魚翅實時熒光pcr鑒別的引物及探針、試劑盒和方法

專利名稱：魚翅實時熒光pcr鑒別的引物及探針、試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及用于魚翅真偽鑒別的寡核苷酸引物及探針，包含本發明的寡核苷酸引物及探針的試劑盒，用于鑒別魚翅真偽的實時熒光 PCR檢測方法，以及所述特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在鑒別魚翅真偽中的應用。
背景技術：
魚翅為中國的傳統高檔食品，列為八珍之一，有「鮑、參、翅、肚」之稱，消費量逐年 提高。中國最遲自宋代就有食用魚翅記載。《宋會要》有關于福建從海外輸入魚翅的記述。 到明代，食用已較廣泛，《潛確類書》、《本草綱目》等書均有記載。魚翅主要是鯊魚鰭中的細 絲狀軟骨，其成分主要為膠原蛋白，此外還含有少量的脂肪、鈣、磷、鐵和維生素，民間認為 魚翅具有滋補健身作用。由于制作魚翅的鯊魚種類較多，所用魚鰭的大小不一致，長的超過1米，小的約10 公分，而且來源部位及形狀差異很大，加之產地與分類習慣的差別等原因，魚翅的名稱很不 一致，而且至今沒有通用的分類方法。例如按加工過程和成品形態，可分為生翅、明翅、翅 筋和翅餅。按來源于鯊魚不同部位，可分為小脊翅、脊翅(背鰭)、勾翅(尾鰭)及翅片(胸 鰭)，其中脊翅、勾翅兩面顏色相近，脊翅的翅筋較短；翅片則多呈長形，兩面顏色不同。此 夕卜，也以來源于不同鯊魚種類分為群翅(犁頭鰩)、天九翅(姥鯊)、海虎翅(虎鯊)以及牙 揀翅(青鯊、鼠鯊和各種真鯊等)。由于天然魚翅受資源的限制，價格昂貴，而隨著人們生活水平的提高，對天然魚翅 的消費量卻越來越大。有關科研和水產加工部門在本世紀初開始了仿真魚翅加工工藝的研 究，選用海藻酸鈉、明膠為主原料，氯化鈣等為凝固劑，研制出了仿真魚翅。仿真魚翅在外觀 和口感方面與天然魚翅非常相似，且價格低廉，采用魚明膠為主原料生產的人造魚翅，與真 魚翅在味道上也很接近，因為魚翅本身除了腥味外沒有其它味道，食用時依靠湯料出味，所 以一般人難辨真偽。近年來，國內市場出現大量以仿真魚翅冒充真魚翅的行為，損害了消費 者的權益，擾亂了市場秩序。面對混亂的魚翅市場，由于目前魚翅產品缺乏相關標準、規范，給執法造成一定難 度，許多不法企業鉆空子牟利。經查閱國內外文獻，到目前為止，未見有成熟的魚翅真偽鑒 別的方法。當前主要依靠個人經驗，通過眼看、手摸、口嘗等感官方法進行魚翅的真偽鑒別。目前，國內外少見報道能快速、簡單、特異且靈敏地檢測魚翅的方法。因此，本領域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的魚翅的真偽鑒別方法，進行魚 翅真偽的鑒別。

發明內容
本發明的一個目的在于，提供用于快速鑒別魚翅真偽的特異性寡核苷酸引物及探 針。本發明的另一個目的在于，提供用于快速鑒別魚翅真偽的實時熒光PCR檢測方法。本發明的再一 個目的在于，提供用于快速鑒別魚翅真偽的試劑盒。
本發明的再一個目的在于，提供本發明的特異性寡核苷酸引物和探針在鑒別魚翅 真偽中的應用。針對上述發明目的，本發明提供以下技術方案根據本發明的一個實施方案，本發明提供用于PCR方法鑒別魚翅真偽的特異性寡 核苷酸引物對和探針。本發明的寡核苷酸引物對和探針是根據不同鯊魚綱和硬骨魚類的 線粒體16s rDNA序列具有差異性的特點而設計的。在一個實施方案中，所述引物對由上 游引物和下游引物組成，所述上游引物為Cartil-Fll :GACCTGTATGAAAGGCACCACGAGAG(SEQ IDNo. 1)，所述下游引物為 Cartil-Rll :CCCTTGGTCACCCCAACCAAA(SEQID No. 2)；所述探針 為 Cartil-Pl :CGAGAAGACCCTATGGAGCTTCAAACAC(SEQ ID No. 3)，在探針的 3，端連接有一個 熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團HEX。使用本發明的引物對和探針的組 合，在樣品量極少的情況下，相對于其他引物對仍能特異、靈敏地擴增出目的片段。根據本發明的另一個實施方案，本發明提供鑒別魚翅真偽的實時熒光PCR檢測方 法，所述方法包括使用針對魚翅的特異性寡核苷酸引物對和探針，所述引物對是根據不同 鯊魚綱和硬骨魚類的線粒體16s rDNA序列具有差異性的特點而設計的。在一個實施方案 中，在本發明的魚翅真偽鑒別的實時熒光PCR檢測方法中，所使用的特異性寡核苷酸引物 對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的 堿基序列為SEQ ID No. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個 熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團HEX。本發明的發明人通過大量的篩選 工作確定了本發明的特異性寡核苷酸引物對和探針，并建立了穩定的PCR體系，從而特異 且靈敏地鑒別魚翅的真偽。在一個實施方案中，本發明的鑒別魚翅真偽的實時熒光PCR檢測方法還進一步包 括提取魚翅樣品總DNA的步驟。在一個實施方案中，在所述DNA提取步驟中，通過檢測脊椎 動物線粒體16S rDNA序列，來測試樣品總DNA的提取質量。在一個優選的實施方案中，檢 測線粒體16S rDNA序列的通用引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序 列為M16S-F :GGTTTACGACCTCGATGTTGG(SEQ ID No. 4)，所述下游引物的堿基序列為M16S-R CGGTCTGAACTCAGATCACGTAG(SEQ ID No. 5)；所述探針的堿基序列為M16S-P :CGTTGAACAAACG AACCCTTAATARCGG(SEQ ID No. 6)，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連 接有一個熒光報告基團FAM。所述PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin，40個 循環。根據本發明的另一個實施方案，本發明提供用于快速鑒別魚翅真偽的試劑盒，所 述試劑盒包括本發明的用于實時熒光PCR方法鑒別魚翅真偽的特異性寡核苷酸引物對以 及探針和使用說明書。在本發明的試劑盒的優選實施方案中，本發明的特異性寡核苷酸引 物對是根據不同鯊魚綱和硬骨魚類的線粒體16s rDNA序列具有差異性的特點而設計的。 在一個優選的實施方案中，所述試劑盒中包含的特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游 引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2;所述試劑盒中包含的探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個熒光 淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團HEX。在優選的實施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應的試劑。在一個優選的實施方案中，所述試劑 盒的使用說明書中包括對用于快速鑒別魚翅真偽的PCR擴增的條件的描述。在一個優選的 實施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C, Imin, 40個循環。根據本發明的再一個實施方案，本發明提供本發明的特異性寡核苷酸引物對和探 針在鑒別魚翅真偽中的應用。在根據本發明的應用的優選實施方案中，所述特異性寡核苷 酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游 引物的堿基序列為SEQ IDNo. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接 有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團HEX。在另一個實施方案中，本 發明還提供本發明的試劑盒在鑒別魚翅真偽和區分不同種類魚翅中的應用。優選地，在本 發明的上 述應用中，所述試劑盒包括本發明的特異性寡核苷酸弓I物對和探針。本發明以魚翅的DNA為檢測基礎，根據鯊魚綱和硬骨魚類的線粒體16S rDNA序 列，克隆了鯊魚線粒體16S rDNA部分序列，根據這些序列設計引物及探針，利用實時熒光 PCR法鑒別魚翅的真偽。實時熒光定量PCR即在常規PCR方法的基礎上，加入熒光標記的探針或者熒光染 料，隨著PCR產物的積累，探針或染料發出的熒光信號增強，而熒光監測系統可接收到熒光 信號，即每產生一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形 成完全同步。因此可以實時監控整個PCR反應過程，并最終檢測出待測樣品的初始拷貝數， 從而可檢測待測魚翅成分。本發明的實時熒光PCR檢測方法采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉 污染和假陽性。本發明的方法巧妙地運用了 PCR技術的DNA高效擴增、核酸雜交的特異性和 熒光檢測技術的快速和敏感性，具有操作簡單、省時省力、結果可靠和準確靈敏等優點。使 用本發明的實時熒光PCR檢測方法，其簡單、快速、特異且靈敏的特點適合用于國內外市場 上魚翅成分真偽的鑒別。


圖1是顯示待測樣品DNA提取效果的實時熒光PCR結果，其中使用脊椎動物通用 引物對SEQ ID No.4和SEQ ID No. 5及探針SEQ ID No. 6檢測，其中熒光曲線依次為1.大 青鯊；2.尖吻斜鋸牙鯊；3.澳洲半沙條鯊；4.舒氏星鯊；5.鼠鯊；6.加勒比斜鋸牙鯊；7.尖 吻鯖鯊；8.兔銀鮫；9.葉吻銀鮫；10.平魚；11.龍俐魚；12.鯧魚；13.鱈魚；14.偏口魚； 15.紅綢魚；16.黃花魚；17.草魚；18.空白對照(ddH20)，空白對照的熒光曲線在基線位 置。圖2是顯示實時熒光PCR特異性檢測鯊魚的結果，其中使用特異性寡核苷酸引物 對SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2及探針SEQ ID No. 3檢測，其中熒光曲線依次為1.大青鯊； 2.尖吻斜鋸牙鯊；3.澳洲半沙條鯊；4.舒氏星鯊；5.鼠鯊；6.加勒比斜鋸牙鯊；7.尖吻鯖 鯊；8.兔銀鮫；9.葉吻銀鮫；10.平魚；11.龍俐魚；12.鯧魚；13.鱈魚；14.偏口魚；15.紅 綢魚；16.黃花魚；17.草魚；18.空白對照(ddH20)。圖3是以魚翅為例，檢測魚翅特異性引物和探針組合的靈敏度的結果，其中1-7 為進行實時熒光PCR擴增的DNA溶液的濃度，依次為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/yLUpg/uL.O. lpg/μ L以及空白對照。圖4是以大青鯊、草魚為例，確定鯊魚特異性引物和探針組合的相對檢測限，其中 1-6為用草魚DNA將魚翅DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中魚翅DNA含量分別為10ng、 lng、lOOpg、10pg、lpg,然后進行檢測的結果。圖5是市售魚翅樣品檢測結果，其中熒光曲線依次為1.大青鯊(陽性對照 )；2.翅 片1 ；3.翅片2 ；4.翅片3 ；5.排翅1 ；6.排翅2 ；7.排翅3 ；8.勾翅1 ；9.勾翅2 ；10.勾翅 3 ；11.空白對照(ddH20)。
具體實施例方式通過實施例的方式對本發明作進一步的說明，但是本發明并不僅僅局限于以下實 施例。實施例1本發明的發明人首次通過PCR克隆并測序了鯊魚線粒體16S rDNA部分序列。本實施例為通過PCR克隆測序獲得的鯊魚線粒體16S rDNA部分序列。根據線粒體16S rDNA序列在不同鯊魚綱和硬骨魚類中具有差異性的特點，設計上 下游引物擴增星鯊。按照Wizard Gel Extraction Kit (Promega，美國)的操作說明對星 鯊PCR產物進行純化、回收。按TaKaRa pMD19-TVector試劑盒(TaKaRa，日本)的說明書將 純化產物與PMD19-T Vector連接，連接體系10 μ L，其反應組分為pMD19_T Vector 1 μ L、 PCR產物2 PLddH2O 2yL,Solution I 5 μ L，同時設置陽性和陰性對照。將連接體系置于 室溫(22-37°C)反應30min，反應結束后，立即置于冰上。加連接產物于50 μ LTOP感受態 細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42°C準確熱激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已 滅過菌的腦心浸液，37°C、200r/min振蕩培養lh。5000r/min低速離心lmin，棄600yL上 清，將沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG處理的營養瓊脂平板上，37°C過 夜培養后置于4°C冰箱中4h。挑取單菌落白斑，在含有終濃度200μ g/mL的Amp的腦心浸 液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養。(1)陽性克隆鑒定挑取單個白色克隆，進行菌落PCR反應，體系為25yL，其組份 為反應IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取單菌 落作為模板，加水補至25 μ L。反應程序為94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40個 循環。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(2)測序確定陽性克隆后，挑取該菌落，在含有終濃度200 μ g/mL Amp的5 μ L腦 心浸液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養。取ImL菌液送生物公司進行測序鑒定。PCR克隆測序得到的星鯊線粒體16S rDNA部分序列如下TCCCGCCTGCCCTGTGACAATGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCGTAATCATTT GTCTTTTAAATGAAGACCCGTATGAAAGGCACCACGAGAGTTTAACTGTCTCTATTTTCTAATCAATGAAATTGATC TATTCGTGCAGAAGCGAATATAATAACATTAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAAACACTTAAGTTAATTATGTA ACCATTTATTCCTCAGGGTATAAACAAAATATATAATACTTCTAACTTAACTGTTTTTGGTTGGGGTGACCGAGGGG GAAA-ACAAATCCCCCTCATCGATTGAGTACTCAGTAAAATCCTCAGCCTAAACTAGTTTTGGTAGCTTAACTTAAA AGCGTCGACCTTGTAAGTCGAAGATCGAGGGTTTAAACCCCTTCCAAAACACATCAGGGGAAGGAGGGTTAAACTCC TGCCCTTGGCTCCCAAAGCCAAGATTCTGCCTAAACTGCCCCCTGATAGCTG(SEQID No. 7)。
實施例2本實施例為通過使用鯊魚綱和硬骨魚類通用引物對及探針測試樣品總DNA的提
取質量。通過檢測線粒體16S rDNA序列，可以測試樣品總DNA的提取質量。Taqman熒光 探針法=TaqMan技術是一種對單管PCR產物進行實時熒光定量檢測的技術，在普通PCR擴 增系統中，加入一個與靶基因序列特異互補的雙熒光標記探針，利用熒光信號積累實時監 測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。定量步驟①確定CT值(C 表示循環數(Cycle)，T表示熒光域值(Threshold)，即每個反應管內的熒光信號到達設定 的域值時所經歷的循環數；②利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。獲得未知樣品的CT 值后，從標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數。每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的 對數存在線性關系，即起始拷貝數越多，CT值越小。反應體系為Mastermix 12.5yL;探 針(10 μ Μ) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；力口 ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 個循環。本實施例中所使用的用于檢測鯊魚綱和硬骨魚類的通用引物對由上游引物和下 游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 4，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 5 ；所使用的探針的堿基序列為SEQ IDNo. 6，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團 TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。在本實施例中，檢測了 17份樣本大青鯊、尖吻斜鋸牙鯊、澳洲半沙條鯊、舒氏星 鯊、鼠鯊、加勒比斜鋸牙鯊、尖吻鯖鯊、兔銀鮫、葉吻銀鮫、平魚、龍俐魚、鯧魚、鱈魚、偏口魚、 紅綢魚、草魚、黃花魚。所使用的檢測主要儀器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等檢測主要試劑氯仿、異丙醇分別購于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配制；Fast Start Universal Probe Master Mix(Rox)購 于羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取待測樣品為大青鯊、尖吻斜鋸牙鯊、澳洲半沙條鯊、舒氏星鯊、鼠鯊、加勒比斜鋸 牙鯊、尖吻鯖鯊、兔銀鮫、葉吻銀鮫、平魚、龍俐魚、鯧魚、鱈魚、偏口魚、紅綢魚、草魚、黃花
佳.ο稱取0. Ig磨碎的樣品粉末至一潔凈2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液， 650C 2h，間期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只潔凈2. OmL離心管中，力口 入700 μ L氯仿，劇烈混勻30s，14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2. OmL離心管 中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加 入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s，再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s，14500rpm IOmin ；分別取上清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻后，"200C lh, 14500rpm 20min,棄上清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，棄上清液，晾至風干，加入IOOyL ddH20溶解，4 °C儲存備用。2實時熒光PCR檢測所用引物和探針引物序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5，探針序列為SEQ ID No. 6，3，端連接有 一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM3實時熒光PCR反應體系Fast Start Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μ Μ) 0. 5 μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配制反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到污染)；4實時熒光PCR反應參數95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40個循環。注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數做適當調整。如圖1所示，用鯊魚綱和硬骨魚類通用引物擴增待測樣品的DNA時均能在基線以 上出現熒光擴增曲線，表明所有待測樣品DNA提取成功。實施例3本實施例為通過如下試驗對鯊魚的引物對和探針進行了特異性和靈敏度驗證。通過檢測線粒體16S rDNA序列，可以確定鯊魚引物和探針組合的特異性和 檢測靈敏度。反應體系為Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5yL;探針 (10μΜ)0· 5μ L ；上、下游引物(10 μ Μ)各0.5yL;模板DNA 5 μ L ；加ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C Imin, 40 個循環。所使用的檢測魚翅的引物及探針序列為引物序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探針序列為SEQ ID No. 3，3，端連接有 一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團HEX。使用本發明的引物對和探針的組合，在樣品量極少的情況下，相對于其他引物對 仍能特異、靈敏地擴增出目的片段。所使用的檢測主要儀器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等檢測主要試劑
氯仿、異丙醇分別購于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB， 0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購于 羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取檢測樣本(1)大青鯊、尖吻斜鋸牙鯊、澳洲半沙條鯊、舒氏星鯊、鼠鯊、加勒比斜 鋸牙鯊、尖吻鯖鯊、兔銀鮫、葉吻銀鮫、平魚、龍俐魚、鯧魚、鱈魚、偏口魚、紅綢魚、草魚、黃 花魚等樣品用于特異性分析；(2)以大青鯊為例，將提取的DNA溶液用無菌水分別稀釋為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的濃度，用于分析引物和探 針組合的絕對檢測限；(3)以大青鯊、草魚為例，用大青鯊DNA將草魚DNA以10倍稀釋，使 其PCR反應體系中大青鯊DNA含量分別為10ng、lng、100pg、10pg、lpg,以確定鯊魚特異性引 物和探針組合的相對檢測限。稱取0. Ig磨碎的樣品粉末至一潔凈2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液， 650C 2h，間期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只潔凈2. OmL離心管中，力口 入700 μ L氯仿，劇烈混勻30s，14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2. OmL離心管 中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加 入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s，再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s，14500rpm IOmin ； 分別取上清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻后，-200C lh, 14500rpm 20min,棄上 清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，棄上清液，晾至風干，加入IOOyL ddH20溶解，4 °C儲存備用。2實時熒光PCR檢測所用引物和探針引物序列為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探針序列為SEQ ID No. 3，3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個 熒光報告基團HEX。3實時熒光PCR反應體系Fast Start Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配制反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到污染)；4實時熒光PCR反應參數95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40個循環。
注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數做適當調整。如圖2所示，利用實時熒光PCR特異性檢測鯊魚的線粒體16s DNA序列時，7種 鯊魚樣品等均出現典型的擴增曲線，而其它樣品兔銀鮫、葉吻銀鮫、平魚、龍俐魚、鯧魚、鱈 魚、偏口魚、紅綢魚、草魚、黃花魚等及空白對照(ddH20)均未出現擴增曲線，充分說明本實 驗設計的引物和探針對鯊魚樣品表現較好的特異性。為確定鯊魚特異性引物和探針組合的絕對檢測限，以大青鯊為例，將提取的DNA 溶液用無菌水分別稀釋為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結果如圖3所示。鯊魚DNA濃度為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L時有特異性擴增曲線，而濃度降至lpg/ μ L以 下時， 無特異性擴增曲線出現。實驗結果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出鯊魚 成分的含量為lpg/yL。以大青鯊、草魚為例，用草魚DNA將大青鯊DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中 大青鯊DNA含量分別為10ng、lng、100pg、10pg、lpg,分別按上述條件進行實時熒光PCR擴 增，以確定鯊魚特異性引物和探針組合的相對檢測限(結果見圖4)。實驗結果說明該方法 檢測鯊魚成分的相對檢測限非常低，為10pg。實施例4本發明的發明人通過如下試驗對市售魚翅樣品進行了驗證。選取9份魚翅樣品(取樣于廣州海鮮市場)，其中翅片3份、排翅3份、勾翅3份， 進行實時熒光PCR反應，以確定所建立的實時熒光PCR方法是否具有可行性。如圖5所示，利用實時熒光PCR檢測線粒體16s DNA序列時，大青鯊(陽性對照)、 9份魚翅樣品均在基線以上具有典型的熒光擴增曲線，空白對照擴增曲線均在基線位置，表 明該方法能有效檢測出魚翅成分。雖然已經對本發明的具體實施方案進行了描述，但是本領域技術人員應認識到， 在不偏離本發明的范圍或精神的前提下可以對本發明進行多種改變與修飾。因而，本發明 意欲涵蓋落在權利要求書及其同等物范圍內的所有這些改變與修飾。
權利要求
核酸，其堿基序列如SEQ ID No.7所示。
2.用于實時熒光PCR方法鑒別魚翅真偽的特異性寡核苷酸引物對及探針，所述引物對 和探針基于權利要求1所述的核酸設計，其中所述引物對由上游引物和下游引物組成，所 述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2，所述探 針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有 一個熒光報告基團HEX。
3.用于實時熒光PCR方法鑒別魚翅真偽的試劑盒，所述試劑盒包括根據權利要求2所 述的特異性寡核苷酸引物對及探針。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包含另外的通用引物對和探針， 所述另外的通用引物對由堿基序列為SEQ ID No. 4的上游引物和堿基序列為SEQ ID No. 5 的下游引物組成，所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅 基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。
5.魚翅真偽鑒別的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括使用權利要求2所述的特異 性寡核苷酸引物對及探針或權利要求3所述的試劑盒。
6.根據權利要求5所述的實時熒光PCR檢測方法，還進一步包括提取魚翅樣品總DNA 的步驟。
7.根據權利要求6所述的實時熒光PCR檢測方法，通過使用通用引物對及探針檢測樣 品DNA的提取質量，所述通用引物由堿基序列為SEQ ID No. 4的上游引物和堿基序列為SEQ ID No. 5的下游引物組成，所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一個 熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。
8.根據權利要求1所述的核酸在鑒別魚翅真偽中的應用。
9.權利要求2所述的特異性寡核苷酸引物對及探針在鑒別魚翅真偽中的應用。
10.權利要求3或4所述的試劑盒在鑒別魚翅真偽中的應用。
全文摘要
本發明涉及用于魚翅真偽鑒別的寡核苷酸引物及探針。本發明還涉及用于魚翅真偽鑒別的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括使用本發明的特異性寡核苷酸引物及探針。本發明還涉及用于魚翅真偽鑒別的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發明的特異性寡核苷酸引物和探針。本發明還涉及本發明的特異性寡核苷酸引物及探針在鑒別魚翅真偽中的應用。使用本發明的PCR檢測方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地鑒別魚翅的真偽。
文檔編號C12N15/11GK101974523SQ201010555570
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者鄧婷婷, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院