疫霉根腐病菌的生物學檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性差的問題及PCR檢測技術需要熱循環儀器，成本高、無法快速檢測雪松疫霉根腐病菌的問題，從而提供了雪松疫霉根腐病菌新的分子檢測方法，對雪松疫霉根腐病菌進行LAMP檢測，該方法檢測周期短(僅需80min)、特異性強、靈敏度高、可肉眼觀察檢測結果且不需昂貴儀器成本低、操作簡便易行。

新型靶標基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測的關鍵因素。目前，分子檢測廣泛應用的是基于核糖體轉錄間隔區(ITS)的靶標，但由于ITS序列沒有足夠的變異位點區分所有的疫霉種，因此需要發掘出新的分子檢測靶標。首先，查找相關文獻選取了tRNA(轉運RNA)EF1α(翻譯延長因子)、Ypt1(三磷酸鳥苷結合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶標，然后依次篩選靶標基因，最終選擇Ypt1作為檢測栗疫霉黑水病菌的靶標基因。再對以該靶標基因設計的多套引物進行試驗和驗證，篩選出一套檢測雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物。

本發明提供的技術方案是：

本發明選取新型靶標基因，設計和篩選用于檢測雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，其包括四條特異性引物F3、B3、FIP、BIP和一條環引物LB，引物序列分別如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示，具體見下表1。

表1雪松疫霉根腐病菌LAMP引物序列

同時，本發明還提供一種利用上述引物檢測雪松疫霉根腐病菌的方法，其過程是：提取待測樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進行LAMP擴增反應，反應后，在常光下肉眼觀察，以羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue,HNB)的顏色變化進行結果判定，常光下，天藍色表示檢測結果為陽性，即樣品中檢測到雪松疫霉根腐病菌，紫色表示檢測結果為陰性，即樣品中未檢測到雪松疫霉根腐病菌。(圖1)

上述檢測雪松疫霉根腐病菌的方法，其LAMP擴增反應體系為：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜堿(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，內引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，環引物LB(10μM)1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL-1)，模板DNA 2μL，用滅菌去離子水補足體積至26μL。

上述檢測雪松疫霉根腐病菌的方法，其LAMP擴增反應程序為：62℃，80min。

有益效果

本發明與現有技術相比，具有以下有益效果：

(1)實用性好。普通PCR反應對產物進行凝膠電泳很容易造成產物擴散，這是實驗室污染的一個主要來源；而且溴化乙錠(EB)有劇毒，可累積致癌；長期觀察紫外燈也會對實驗人員造成一定程度的傷害。而LAMP反應只需在恒溫水浴鍋中進行，反應結束之后通過HNB的顏色變化便可直接判斷結果，整個操作過程簡單易行，適用于對雪松疫霉根腐病菌的口岸檢疫和病害的快速診斷。

(2)恒溫擴增。不像PCR法必須要熱循環，這樣就擺脫了對熱循環儀器的依賴，只要有穩定的熱源LAMP反應就可以發生，極大的擴展了LAMP使用的范圍，LAMP之所以能在恒定的熱源下發生反應是因為在LAMP反應液中添加了甜菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動態平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下實現擴增。

(3)準確性高。由于傳統雪松疫霉根腐病菌檢測技術只是根據形態特征來進行鑒定，耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾；而本發明根據雪松疫霉根腐病菌的Ypt1序列，該序列在雪松疫霉根腐病菌中的基因組中非常保守，利用Bioedit軟件將雪松疫霉根腐病菌的Ypt1序列和其他疫霉菌的Ypt1序列進行比較，設計雪松疫霉根腐病菌特異性的LAMP引物。LAMP反應通過4條引物特異性識別靶序列上的6個獨立區域，相對于普通PCR引物識別靶序列的2個獨立區域而言，特異性和靈敏度都比較高。

本發明的檢測體系在62℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到雪松疫霉根腐病菌，且不需要復雜儀器，為雪松疫霉根腐病菌的檢測提供了新的技術平臺，能較好滿足對雪松疫霉根腐病菌的現場檢測，適用于出入境植物和植物產品的檢驗檢疫和病害的調查、快速診斷及監測等，對防止雪松疫霉根腐病菌傳入我國具有重要意義，同時，本發明體系的建立也為其他病原菌的檢測提供了技術指導和理論依據。

附圖說明

圖1 LAMP反應加入HNB顯色反應試驗，其中，-:陰性反應呈現紫色；+:陽性反應呈現天藍色。

圖2雪松疫霉根腐病菌Ypt1基因核酸序列及引物位置。

圖3引物的通用性驗證；

其中1:P.lateralis(ATCC 44777)；2:P.lateralis(CBS 102608)；3:P.lateralis(CBS 117106)；4:P.lateralis(CBS 168.42)；5:陰性對照。

圖4引物的種間特異性驗證；

其中1:雪松疫霉根腐病菌P.lateralis；2‐4:栗疫霉黑水疫霉P.cambivora；5,6:櫟樹猝死病菌P.ramorum；7:大豆疫霉P.sojae；8:致病疫霉P.infestans；9:大雄疫霉P.megasperma；10:瓜類疫霉P.melonis；11:辣椒疫霉P.capsici；12:苜蓿疫霉P.medicaginis；13:掘氏疫霉P.drechsleri；14:棕櫚疫霉P.palmivora；15:荔枝霜疫霉Peronophthora litchii；16:惡疫霉P.cactorum；17:苧麻疫霉P.boehmeriae；18:隱地疫霉P.cryptogea；19:煙草疫霉P.nicotianae；20:陰性對照。

圖5引物的屬間特異性驗證；

其中1:雪松疫霉根腐病菌P.lateralis；2:禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum；3:尖鐮孢菌F.oxysporum；4:層出鐮孢菌F.proliferatum；5:木賊鐮孢菌F.equiseti；6:茄腐鐮孢菌F.solani；7:燕麥鐮孢菌F.avenaceum；8:黃色鐮孢菌F.culmorum；9:平頭炭疽菌Colletotrichum truncatum；10:膠孢炭疽菌C.gloeosporioides；11:多主棒孢菌Corynespora cassiicola；12:大豆炭腐病菌Macrophomina phaseolina；13:大豆紫斑病菌Cercospora kikuchii；14:立枯絲核菌Rhizoctonia solani；15:冬青麗赤殼菌Calonectria ilicicola；16:玉蜀黍平臍蠕孢菌Bipolaris maydis；17:米曲霉菌Aspergillus oryzae；18:稻瘟病菌Magnaporthe grisea；19:大豆南方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis；20:大豆北方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora；21:大豆莖褐腐病菌Phialophora gregata；22:大豆擬莖點種腐病菌Phomopsis longicolla；23:大豆銹菌Phakopsora pachyrhiz；24:陰性對照。

圖6雪松疫霉根腐病菌LAMP檢測方法的靈敏度檢測；

其中1-8:分別以100ng·μL^-1、10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1、10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1濃度梯度的雪松疫霉根腐病菌DNA作為反應模板；9:陰性對照。

具體實施方式

實施例1：選取新型靶標基因，設計和篩選用于檢測雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，并建立LAMP檢測體系

(一)新型靶標基因的選取及引物的設計和篩選

新型靶標基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測的關鍵因素。目前，分子檢測廣泛應用的是基于核糖體轉錄間隔區(ITS)的靶標，但由于ITS序列沒有足夠的變異位點區分所有的疫霉種，因此需要發掘出新的分子檢測靶標。首先，查找相關文獻選取了tRNA(轉運RNA)EF1α(翻譯延長因子)、Ypt1(三磷酸鳥苷結合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶標。以靶標Ypt1為例，從GeneBank中下載雪松疫霉根腐病菌的Ypt1基因序列和其它疫霉種的Ypt1基因序列，然后應用Bioedit軟件對所有下載的Ypt1基因序列進行對比分析，并使用PrimerExplore V4軟件在線設計引物，根據引物長度、引物自由能及GC含量等選取合適的引物進行實驗，從中篩選種內通用性好，種間特異性強，屬間特異性強，靈敏度高的引物。依次篩選其他靶標，最終選擇Ypt1作為檢測雪松疫霉根腐病菌的靶標基因(圖2)。再對以該靶標基設計的多套引物進行多次試驗和驗證，選出一套通用性好，特異性強，靈敏度高，能快速，準確檢測出雪松疫霉根腐病菌的引物，序列如下：

檢測引物對((F3、B3、FIP、BIP、LB))

F3(正向外引物)：CCGTACGATCGAGCTGGA(SEQ ID NO.1)；

B3(反向外引物)：ACGTCGTACACCACGATGA(SEQ ID NO.2)；

FIP(正向內引物)(F1C+F2)：

ACCCCAAGGAAAGCGGGAAAAA-GCAAGACCATCAAGCTCCA(SEQ ID NO.3)；

BIP(反向內引物)(B1C+B2)：

CTCTTGTAGTGGGACACGGCC-GCGGTAGTAGCTGCTTGTG(SEQ ID NO.4)；

LB(環引物)：GAGCGCTTCCGCACGAT(SEQ ID NO.5)。

(二)建立雪松疫霉根腐病菌LAMP檢測體系

雪松疫霉根腐病菌LAMP反應體系：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜堿(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，內引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，環引物LB(10μM)1μL，ddH₂O1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL^-1)，2μL模板DNA。將上述混合物置于0.2mL的PCR反應管內并在渦旋器上輕微渦旋，然后離心以確保管壁上沒有液滴。將反應管置于62℃在水浴鍋中等溫反應80min。

實施例2：制備DNA模板

提取樣品的DNA作為LAMP反應的模板，具體過程如下：

(一)菌株培養及菌絲粉制備

將供試疫霉菌菌株轉至LBA(利馬豆培養基(鄭小波.疫霉菌及其研究技術.中國農業出版社.1997))平板上，其它菌株轉至PDA(馬鈴薯葡萄糖固體培養基(Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367))平板上，25℃黑暗培養3d后從菌落邊緣切取10塊2×2mm菌絲塊，疫霉菌的菌株轉至V8液體培養基(鄭小波.疫霉菌及其研究技術.中國農業出版社.1997)，其它菌株轉至PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養基(Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367))中，25℃振蕩培養5～7d，過濾收集菌絲，經冷凍抽干研磨成菌絲粉，-20℃保存備用。

(二)基因組DNA的提取

取少量菌絲粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩渦混勻，于60℃水浴1h，中間每10min上下顛倒幾次。12000rpm·min^-1離心10min，取上清液加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，顛倒混勻，12000rpm·min^-1離心10min；將上清液轉移至新管中，加入等體積的氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm·min^-1離心5min。取上清液轉移至新管中，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3mol·L^-1NaAc(pH 5.2)，-20℃靜置沉淀(>1h)。12000rpm·min^-1離心10min，傾去上清液，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg·ml^-1RNase)，37℃處理1h后，-20℃保存備用。

實施例3：檢測LAMP引物的特異性和靈敏度

(一)特異性檢測

本發明所用菌株及相關信息見表2。采用本發明所設計的引物對表2中所有供試菌株的基因組DNA進行LAMP擴增反應，HNB的顯色反應結果顯示不同來源的雪松疫霉根腐病菌反應管均呈天藍色，為陽性結果，陰性對照反應管沒有變色，仍為紫色(圖3)。雪松疫霉根腐病菌的反應管均呈天藍色，為陽性結果，其他疫霉菌、真菌和陰性對照的反應管均呈紫色，為陰性結果(圖4，5)，結果表明該引物具有很好的特異性，可以將雪松疫霉根腐病菌與其近似種及其他相關種區分開。

表2供試菌株及LAMP檢測結果

注：NJAU表示南京農業大學；CAIQ表示中國檢科院；*表示無菌株(僅提供菌株的DNA)+表示發生了LAMP擴增；‐表示無擴增。

(二)靈敏度檢測

在26μL的反應體系中測定了上述所建立的檢測體系的靈敏度，將10倍梯度稀釋的雪松疫霉根腐病菌的基因組DNA(從100ng·μL^‐1到10fg·μL^‐1)為模板進行LAMP擴增，于62℃等溫條件下反應80min。圖6顯示了靈敏度檢測結果的HNB可視化顯色圖，發生LAMP擴增時，陽性反應變為天藍色，未發生LAMP擴增的仍為紫色。檢測結果顯示最低檢測靈敏度為100pg·μL^‐1。

序列表

<110> 中華人民共和國昆山出入境檢驗檢疫局

<120> 基于顏色判定的環介導等溫擴增（LAMP）技術檢測雪松疫霉根腐病菌

<160> 5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<400> 1

CCGTACGATCGAGCTGGA 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<400> 2

ACGTCGTACACCACGATGA 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<400> 3

ACCCCAAGGAAAGCGGGAAAAA-GCAAGACCATCAAGCTCCA 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<400> 4

CTCTTGTAGTGGGACACGGCC-GCGGTAGTAGCTGCTTGTG 40

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<400> 5

GAGCGCTTCCGCACGAT 17