對蛋漬具有改進洗滌性能的枯草桿菌酶變體的制作方法

專利名稱：對蛋漬具有改進洗滌性能的枯草桿菌酶變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用枯草桿菌酶(subtilase)變體從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬。 本發明特別涉及利用枯草桿菌酶變體從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬，其中此枯草桿菌酶 變體在第95-103位(BASBPN編號，見下文)活性位點(b)環區含有至少一個額外氨基酸殘 基。在用于例如清潔或洗滌劑組合物，如衣服洗滌劑組合物或洗碗組合物，包括自動洗碗組 合物時，這些枯草桿菌酶變體有用，表現出對蛋漬優異的或改進的洗滌性能。本發明也涉及 新的枯草桿菌酶變體，編碼此變體的分離的DNA序列，表達載體，宿主細胞及生產和使用本 發明變體的方法。本發明還涉及含有本發明變體的清潔劑和洗滌劑組合物。
背景技術：
在洗滌劑工業中，酶被用于洗滌制劑已有30多年的歷史。在這些制劑中使用的酶 包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、以及其它的酶，或它們的混合物。商業上最重要的 酶是蛋白酶。大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質工程變體，例 如，DURAZYM (Novo Nordisk A/S)，RELASE (Novo Nordisk A/s)，MAXAPEM (Gist-Brocades N. V.)，PURAFECT (Genencor International, Inc.)。而且，許多蛋白酶變體在本領域中已有描述。現有技術蛋白酶變體的詳細名單已 在W099/27082中列出。然而，盡管已有大量有用蛋白酶變體的描述，但對于許多工業應用，仍需求新的改 進蛋白酶或蛋白酶變體。具體地說，由于許多蛋白酶被存在于蛋清中的物質抑制，從例如待洗衣物或硬表 面除去蛋漬的問題已經被提出。這類物質的例子包括IV-O型胰蛋白酶抑制劑(卵抑制劑 (Ovo-inhibitor))及III-O型胰蛋白酶抑制劑(卵類粘蛋白)。因此，本發明的目的是提供不被這類物質抑制或僅在有限程度上被抑制的改進的 枯草桿菌酶變體。本發明的另外一個目的是提供適于從例如待洗衣物和/或硬表面除去蛋 漬的改進的枯草桿菌酶變體。發明概述因此，本發明的第一個方面涉及枯草桿菌酶變體在從待洗衣物或從硬表面除去蛋 漬中的應用，此枯草桿菌酶變體在第95-103位(BASBPN編號)的活性位點(b)環區含有至 少一個額外氨基酸殘基。本發明的第二個方面涉及枯草桿菌酶變體，此變種選自在活性位點(b)環含有 至少一個額外氨基酸殘基，相當于在第98和99位之間至少一個額外氨基酸殘基的插入，并 且還含有至少一個額外的修飾(BASBPN編號)的變體，和在活性位點(b)環含有至少一個 額外氨基酸殘基，相當于在第99和100位之間至少一個額外氨基酸殘基的插入，并且還含有至少一個額外的修飾(BASBPN編號)的變體，其中此變體在本文實施例4中所示的“蛋抑 制分析”中檢測時具有至少10%的殘留活性。本發明的第三個方面涉及枯草桿菌酶變體，此變種選自在第98和99位之間含有 至少一個額外氨基酸殘基的插入并且還在133和143位含有替代的變體，在第99和100位 之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并且還在99位含有替代的變體，在第98和99位 之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并且還在167、170和194位含有替代的變體，在 第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并且還在第216和217位之間含 有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體，在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸 殘基的插入并且還在第217和218位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體，在 第99和100位之間含有至少一個氨基酸殘基的插入并且還在第42和43位之間含有至少 一個額外氨基酸殘基的插入的變體，和在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基 的插入并且還在第129和130位之間含有至少一個氨基酸殘基的插入的變體。本發明的第四個方面涉及編碼本發明枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。本發明的第五個方面涉及含有本發明的分離DNA序列的表達載體。本發明的第六個方面涉及用本發明表達載體轉化的微生物宿主細胞。本發明的第七個方面涉及生產本發明枯草桿菌酶變體的方法，其中在有益于所述 變體表達和分泌的條件下培養根據本發明的宿主，并且回收變體。本發明的第八個方面涉及含有本發明變體的清潔劑或洗滌劑組合物，優選洗衣或 洗碗組合物。本發明的第九個方面涉及從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬的方法，此方法包括將 含蛋漬的硬表面或含蛋漬的衣物與含枯草桿菌酶變體的清潔劑或洗滌劑組合物、優選洗衣 或洗碗組合物接觸，該變體在第95-103位(BASBPN編號)活性位點(b)環區包含至少一個
額外氨基酸殘基。本發明的另外的方面將從下面的描述及從附加的權利要求書中得到體現。關于比對和編號，參考

圖1，該圖顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN’ (BASBPN) (a)和枯草 桿菌蛋白酶309 (BLSAVI) (b)之間的比對。在本專利申請中這些比對被用作殘基編號的參考。定義
在更為詳細地論述本發明之前，將首先定義下面的術語和約定。變體名稱的命名原則和約定在描述根據本發明產生或設想的各種枯草桿菌酶變體時，為了便于提及，采用下 述命名原則和約定首先通過分離的或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN’ (BASBPN)之間的比對，定義參 照框架。為了給變體編號，可以通過9. 1版本GCG軟件包的GAP程序利用下述參數獲得該 比對斷缺區產生罰分(gap creation penalty) = 8和斷缺區延伸罰分(gap extension penalty) = 8，而所有其它參數保留其默認值。另一種方法是利用枯草桿菌酶之間的已知公認比對，例如描述于W091/00345中 的比對。在大多數情況下，這些差異并不是重要的。
因而，可以參照BASBPN對許多缺失和插入進行定義。在圖1中，與BASBPN相比， 枯草桿菌蛋白酶309 ( Savinase )在第36、58、158、162、163以及164位具有6個缺失。 這些缺失在圖1中通過星號(*)標明。在親本酶中進行的各種修飾通常使用下面三個要素來表示原始氨基酸位置替代氨基酸因此符號G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。在原始氨基酸殘基可以是任意氨基酸殘基的情況下，有時可以使用僅指示位置和 替代氨基酸的簡寫符號位置替代氨基酸關于同源枯草桿菌酶中的修飾，此種符號尤其恰當(見下文)。同樣，當替代氨基酸殘基的身份不重要時也可以使用原始氨基酸位置當原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸時，則僅指明位置，例如170。當原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸時，則在 括號中指出選擇的氨基酸融臺·■膽{#代氖細1，…·，#代腕細二 1對于具體變體，使用具體的三字母或一字母代碼，包括指示任意氨基酸殘基的代 碼Xaa禾口 X。替代谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名為Glyl95Glu 或 G195E或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名為Glyl95Xaa 或 G195X或Glyl95 或 G195因此，絲氨酸在第170位替代任意氨基酸殘基將命名為Xaal70Ser 或 X170S.或170Ser 或 170S關于同源枯草桿菌酶中的改變，該符號尤其適合(見下文)。因此170Ser意味著 包含例如BASBPN中的Lysl70Ser改變和BLSAVI中的Argl70Ser改變(參見圖1)。對于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸的改 變，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸在第170位替代精氨酸可以通過Argl70{Gly, Ala, Ser, Thr} 或 R170 {G，A，S，Τ}來表示，以指示變體R170G, R170A, R170S,和 R170T.缺失第195位甘氨酸的缺失將表示為Glyl95* 或 G195 *
相應地，一個以上氨基酸殘基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失將 表示為Glyl95*+Leul96* 或 G195 *+L196 *插入額外氨基酸殘基的插入，例如賴氨酸在G195位之后的插入表示為Glyl95GlyLys 或 G195GK ；或當插入不止一個氨基酸殘基時，例如在G195之后插入一個賴氨酸，丙氨酸和絲氨 酸時，這將表示為Glyl95GlyLysAlaSer 或 G195GKAS(SEQ ID NO :1)在這種情況下，通過在插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置數后加上小寫字母 來編號該插入的氨基酸殘基。上述例子中的第194-196位序列將因此被表示為194195196
BLSAVIA-G--L
194195195a 195b 195c 196
變體A-G--K-A--S-L (SEQ ID NO在插入與已有氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時，很顯然在命名中產生了簡并性。 例如在上述例子的甘氨酸之后插入一個甘氨酸，則表示為G195GG。而對于從194 195 196BLSAVI A-G-L到194 195 195a 196變體A-G-G-L(SEQ ID NO 27)194 194a 195 196的改變，實際上相同的變化同樣可以表示為A194AG。這些情況對于技術人員來說是顯而易見的，因此表示式G195GG和針對該類型插 入的相應表示式旨在包括這種等同簡并表示式。缺口填充當與用于編號的枯草桿菌蛋白酶BPN’序列進行的參照比較中，一個酶中存在缺失 時，在該位置的插入例如第36位的天冬氨酸插入表示為* 36Asp 或 * 36D多重修飾含有多重修飾的變體通過加號分開，例如Argl70Tyr+Glyl95Glu 或 R170Y+G195E表示在第170位和195位用酪氨酸和谷氨酸分別替代精氨酸和甘氨酸的修飾。因此，Tyrl67{Gly, Ala, Ser, Thr}+Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}表示以下變體Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala,Tyrl67Gly+Argl70Ser, Tyrl67Gly+Argl70Thr,Tyrl67Ala+Argl70Gly, Tyrl67Ala+Argl70Ala,Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl70Thr,
Tyrl67Ser+Argl70Gly, Tyrl67Ser+Argl70Ala,Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr,Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala,Tyrl67Thr+Argl70Ser，禾口 Tyrl67Thr+Argl70Thr當涉及到對具有特定共性的氨基酸殘基例如帶正電荷的殘基(K，R，H)，帶負 電荷的殘基(D，E)進行替代、替代、插入或缺失修飾時，或涉及到保守氨基酸修飾例如 Tyrl67 {Gly，Ala, Ser，Thr} +Arg 170 {Gly，Ala, Ser，Thr}時，這種命名原則尤其恰當。具體 參見“發明詳述”部分。蛋白酶裂解蛋白質底物中酰胺鍵的酶被歸為蛋白酶，或(可互換使用的)肽酶(參見 Walsh, 1979,酶反應原理(Enzymatic Reaction Mechanisms) ,W. H. Freeman and Company, San Francisco,第 3 章)。氨基酸位置/殘基的編號如沒有另外提及，本文所用的氨基酸編號對應于枯草桿菌酶BPN’ (BASBPN)序列的 編號。BPN，序列的進一步描述參見圖1和2，或Siezen等，Protein Engng. 4 (1991) 719-737。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點含有一個必需絲氨酸殘 基(White, Handler 和 Smith，1973 “生物化學原理(Principles of Biochemistry )”，第 五版，McGraw-Hill Book Company, NY，第 271-272 頁)。細菌絲氨酸蛋白酶具有20，000到45，000道爾頓的分子量。其被二異丙基氟磷酸 抑制。它們水解簡單末端酯并且在活性上相似于同樣是絲氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白 酶。更為狹窄的術語，堿性蛋白酶，其包括一個亞族，反映了一些絲氨酸蛋白酶的高最適PH 值，從 ρΗ9· 0 到 11. 0(綜述參見 Priest (1977) Bacteriological Rev. 41711-753)。枯草桿菌酶Siezen 等，Protein Engng. 4 (1991) 719-737 和 Siezen 等，蛋白質科學 (Protein Science) 6 (1997) 501-523提議將絲氨酸蛋白酶的一個亞族暫稱為枯草桿菌酶 (subtilase)。通過對170多個先前被稱作枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的氨 基酸序列同源分析，定義了這些酶。枯草桿菌蛋白酶以前常常被解釋為由革蘭氏陽性菌或 真菌產生的絲氨酸蛋白酶，而現在根據Siezen等人的提議其是枯草桿菌酶的一個亞族。各 種各樣的枯草桿菌酶已獲得鑒定，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已被測定。對于這些 枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更具體描述，參考Siezen等(1997)。枯草桿菌酶的一個亞族，I-Sl或“真”枯草桿菌蛋白酶，包含“經典的”枯草桿菌蛋 白酶，例如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)，枯草桿菌蛋白酶BPN’ (SEQ ID N0:38)，枯草桿菌 蛋白酶 Carlsberg (ALCALASE , NOVO NORDISK A/S)，以及枯草桿菌蛋白酶 DY(BSSDY)。Siezen等(上文)識別了枯草桿菌酶的另一個亞族，I_S2或高堿性枯草桿菌 蛋白酶。i-s2蛋白酶亞族被描述為高堿性枯草桿菌蛋白酶，其包括酶例如枯草桿菌蛋 白酶 pb92 (BAALKP) ( MAXACAL Gist-Brocades nv)，枯草桿菌蛋白酶 309 (seq id no 49) (SAVINASE , novo nordisk a/s)，枯草桿菌蛋白酶 147 (bls147) (ESPERASEf,N0V0N0RDISK A/S)，以及堿性彈性蛋白酶 YaB (BSEYAB)。
“SAVINASE ”SAVINASE8 由 NOVO NOrdisk A/S 銷售。其是來自遲緩芽孢桿菌(B. Lentus) 的枯草桿菌蛋白酶309，而且其僅在一個位置上不同于BAALKP(N87S，參見本文圖1)。 SAVINASEf具有在圖1中稱為b)的氨基酸序列并如SEQ ID NO 49所示。親本枯草桿菌酶術語“親本枯草桿菌酶”描述了一種根據Siezen等人(1991和1997)定義的枯 草桿菌酶。更詳細的參見剛才上面的“枯草桿菌酶”描述。親本枯草桿菌酶也可以是從 自然來源分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特性的同時，對其進行隨后的修飾。 此外，親本枯草桿菌酶還可以是通過如J.E.Ness等所述的(Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999)) DNA改組技術制備的枯草桿菌酶。或者，術語“親本枯草桿菌酶”可以被稱 為“野生型枯草桿菌酶”。枯草桿菌酶變體的修飾本文所用術語“修飾”被定義為包括枯草桿菌酶的化學修飾以及編碼枯草桿菌酶 的DNA的遺傳操作。修飾可以是在目的氨基酸中或處的氨基酸側鏈替代、氨基酸替代、缺失 和/或插入。枯草桿菌酶變體在本發明的上下文中，術語枯草桿菌酶變體和突變的枯草桿菌酶是指由表達突變 基因的生物體產生的枯草桿菌酶，該生物體來源于含有原始或親本基因并產生相應親本酶 的親本生物體，為了產生當在合適宿主中表達時生產所述突變枯草桿菌酶蛋白酶的突變基 因，對該親本基因進行了突變。同源枯草桿菌酶序列為了修飾以獲得本發明枯草桿菌酶變體，對SAVINASH 枯草桿菌酶的特異活性 位點環區和所述環中的氨基酸插入進行了鑒定。然而，本發明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而是擴展到與SAVINASEf具 有同源一級結構的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。兩個氨基酸序列之間的同源性在本發 明中用“一致性”參數來描述。為了確定兩個枯草桿菌酶的一致性程度，可以應用9. 1版本GCG軟件包的GAP程 序(下文)以及同上的設置參數。除了氨基酸比對外，該程序還輸出兩個序列之間的“一致 性百分數”計算結果。基于此描述，鑒定可以根據本發明進行修飾的合適同源枯草桿菌酶和相應的同源 活性位點環區，對于本領域的技術人員來說是常規的。分離的DNA序列術語“分離的”，當用于DNA序列分子時，表示該DNA序列已從其天然的遺傳環境中 分離出來，因此不含有其它無關或不需要的編碼序列，而且其形式適用于遺傳工程蛋白質 生產系統。該分離的分子是指那些從其自然環境中分離的分子，包括cDNA和基因組克隆。 本發明的分離DNA分子不含有通常與之相關的其它基因，但可以包括自然存在的5’和3’ 非翻譯區例如啟動子和終止子。相關區域的鑒定對于本領域的普通技術人員來說是容易的
10(參見例如，Dynan和Tiian,自然316 774~78,1985)。術語“分離的DNA序列”也可以被稱 作“克隆的DNA序列”。分離的蛋白質當應用于蛋白時，術語“分離的”是指該蛋白已從其天然環境中分離出來。在一種優選的形式中，分離的蛋白質相當大程度上不含有其它蛋白，特別是其它 同源蛋白質(即“同源雜質”(參見下述))。通過SDS-PAGE檢測，分離的蛋白質具有大于10%的純度，優選大于20%的純度， 更優選大于30%的純度。進一步優選提供高純度形式的蛋白質，即通過SDS-PAGE檢測，其 純度大于40%，大于60%，大于80%，更優選大于95%，甚至更優選大于99%的蛋白質。術語“分離的蛋白質”也可以被稱為“純化的蛋白質”。同源雜質術語“同源雜質”是指來源于最初從其中獲得本發明枯草桿菌酶的同源細胞的任 何雜質(例如非本發明枯草桿菌酶的另一種多肽)。^^與特定微生物來源相連的術語“獲自”，在本文中是指由該特定來源產生的，或由 其中插入了該來源基因的細胞產生的多核苷酸和/或枯草桿菌酶。Mll與蛋白酶底物相關的術語“底物”，應以其最廣泛形式解釋為包含含有至少一個易 受枯草桿菌酶水解的肽鍵的化合物。趙與蛋白酶酶解反應得到的產物相關的術語“產物”，在本發明的上下文中應解釋為 包括涉及枯草桿菌酶蛋白酶的水解反應的產物。產物可以是隨后水解反應中的底物。洗滌性能在本文中，術語“洗滌性能”用于指在例如清洗或硬表面清潔過程中酶從待清潔物 體上除去蛋漬的能力。也見本文實施例3中“模式洗滌劑洗滌性能測試”。性能因子術語“性能因子”用以下公式來定義P = Rvariant-Rparent其中，P是性能因子，Rvmiant是如“模式洗滌劑洗滌性能測試”中所述用枯草桿菌酶 變體處理后的測試材料的反射率(在460nm測定)，Rparent是如“模式洗滌劑洗滌性能測試” 中所述用相應親本枯草桿菌酶處理后的測試材料的反射率(在460nm測定)。更詳細的說 明見本文實施例3中的“模式洗滌劑洗滌性能測試”。殘留活性術語“殘留活性”按本文“蛋抑制分析”(見實施例4)中所述定義。附圖簡要說明圖ι顯示了使用上述GAP程序在枯草桿菌蛋白酶BPN’ (a)禾nSavinase (b)之 間進行的比對。發明詳述本發明人發現，其活性位點(b)環區長于目前已知的那些的枯草桿菌蛋白酶變體
11表現出關于除去蛋漬的改進的洗滌性能。我們在構建與其親本野生型酶相比在模式洗滌劑 組合物中表現出改進的洗滌性能(關于除去蛋漬)的枯草桿菌蛋白酶變體，尤其是枯草桿 菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase )的變體的過程中對此進行了鑒定。不為任何特定的理論所束縛，現在相信，改進的效果是由于阻礙了蛋清抑制劑在 枯草桿菌酶變體活性位點(b)環區的結合。這反過來又可能是因為在這個酶的該特定位點 的一個或多個額外氨基酸殘基的插入而導致活性位點(b)環區結構改變的緣故。因此，被認為適合本文所描述用途的變體是這樣的變體，其中，同野生型枯草桿菌 蛋白酶比較，在一個或多個下列位點中插入了一個或多個額外氨基酸殘基第95-96位之 間、第96-97位之間、第97-98位之間、第98-99位之間、第99-100位之間、第100-101位之 間、第101-102位之間、第102-103位之間、第103-104位之間，及其結合。優選的插入是在第97-98位之間、第98_99位之間、第99-100位之間和/或第 100-101位之間，特別是在第98-99位之間和在第99-100位之間進行。本發明第一個方面的枯草桿菌酶變體可以是從自然環境鑒定和分離的親本或野 生型枯草桿菌酶。這種親本野生型枯草桿菌酶可以通過本領域已知的標準技術來進行特異篩選。進行此篩選的一個優選方法是從多種不同微生物，優選不同的芽胞桿菌屬 (Bacillus)菌株，特異PCR擴增已知編碼枯草桿菌酶活性位點環的DNA區。從其DNA和氨基酸序列同源的意義上而言，枯草桿菌酶是一組保守酶。因此，在活 性位點環兩側構建相對特異的引物是可能的。進行此操作的一個方法是研究不同枯草桿菌酶之間的比對(參見，例如Siezen 等·蛋白質科學(Protein Science) 6 (1997) 501-523) 0從此常規工作，本領域技術人員即 可構建位于活性位點環兩側的PCR引物，其中所述活性位點環相應于I-Sl和I-S2族的任 意一個成員例如BLSAVI的第95到103位氨基酸殘基之間的活性位點環(b)。使用此引物 從大量不同微生物，優選不同芽胞桿菌菌株擴增DNA，之后對所述擴增PCR片段進行DNA測 序，這樣就可能鑒定出產生與例如BLSAVI相比含有更長活性位點區的這些組枯草桿菌酶 的菌株，其中所述活性位點區對應于從第95位至103位的活性位點環區。在鑒定了目的枯 草桿菌酶的菌株和部分DNA序列之后，完成枯草桿菌酶的克隆、表達和純化對于本領域技 術人員來說是常規工作。然而，可以設想本發明的枯草桿菌酶變體主要是親本枯草桿菌酶的變體。適合本文所述用途的枯草桿菌酶變體可通過本領域已知的標準技術來構建，例如 通過定點誘變/隨機誘變或通過不同枯草桿菌酶序列的DNA改組來構建。具體參見本文 的"材料和方法"部分(參見下文)。正如本領域技術人員所知，本發明所述的變體除在第95-103位之間的至少一個 插入以外，可以還含有至少一個進一步的修飾。例如，變體可能在活性位點(b)環區含有一 個或多個替代以及在此區以外含有一個或多個替代。而且，該變體可以在活性位點(b)環 區以外含有一個或多個進一步的插入。此外，在本文所述的區中的插入可以包括不止一個氨基酸殘基的插入。例如，根 據本發明的變體可以包含一個插入、兩個插入或兩個以上的插入，例如三個、四個或五個插 入。
在本發明的一個優選實施方案中，進一步的修飾在選自以下組的位置發生在第 99位的替代、在第133位的替代、在第143位的替代、在第167位的替代、在第170位的替代、 在第194位的替代、在第42-43位之間的插入、在第129-130位之間的插入、在第216-217 位之間的插入、在第217-218位之間的插入，及其組合。在本發明一個令人感興趣的實施方案中，額外氨基酸殘基被插入到第98-99位之 間(BASBPN編號)。在第98-99位之間的插入優選選自(使用BASBPN的編號方式)X98X {A, T, G, S}，例如，X98XA, X98XT, X98XG, X98XS ；X98X {D, E, K, R}，例如，X98XD, X98XE, X98XK, X98XR ；X98X {H, V, C, N, Q}，例如，X98XH, X98XV, X98XC, X98XN, X98XQ ；和X98X {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X98XF, X98XI, X98XL, X98XM, X98XP, X98XW, X98XY ； 優選 X98XA，X98XT, X98XG 或 X98XS ；或更為具體地對于枯草桿菌蛋白酶309和緊密相關的枯草桿菌酶例如BAALKP、 BLSUBL 和 BSKSMK 而言A98A {A, T，G，S}，例如，A98AA，A98AT, A98AG, A98AS ；A98A {D, E，K，R}，例如，A98AD, A98AE, A98AK, A98AR ；A98A {H，V，C，N，Q}，例如，A98AH，A98AV, A98AC, A98AN, A98AQ ；A98A{F, I，L，M，P, W, Y}，例如，A98AF, A98AI, A98AL, A98AM, A98AP, A98AW, A98AY ； 優選 A98AA，A98AT, A98AG 或 A98AS.此外，目前優選在第98-99之間的插入結合進一步的修飾，即在第133和143位的 氨基酸殘基替代，以及在第167、170和194位的氨基酸殘基替代。在(除了在第98-99之間的插入外)第133和134位的替代分別優選選自X133{A, Τ, G, S}，例如，X133A, X133T, X133G, X133S ；X133{D, Ε, K, R}，例如，X133D, X133E, X133K, X133R ；X133{H，V, C, N, Q}，例如，X133H, X133V, X133C, X133N, X133Q ；X133 {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X133F, X133I, X133L, X133M, X133P, X133W, X133Y ；X143{A, Τ, G, S}，例如，X143A, X143T, X143G, X143S ；X143{D, Ε, K, R}，例如，X143D, X143E, X143K, X143R ；X143{H，V, C, N, Q}，例如，X143H, X143V, X143C, X143N, X143Q ；和
X143 {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X143F, X143I, X143L, X143M, X143P, X143W, X143Y.在一個優選實施方案中，在第133位的替代選自X133{D，Ε, K，R}，優選X133D或 X133E，特別是 X133E。在另一個優選實施方案中，在第143位的替代選自乂143出』，1(，1 }，優選乂1431(或 X143R，特別是 X143K。一個優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體 X98XS+X133E+X143K。一個特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變體 A98AS+A133E+T143K。而且，在第167、170和134位的替代(除了在第98_99之間的插入外)分別優選
選自
X167{A, Τ, G, S}，例如，X167A, X167T, X167G, X167S ；X167{D, Ε, K, R}，例如，X167D, X167E, X167K, X167R ；X167{H，V, C, N, Q}，例如，X167H, X167V, X167C, X167N, X167Q ；X167 {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X167F, X167I, X167L, X167M, X167P, X167W, X167Y ；X170{A, Τ, G, S}，例如，X170A, X170T, X170G, X170S ；X170{D, Ε, K, R}，例如，X170D, X170E, X170K, X170R ；X170{H，V, C, N, Q}，例如，X170H, X170V, X170C, X170N, X170Q ；X170 {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X170F, X170I, X170L, X170M, X170P, X170W, X170Y ；X194{A, Τ, G, S}，例如，X194A, X194T, X194G, X194S ；X194{D, Ε, K, R}，例如，X194D, X194E, X194K, X194R ；X194{H，V, C, N, Q}，例如，X194H, X194V, X194C, X194N, X194Q ；禾口X194{F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X194F, X194I, X194L, X194M, X194P, X194W, X194Y.在一個優選實施方案中，在第167位的替代選自X167{A，Τ, G，S}，特別是X167A ； 在第170位的替代選自X170 {A，T，G，S}，特別是X170S ；且在第194位的替代選自X194 {F， I，L，M，P，W，Y}，特別是 X194P。一個優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體 X98XT+X167A+X170S+X194P。一個特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變 體A98AT+Y167A+R170S+A194P。在本發明另一個令人感興趣的實施方案中，額外氨基酸殘基被插入到第99-100 位之間(BASBPN編號)。在第99-100位之間的插入優選選自(使用BASBPN編號方式)X99X {A, T，G，S}，例如，X99XA, X99XT, X99XG, X99XS ；X99X {D, E，K，R}，例如，X99XD, X99XE, X99XK, X99XR ；X99X {H, V, C, N, Q}，例如，X99XH, X99XV, X99XC, X99XN, X99XQ ；禾口X99X {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X99XF, X99XI, X99XL, X99XM, X99XP, X99XW, X99XY ；優選 X99X {D，E，K，R}，特別是 X99XD 或 X99XE ；或更具體的，對于枯草桿菌蛋白酶309和緊密相關的枯草桿菌酶例如BAALKP、 BLSUBL 禾口 BSKSMK 而言S99S{A, Τ, G, S}，例如，S99SA, S99ST, S99SG, S99SS ；S99S{D, Ε, K, R}，例如，S99SD, S99SE, S99SK, S99SR ；S99S {H，V，C，N，Q}，例如，S99SH，S99SV, S99SC, S99SN, S99SQ ；S99S{F, I，L，M，P，W，Y}，例如，S99SF, S99SI, S99SL, S99SM, S99SP, S99SW, S99SY ； 優選 S99S {D, E, K, R}，特別是 S99SD 或 S99SE.關于在第99-100位之間的插入，在本發明的一個令人感興趣的實施方案中，優選 插入與第99位的替代相結合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第99位的 替代被認為是相關的X99 {A, T, G, S}，例如，X99A, X99T, X99G, X99S ；X99{D, Ε, K, R}，例如，X99D, X99E, X99K, X99R ；X99 {H, V, C, N, Q}，例如，X99H, X99V, X99C, X99N, X99Q ；禾口
X99{F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X99F, X99I, X99L, X99M, X99P, X99W, X99Y.在一個優選實施方案中，在第99位的替代選自X99{A，Τ, G，S}，特別是X99A或 X99T。一個優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體X99XD+X99A或 X99XR+X99T。一個特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變體S99SD+S99A 或 S99SR+S99T。關于在第99-100位之間的插入，在本發明的一個令人感興趣的實施方案中，優選 插入與第216-217位之間至少一個氨基酸殘基的進一步插入結合。因此，除了上面提到的 所期待的插入以外，下列在第216-217位之間的插入被認為是相關的X216X{A, T, G, S}，例如，X216XA, X216XT, X216XG, X216XS ；X216X{D, E, K, R}，例如，X216XD, X216XE, X216XK, X216XR ；X216X{H, V, C, N, Q}，例如，X216XH, X216XV, X216XC, X216XN, X216XQ ；禾口X216X{F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X216XF，X216XI, X216XL, X216XM, X216XP, X216XW, X216XY.在一個優選實例中，在第216-217位之間的插入選自X216X{F，I，L，M，P，W，Y}，特 別是 X216XP。優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體X99XD+X99A+X216XP 及X99XD+X99A+X216XDP。特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變體 S99SD+S99A+S216SP 及 S99SD+S99A+S216SDP。關于在第99-100位之間的插入，在本發明的另一個令人感興趣的實施方案中，優 選插入與第217-218位之間至少一個氨基酸殘基進一步的插入結合。因此，除了上面提到 的所期待的插入以外，下列在第217-218位之間的插入被認為是相關的X217X{A, T, G, S}，例如，X217XA, X217XT, X217XG, X217XS ；X217X{D, E, K, R}，例如，X217XD, X217XE, X217XK, X217XR ；X217X{H, V, C, N, Q}，例如，X217XH, X217XV, X217XC, X217XN, X217XQ ；禾口X217X{F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X217XF，X217XI, X217XL, X217XM, X217XP, X217XW, X217XY.在一個優選實施方案中，在第217-218位之間的插入選自X217X{F，I，L，M，P，W, 丫}，特別是乂217父卩。優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體X99XD+X99A+X217XP 及X99XD+X217XDP。特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變體 S99SD+S99A+L217LP 及 S99SD+L217P。關于在第99-100位之間的插入，在本發明的另一個令人感興趣的實施方案中，優 選插入與第42-43位之間至少一個氨基酸殘基進一步的插入結合。因此，除了上面提到的 所期待的插入以外，下列在第42-43位之間的插入被認為是相關的X42X {A, T，G，S}，例如，X42XA, X42XT, X42XG, X42XS ；X42X {D, E，K，R}，例如，X42XD, X42XE, X42XK, X42XR ；X42X {H, V, C, N, Q}，例如，X42XH, X42XV, X42XC, X42XN, X42XQ ；禾口X42X {F, I，L，M，P, W, Y}，例如，X42XF, X42XI, X42XL, X42XM, X42XP, X42XW, X42XY.
在一個優選實施方案中，在第42-43位之間的插入選自X42X{H，V，C，N，Q}，特別是 X42XN。優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體X99XD+X42XN及 X99XD+X99A+X42XN。特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE 變體 S99SD+L42LN及 S99SD+S99A+L42LN。關于在第99-100位之間的插入，在本發明的另一個令人感興趣的實施方案中，優 選插入與第129-130位之間至少一個氨基酸殘基進一步的插入結合。因此，除了上面提到 的所期待的插入以外，下列在第129-130位之間的插入被認為是相關的X129X{A, T, G, S}，例如，X129XA, X129XT, X129XG, X129XS ；X129X{D, E, K, R}，例如，X129XD, X129XE, X129XK, X129XR ；X129X{H, V, C, N, Q}，例如，X129XH, X129XV, X129XC, X129XN, X129XQ ；禾口X129X {F, I，L，M，P，W，Y}，例如，X129XF, X129XI，X129XL, X129XM, X129XP, X129XW, X129XY.在一個優選實施方案中，在第129-130位之間的插入選自X129X{D，E，K，R}。優選變體的例子是含有以下插入和替代的枯草桿菌酶變體X99XD+X129XD及
X99XD+X99A+X129XD。特定的優選變體是含有以下插入和替代的SAVINASE； 變體 S99SD+P129PD 及 S99SD+S99A+P129PD。正如本領域所熟知的，所謂一個氨基酸殘基對一個相似氨基酸殘基的保守替代應 該對酶的特性僅產生微小的改變。下面表I列出了多組保守氨基酸替代共有性質 堿性(帶正電荷)
酸性(帶負電荷)
極性
疏水性
保守氨基酸替代 氨基酸
權利要求
枯草桿菌酶變體在從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬中的應用，此枯草桿菌酶變體在第95 103位(BASBPN編號)活性位點(b)環區含有至少一個額外氨基酸殘基。
2.根據權利要求1的應用，其中額外氨基酸殘基被插入在選自以下組的位置中在第 95和96位之間，在第96和97位之間，在第97和98位之間，在第98和99位之間，在第99 和100位之間，在第100和101位之間，在第101和102位之間，在第102和103位之間，在 第103和104位之間，及其組合。
3.根據權利要求2的應用，其中額外氨基酸殘基被插入在選自以下組的位置中在第 98和99位之間，在第99和100位之間。
4.根據權利要求1-3之任意一項的應用，其中變體_在本文實施例4公開的“蛋抑制 分析”中測試時-具有至少10%，例如至少15%，優選至少20%，更優選至少25%的殘留活 性。
5.根據權利要求1-4之任意一項的應用，其中第98和99位之間的插入選自X98XA、 X98XT、X98XG 及 X98XS。
6.根據權利要求1-4之任意一項的應用，其中第99和100位之間的插入選自X99XD、 X99XE、X99XK 及 X99XR。
7.根據前述權利要求之任意一項的應用，其中變體含有至少一個進一步的修飾。
8.根據權利要求7的應用，其中進一步的修飾在選自以下組的位置進行在第99位的 替代，在第133位的替代，在第143位的替代，在第167位的替代，在第170位的替代，在第 194位的替代，在第42和43位之間的插入，在第129和130位之間的插入，在第216和217 位之間的插入，在第217和218位之間的插入，及其組合。
9.根據權利要求8的應用，其中所述變體選自在第98和99位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第133和第143 位含有替代的變體，在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第99含有替代 的變體，在第98和99位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第167位、第170 位和第194位含有替代的變體，在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第216和217 位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體，在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第217和218 位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體，在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第42和43位 之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體，和在第99和100位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入并進一步在第129和130 位之間含有至少一個額外氨基酸殘基的插入的變體。
10.根據前述權利要求之任意一項的應用，其中親本枯草桿菌酶屬于I-Sl亞族。
11.根據權利要求10的應用，其中親本枯草桿菌酶選自BSS168、BASBPN、BSSDY及 BLSCAR，或其保留有I-Sl亞族特性的功能性變體。
12.根據權利要求1-9之任意一項的應用，其中親本枯草桿菌酶屬于I-S2亞族。
13.根據權利要求12的應用，其中親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLSAVI、BAPB92、 TVTHER及BYSYAB，或其保留有I_S2亞族特性的功能性變體。
14.根據權利要求13的應用，其中親本枯草桿菌酶為BLSAVI(SEQID NO 1)。
15.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99A。
16.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SR+S99T。
17.根據權利要求14的應用，其中變體為A98AS+A133E+T143K。
18.根據權利要求14的應用，其中變體為A98AT+Y167A+R170S+A194P。
19.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99A+P129PD。
20.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99A+S216SP。
21.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99A+S216SDP。
22.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99SA+L217LP。
23.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+L42LN。
24.根據權利要求14的應用，其中變體為S99SD+S99A+L42LN。
25.枯草桿菌酶變體，其選自在活性位點(b)環中含有相當于第98-99位之間至少一個額外氨基酸殘基插入的至少 一個額外氨基酸殘基，并進一步含有至少一個額外的修飾的變體(BASBPN編號)，和在活性位點(b)環中含有相當于第99-100位之間至少一個額外氨基酸殘基插入的至 少一個額外氨基酸殘基，并進一步含有至少一個額外的修飾的變體(BASBPN編號)，其中變體_在本文實施例4公開的“蛋抑制分析”中測試時_具有至少10%的殘留活性。
26.根據權利要求25的變體，其中變體具有至少15%，優選至少20%，更優選至少 25%的殘留活性。
27.根據權利要求25和26的變體，其具有權利要求9-24之任意一項中所定義的特征。
28.權利要求9-24之任意一項中所定義的枯草桿菌酶變體。
29.編碼權利要求25-28之任意一項中所定義的枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。
30.含有權利要求29的分離DNA序列的表達載體。
31.轉化了權利要求30的表達載體的微生物宿主細胞。
32.根據權利要求31的微生物宿主細胞，其是細菌，優選芽孢桿菌屬細菌，特別是遲緩 芽孢桿菌。
33.根據權利要求31的微生物宿主細胞，其是真菌或酵母，優選絲狀真菌，特別是曲霉jM ο
34.制備權利要求25-27之任意一項的枯草桿菌酶變體的方法，其中在利于所述變體 表達和分泌的條件下培養權利要求31-33之任意一項的宿主，并回收該變體。
35.清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣或洗碗組合物，含有權利要求25-28之任意一項的 變體。
36.根據權利要求35的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質酶、氧化還原酶、其它 蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
37.權利要求25-28之任意一項所定義的變體在清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣或洗 碗組合物中的應用。
38.從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬的方法，此方法包括將含蛋漬的硬表面或含蛋漬 的衣物與含有枯草桿菌酶變體的清潔或洗滌劑組合物、優選洗衣或洗碗組合物接觸，此枯 草桿菌酶變體在第95-103位(BASBPN編號)活性位點(b)環區包含至少一個額外氨基酸殘基。
39.根據權利要求38的方法，其中變體具有權利要求2-24之任意一項中所定義的特征。
40.根據權利要求38-39之任意一項的方法，其中組合物還含有纖維素酶、脂肪酶、角 質酶、氧化還原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
41.包含枯草桿菌酶變體的清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣或洗碗組合物在從待洗衣 物或硬表面除去蛋漬中的應用，其中所述枯草桿菌酶變體在第95-103位(BASBPN編號)活 性位點(b)環區中含有至少一個額外氨基酸殘基。
42.根據權利要求41的應用，其中變體具有權利要求2-24之任意一項中所定義的特征。
43.根據權利要求41-42之任意一項的應用，其中組合物還含有纖維素酶、脂肪酶、角 質酶、氧化還原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
全文摘要
本發明涉及枯草桿菌酶變體在從待洗衣物或從硬表面除去蛋漬中的應用，此枯草桿菌酶變體在第95-103位(BASBPN編號)活性位點(b)環區含有至少一個額外氨基酸殘基。在用于例如包括自動洗碗組合物等清潔或洗滌劑組合物時，這些枯草桿菌酶變體有用，表現出對蛋漬優異的或改進的洗滌性能。本發明也涉及新的枯草桿菌酶變體，編碼此變體的分離DNA序列，表達載體，宿主細胞及生產和利用本發明變體的方法。本發明還涉及含有本發明變體的清潔和洗滌劑組合物。
文檔編號C12N9/54GK101974375SQ201010509930
公開日2011年2月16日 申請日期2000年12月1日 優先權日1999年12月15日
發明者F·F·邁克爾森, T·S·法諾 申請人:諾沃奇梅茲有限公司