專利名稱：一種利用微藻生產葉黃素的方法
技術領域：
本發明屬于微藻生物技術領域，涉及一種微藻培養生產葉黃素的方法。
背景技術：
葉黃素(Lutein)又名“植物黃體素”，是廣泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物和藻 類中的一種天然活性物質。因其對人體具有保護視力、延緩動脈硬化、抗癌、抗氧化、保護皮 膚等多個重要生理功效，所以葉黃素目前廣泛作為食品和飼料添加劑，同時葉黃素鮮亮的 橙黃色使其作為家禽畜、水產養殖動物和動物組織的增色劑。葉黃素在醫藥和保健品、食品和飼料、化妝品及水產養殖行業等方面廣泛的應用 前景，使許多國內外研究機構和公司對葉黃素的生物合成、分離提取、生理生化功能等進行 研究。目前，葉黃素主要從萬壽菊、金盞花等植物中提取獲得，但是利用這些植物生產葉黃 素存在著某些缺點。首先，葉黃素在這些植物中主要是酯化形式存在，因此從萬壽菊、金盞 花等植物中提取葉黃素時需要進行皂化處理，該步驟不但降低了效率和收率，同時殘余的 皂化劑容易污染葉黃素產品，給純化過程增加了難度。其次，種植萬壽菊、金盞花等植物需 要大量的土地，這些植物的生長周期一般為3 4個月(相對于可快速生長的微藻而言，周 期太長)。相比較而言，利用微藻來生產葉黃素具有某些優勢。首先葉黃素在微藻中主要是 以游離的形式存在，因此在生產過程中不需要皂化步驟；其次，微藻的生長周期短、生產設 備占地面積小，同時利用微藻生產葉黃素不受季節、氣候及地域條件限制，產品質量和產量 相對穩定；最后，微藻(如小球藻等)本身就是一種高價值的產品，含有大量的蛋白質、油 脂、多糖等活性成分，可以分離提取這些物質，實現微藻細胞的綜合利用。至今，利用微藻產葉黃素的培養模式主要有光自養和異養兩種。微藻光自養培 養的缺點是微藻細胞生長速度慢、細胞密度及葉黃素產率低。目前光自養培養微藻的 葉黃素最高體積產率為Sanchez J F等在2L圓柱式光生物反應器中培養kenedesmus almeriensis 所獲得的 4. 8mg/L/d(Sanchez J F, Fernandez-Sevilla J Μ, Acien F G., et al. Biomass and lutein productivity of Scenedesmus almeriensis :influence of irradiance, dilution rate and temperature. Appl Microbiol Biotechnol,2008, 79 719 729)，葉黃素的最高面積產率為i^rnandez等在4000L管道式反應器中培 養 Scenedesmus almeriensis 所達至Ij 的 290mg/m2/d(Del Campo J A, Mercedes Garcia Gonzalez, Guerrero M G.Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production :current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol,2007,74 1163 1174)。微藻異養培養的優點是微藻能夠在生物反應器中進行高密度培養，細胞生長速率 快，但存在細胞內葉黃素、葉綠素等色素和蛋白質含量低等缺點。異養培養能夠獲得高細胞 密度和高細胞生長速度，從而使得葉黃素的產率相對于光自養培養有很大提高。微藻除異養培養和光自養培養模式外，還有一種不常用的培養模式即混合營養
4培養。迄今，微藻培養產葉黃素的最高體積產率(145mg/L/d)和胞內葉黃素的最高含量 (7. 6mg/g)均是在連續光照的混合營養培養條件下獲得的(Martin，Lucia. Process for obtaining lutein from algae. EP180843A1，2007)。但該培養模式只能在可蒸汽滅菌的封 閉式光生物反應器中進行，且培養過程必須保證絕對的無菌，同時需要光源的合理配置，這 在實際生產中無法實現。因此，利用混合營養模式培養微藻生產葉黃素不具有產業化價值。由上述可見，無論是采用光自養培養模式還是異養培養模式，較低的胞內葉黃素 含量和葉黃素產率，同時加上微藻大規模培養較高的成本，制約了應用微藻培養來生產葉 黃素的產業化進程。因此，有必要探索新的微藻培養工藝或方法使葉黃素產率及含量大幅 度提高，同時又使微藻大規模培養的成本大幅度下降，這樣才能夠滿足利用微藻培養產葉 黃素的產業化要求。綜合上述幾種產葉黃素微藻培養模式的優缺點，本發明設計了一種用于產葉黃素 微藻培養的“異養-稀釋-光誘導串聯培養”模式，其流程如下首先利用生物反應器異養培 養產葉黃素微藻以獲得高密度細胞，待培養液中有機碳源消耗完畢后，用不含有機碳源的 培養基稀釋藻液，經短時間內(8 Mh)的光照誘導，使藻細胞內的葉黃素快速大量積累。 該模式中的異養階段是在搖瓶、機械攪拌式、氣升式、鼓泡式等可異養培養的生物反應器中 進行，目的是為了在短時間內獲得較高密度的藻細胞；光誘導階段可在任何可用于微藻光 自養培養的系統中進行，目的是通過光誘導作用提高胞內葉黃素含量；異養階段與光誘導 階段分別獨立進行，異養階段放出的藻液先用光誘導培養基進行稀釋后再轉入光誘導培養 階段。過程中需確保進入光誘導階段的藻液中不含有機碳源，這樣可避免光誘導階段滋生 過多的雜菌；而通過稀釋作用可以確保光誘導階段的藻細胞能獲得充足的光照，實現胞內 葉黃素含量的快速提高。本發明將微藻培養法生產葉黃素分成藻體生長和產物(葉黃素)積累兩個階段， 即異養培養和光誘導培養。通過異養培養可在短時間內獲得大量的可產葉黃素的微藻細 胞，藻液稀釋后轉入光誘導培養，藻體內葉黃素含量迅速提升至初始的兩倍甚至兩倍以上。 本發明具有如下優勢(1)光誘導的藻細胞密度很高O 10g/L)，是常規光自養培養藻細 胞密度(約0.2 lg/L)的10倍左右；(2)光誘導時間很短(約Id 2d)，而微藻光自 養培養時間很長(約7d 14d)，因此，葉黃素的生產效率大為提高；C3)相對于微藻光自 養培養，光誘導時較高的藻細胞密度使得光誘導所需的占地面積很小，同時高細胞密度使 得采收成本大幅度降低；(4)異養培養幾乎不受氣候、天氣的影響，光誘導培養可以在玻璃 房內，自然光照或人工光照條件下進行，因而，采用本發明的方法可以實現葉黃素的連續生 產；( 分離提取葉黃素后的剩余藻體的綜合利用，可獲得額外的產品和經濟效益，降低了 葉黃素的綜合生產成本。綜述所述，本發明的培養模式合理地結合了異養和光自養培養兩種方式的各自優 勢，與其它模式相比，具有生產效率高、培養系統的組合方式靈活和生產成本低等優點，可 充分發揮異養模式可獲得高密度藻液和光誘導階段葉黃素快速積累的優勢，為解決源于微 藻的葉黃素產業化問題提供重要的技術手段。
發明內容
本發明一方面提供一種快速積累微藻胞內葉黃素的方法，該方法包括微藻的異養培養步驟，將所獲得的微藻異養培養液稀釋后進行光誘導培養的步驟，以及任選的藻細胞 采收、葉黃素分離提取的步驟。本發明另一方面提供一種源于微藻的葉黃素生產方法，該方法包括微藻異養的步 驟，將微藻的異養培養液稀釋后進行光誘導培養的步驟，以及藻細胞采收、葉黃素分離提取 的步驟。本發明的方法能夠實現胞內葉黃素的快速積累，大大提高了生產效率，降低了生 產成本，且提供了高品質的葉黃素。在一個具體實施方式
中，所述的微藻選自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、海水小球藻(Marine chlorella)、原殼 小球藻(Chlorella protothecoides)、捕圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)、Chlorella zofingiensis> Chlorella regularise Chlorella sorokina> Spongiococcumexcentricum 禾口 Chlamydomonas agloeformis。在一個具體實施方式
中，所述微藻異養培養的步驟包括在生物反應器中加入pH 為4. O 9. O的培養基，按工作體積的0. 1 30%接入微藻藻種進行分批培養、補料分批 培養、半連續培養或連續培養，培養溫度為10 40°C，控制pH小于9. 0，控制溶氧在以 上。在一個具體實施方式
中，所述光誘導培養包括將稀釋后的藻液轉入光誘導裝置中 進行光誘導，連續光照或間歇光照，培養溫度為5 50°C，光照強度為0. 1 150klx，光誘 導培養周期為1 150小時。在一個具體實施方式
中，異養培養基由氮源、有機碳源以及少量無機鹽、微量元素 和水組成；光誘導培養基由氮源、無機鹽和水組成。在一個具體實施方式
中，所述異養步驟在搖瓶、機械攪拌式、氣升式或鼓泡式可異 養培養的生物反應器中進行，所述光誘導培養步驟在搖瓶或敞開式的跑道池或圓池、封閉 式的平板式光生物反應器或管道式光生物反應器或柱式光生物反應器或薄膜立袋與吊袋 光生物反應器等任何可用于微藻光自養培養的裝置中進行，光源為自然光或各種人工光。在一個具體實施方式
中，當產葉黃素藻種為普通小球藻時，異養所使用的培養基 基本上由以下成分組成=KNO3 5 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4O. 3 0. 9克 / 升、Na2HPO4 · 12H20 1. O 10. O 克 / 升、MgSO4 · 7Η20 0. 2 1. O 克 / 升、CaCl2O. 05 0. 3克/升、FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 05克/升、微量元素0. 5 和水，其中微量元素的 組成為 H3BO3 5 15 克 / 升、ZnSO4 · 7H20 5. 0 10. 0 克 / 升、MnCl2 · H2Ol. 0 2. 0 克 / 升、(NH4) 6Μο7024 · 4Η20 0· 5 1. 5 克 / 升、CuSO4 · 5H20 1. 0 2. 0 克 / 升和 Co (NO3) 2 · 6H20 0. 1 0.9克/升。在一個具體實施方式
中，當小球藻為蛋白核小球藻時，異養所使用的培養基基本 上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升、尿素2 8克/升、KH2PO4 1 2克/升、 Na2HPO4 · 12H20 1. 0 10. 0 克 / 升、MgSO4 · 7H20 1 2 克 / 升、CaCl2 0. 05 0. 1 克 / 升、檸檬酸三鈉0. 1 2. 0克/升、Fe-EDTA溶液0. 5 lmL、A5溶液1 5mL和水；其中 Fe-EDTA溶液配方為!^eSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方為 H3BO3 2. 5 4. 0 克 / 升、MnCl2 · 4H20 1. 0 2. 0 克 / 升、ZnSO4 · 7Η200· 1 0. 6 克 / 升、 CuSO4 · 5Η20 5 10 克 / 升和 Na2MoO4 0. 01 0. 05 克 / 升。
在一個具體實施方式
中，采用超臨界(X)2萃取法、有機溶劑提取法或超聲輔助溶劑 提取法提取葉黃素。在一個具體實施方式
中，本發明的方法還包括將提取葉黃素后的藻體與其他色 素混合進行噴霧干燥制成藻粉，或對藻體中的生物活性物質進行分離提取。在一個具體實施方式
中，所述其他色素包括葉綠素。在一個具體實施方式
中，所述 生物活性物質包括蛋白質、葉綠素和多糖。
圖1和圖2顯示5L生物反應器/3L平板式光生物反應器串聯系統中采用異養-稀 釋-光誘導串聯培養蛋白核小球藻生產葉黃素的過程。其中，圖1顯示蛋白核小球藻在5L 生物反應器異養培養過程；圖2顯示蛋白核小球藻在3L平板式光生物反應器內光誘導培養 過程。圖3和圖4顯示50L生物反應器/IOL圓柱式光生物反應器串聯系統中采用異 養-稀釋-光誘導串聯培養蛋白核小球藻生產葉黃素的過程。其中，圖3顯示蛋白核小球 藻在50L生物反應器異養培養過程；圖4顯示蛋白核小球藻在IOL圓柱式光生物反應器內 光誘導培養過程。圖5和圖6顯示50L生物反應器/30L平板式光生物反應器串聯系統中采用異 養-稀釋-光誘導串聯培養普通小球藻生產葉黃素的過程。其中，圖5顯示普通小球藻在 50L生物反應器中異養培養過程；圖6顯示普通小球藻在戶外30L平板式光生物反應器內 光誘導培養。圖7和圖8顯示5L生物反應器/3L平板式生物光生物反應器串聯系統中采用異 養-稀釋-光誘導串聯培養橢圓小球藻生產葉黃素的過程。其中，圖7顯示橢圓小球藻在 5L生物反應器異養培養過程；圖8顯示橢圓小球藻在3L平板式光生物反應器中光誘導過程。
具體實施方案適用于本申請的微藻包括但不限于蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、 普通小球藻(Chlorella vulgaris)、海水小球藻(Marine chlorella)、原殼小球藻 (Chlorella protothecoides)、捕圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)、Chlorella zofingiensisλ Chlorella regularis、Chlorella sorokina、Spongiococcum excentricum 禾口 Chlamydomonas agloeformis。在優選的實施方式中，本發明采用蛋白核小球藻、普通小球藻和橢圓小球藻來生
產葉黃素。1.微藻在生物反應器中的高密度異養培養此步驟的目的是為了快速獲得大量藻細胞，以供光誘導階段快速合成積累葉黃素。可采用本領域熟知的各種培養基來進行微藻異養培養。通常，異養培養基含有氮 源、有機碳源、少量無機鹽、微量元素和水。這類培養基包括HA-SK培養基(中國專利ZL 200610024004. 9)、Endo培養基(Ogbonna J. C. , Masui.H. , Tanaka. H.Sequential heterotrophic !autotrophic cultivation—an efficient method of producing Chlorella biomass for health food and animal feed. J. Appl. Phycol. 1997,9, 359 ~ 366)等。本發明所用的HA-SK培養基基本上由KNO3、葡萄糖以及少量無機鹽、微量元素 和水組成。在所述技術方案中，所述微量元素宜選自H3B03、ZnSO4 · 7H20、MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20、CuSO4 · 5H20 和 Co(NO3)2 · 6H20 中的一種、多種或全部。本文所用的術語“基本上由……組成”表示本發明的組合物中除了含有主要組分 KNO3、葡萄糖以及少量無機鹽、微量元素和水外，還可包含一些對于組合物的基本特性或新 的特性(即可維持微藻在較短的培養周期內細胞密度達到較高的水平，同時活性物質含量 與常規異養培養相比有較大幅度提高)沒有實質上影響的組分。本文所用的術語“由…… 組成”表示本發明的組合物由所指出的具體組分組成，沒有其他組分，但是可以帶有含量在 通常范圍內的雜質。在該培養基中，培養基的各組分可在一定范圍內變化而不會對微藻細胞密度和品 質有很大的實質影響。因此，這些組分的用量不應受實施例的嚴格限制。如本領域技術人 員所熟知的，培養基中還可加入少量無機鹽，例如硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵和磷酸鹽等，以 及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。在本發明中，較佳的微量元素組分宜選自H3B03、ZnSO4 · 7H20、MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20、CuSO4 · 5H20和Co (NO3)2 · 6H20中的一種或多種。無機鹽和微量元素的 用量可根據常規知識確定。本發明所采用的ha-sk培養基基本上由以下成分組成=kno3 5 15克/升、葡萄 糖 10 60 克 / 升、KH2PO4 0. 3 0. 9 克 / 升、Nei2HPO4 ·12Η20 1. O 10. O 克 / 升、MgSO4 ·7Η20 0. 2 1. O 克 / 升、CaCl2 0. 05 0. 3 克 / 升、FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 05 克 / 升；微量元素 0. 5 ^il，其中微量元素的組成為H3BO3 5 15克/升、SiSO4 · 7Η205· 0 10. 0克/升、 MnCl2 .H2O 1. 0 2. 0 克 / 升、(NH4)6Mo7Om · 4Η20 0. 5 1. 5 克 / 升、CuSO4 · 5Η20 1. 0 2. 0 克 / 升和 Co (NO3)2 · 6Η20 0. 1 0. 9 克 / 升；水。本發明所用的Endo培養基基本上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升、尿素 2 8 克 / 升、KH2PO4 1 2 克 / 升、Nei2HPO4 · 12Η20 1. 0 10. 0 克 / 升、MgSO4 · 7Η201 2 克/升、CaCl2 0. 05 0. 1克/升、檸檬酸三鈉0. 1 2. 0克/升、Fe-EDTA溶液0. 5 ImL, Α5溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 ·7Η20 20 30克/升和EDTA 20 40克 / 升；Α5 溶液配方為 H3BO3 2. 5 4. 0 克 / 升、MnCl2 · 4Η20 1. 0 2. 0 克 / 升、ZnSO4 · 7Η20 0. 1 0. 6 克 / 升、CuSO4 · 5Η20 5 10 克 / 升和 Na2MoO4 0. 01 0. 05 克 / 升；水。在根據上述配方配制培養基后，可用常規手段如酸或堿將所述培養基的ρη調為 4. 0 9. 0，并在115 120°C下高壓滅菌15 20分鐘。可采用分批、補料分批、半連續和 連續培養等多種方式實施異養培養。當異養培養采用補料分批培養方式時，將相應配制好的培養基加入到生物反應器 中，補加水至工作體積，通常裝料系數為0. 6 0. 8，然后蒸汽滅菌(121 V，維持約20分 鐘)，當溫度降至30 35°C時，按工作體積的1 15%接入微藻藻種開始異養培養。在異養培養一段時間后，當培養基中葡萄糖被消耗完(通常為27 45小時)時需 要進行補料，補加碳源(如葡萄糖)、氮源(如，培養普通小球藻的氮源為KNO3、培養蛋白核小球藻的氮源為尿素)和無機鹽等營養鹽，補加的營養鹽是經濃縮后的上述相應培養基， 促使微藻繼續生長。可每隔5 8小時補料，葡萄糖的補加濃度可為15 25克/升，氮源 溶液的補加濃度可為2 5克/升。當補加一定次數(一般為4 7次)的營養鹽后，微 藻細胞密度達到最高時，異養培養階段結束。無論采用何種培養方式，在培養過程中，須控制適合的培養條件使微藻正常生長。 通常，控制溫度為20 35°C，例如28 30°C，溶氧不低于5%的空氣飽和濃度，pH不高于 9. 0。在優選的實施例中，溶氧不低于10%的空氣飽和濃度，pH不高于8. 5。通常，當采用分批培養、補料分批培養時，異養培養階段結束時生物反應器中有機 碳源需完全消耗完。當采用半連續培養方式時，帶放操作是在生物反應器中有機碳源完全 消耗完時進行。異養可以在搖瓶、機械攪拌式、氣升式、鼓泡式等可異養培養的生物反應器中進 行。2.高濃度藻液的稀釋此步驟的目的是為了使轉入光誘導培養的產葉黃素微藻高效地吸收光能，提高光 能利用效率，同時降低藻細胞的死亡率。因為光強在藻液中呈“時、空、非線性”衰減，所以 在高細胞密度下，反應器中藻細胞大部分處于暗區，幾乎接受不到光照，這樣藻細胞很容易 死亡而且會影響光誘導的效率。異養培養獲得的高密度藻液應進行稀釋操作，用水和不含有機碳源的培養基對高 密度的藻液進行稀釋，使細胞密度維持在0. 1 10克/升，調節PH至5. 0 8. 0。在其它 實施例中，稀釋藻液，使細胞密度維持在1 8克/升。在優選的實施例中，使細胞密度維 持在1.0 5.0克/升。可采用各種已知的稀釋培養基來稀釋藻液。通常，光誘導培養基由氮源、無機鹽和 水組成，相對于異養培養基不含有有機碳源。在優選的實施方案中，所述培養基的氮源濃度 為2 10克/升，較佳為2 8克/升。所述氮源可以與異養培養步驟中所用的氮源相同 或不同。在一個優選的具體方案中，異養培養獲得的高密度藻細胞宜用不含有機碳源、氮 源濃度為2 10克/升的初始培養基(例如，培養普通小球藻時采用不含葡萄糖的HA-SK 培養基，培養蛋白核小球藻時采用不含葡萄糖的Endo培養基)進行適當稀釋。稀釋采用的培養基無需高壓滅菌，配制好后調節pH至5. 0 8. 0即可使用。在具體實施方式
中，對普通小球藻，稀釋培養基(光誘導培養基)由以下成分 組成=KNO3 1 8 克 / 升、MgSO4 · 7Η20、0· 5 1. 0 克 / 升、CaCl2 0. 01 0. 06 克 / 升、 FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 06 克 / 升、EDTA 0. 020 0. 052 克 / 升。對蛋白核小球藻，稀釋培養基(光誘導培養基)由以下成分組成尿素0. 1 2.0 克 / 升、MgSO4 · 7Η20、0· 5 1. 0 克 / 升、CaCl2 0. 01 0. 06 克 / 升、FeSO4 · 7H200. 01 0. 06、EDTA 0. 020 0. 052克/升、檸檬酸鈉0. 08 0. 5克/升。3.光誘導培養該步驟的目的是讓產葉黃素微藻接受充足的光照，通過光誘導使藻細胞快速大量 合成積累葉黃素。如上所述高密度微藻培養液經稀釋后，將所得稀釋液轉入光誘導裝置中進行光誘導培養。溫度控制在5 50°C，光照強度為0. 11 150klx，連續光照或間歇光照，光誘導 培養周期為1 150小時，通氣量為0. 1 2. Ovvm。其中所述的光生物反應器包括所有的 封閉式光生物反應器(搖瓶、管道式、平板式、柱式、薄膜立袋與吊袋等)和所有的開放式光 生物反應器(跑道池、圓池和鼓泡式大盆等)。通常，培養溫度可控制在15 ;35°C的范圍內，例如18 ;35°C、20 ;35°C、20 30°C等。通常，光照強度為1 70klx，例如，1 60、1 50、1 40、1 30、1 20、1 IOklx等，可視具體生產情況而定。通常，如通過氣體造成藻液充分混合，則通氣量可控制為 0. 15 2. Ovvm，例如，0. 2 1. 8,0. 5 1. 5,0. 8 1. 5、1. O 1. 5vvm 等。在其它實施方 式中，培養溫度控制在10 50°C，光照強度為1 lOklx，通氣量為0. 05 2. Ovvm。在其它實施例中，光誘導培養周期為8 100小時，例如，根據實際的天氣情況，光 誘導培養周期可以為8 90小時、8 80小時、8 60小時、8 48小時、8 M小時不 等；或者，光誘導培養周期可以為12 72小時、12 60小時、12 48小時、12 36小時、 12 M小時不等或M 60小時、24 48小時不等。在本申請中，“光誘導培養周期”包括了整個光誘導培養過程，例如，戶外培養時光 誘導培養周期包括夜晚沒有光照的時間。在本申請中，“光照時間”指使用本申請所述光照強度對微藻實施光誘導培養的時 間，即該時間不包括夜晚沒有光照的時間。在一些實施例中，光誘導培養步驟的光照時間為 8 48小時，例如8 36小時、8 24小時、8 18小時、8 12小時、12 36小時、12 24小時不等，以及上述范圍內的任意時長。因此，本申請的光誘導培養步驟也包括光照時間為8 48小時范圍內的光誘導培 養步驟。可采用人工光照的方式進行光誘導培養，也可在戶外利用自然光照的方式進行光 誘導培養。在具體實施方式
中，當培養液中葉黃素濃度達到最高時，結束光誘導培養，收獲藻 細胞進行葉黃素的分離提取或直接采收藻細胞進行藻粉制備。4.藻細胞采收、葉黃素分離提取及藻體綜合利用光誘導培養結束后，對小球藻進行離心采收，獲得濕藻體。藻細胞的采收方法包括 但不限于高速離心、絮凝，氣浮或過濾等技術；藻細胞破壁方法包括但不限于藻體自溶、高 壓勻漿、酶水解、水相熱解等濕法破壁方法。采用傳統的有機溶劑提取法對小球藻進行葉黃素的提取。首先將有機溶劑加入到 藻泥中進行萃取，然后進行攪拌離心獲得上清液和藻體沉淀，對上清液進行減壓濃縮、攪拌 加水、過濾獲得葉黃素晶體。上清液中的其他成分可逐步分離提取獲得脂肪酸、葉綠素等，或直接將上清液中 的所有成分與藻體沉淀混合噴霧干燥獲得小球藻粉。在一個較佳的方案中，采用超臨界(X)2萃取技術對小球藻進行葉黃素的分離提取。 在一個更佳的方案中，將獲得的小球藻液濃縮后直接噴霧干燥獲得小球藻粉。本發明中，可對培養所得的微藻進行綜合利用，提取其中的多不飽和脂肪酸、蛋白 質、葉綠素、多糖等各種活性成分。活性成分的提取順序并無特殊限制，但通常要滿足先提 取的步驟不能導致后提取的成分損失這一前提。本文中涉及到藻細胞干重和葉黃素含量測定方法如下
藻細胞干重測定在微藻(如小球藻)培養過程中取培養液V毫升，SOOOrpm離心 10分鐘，將離心后的藻體用去離子水洗滌3次，轉移至稱量瓶(W1(克))中，在105°C烘箱 中烘干至恒重W2(克)。藻體干重Cx可根據下式計算Cx(克/升)=(W2-W1)/V/1000。葉黃素測定采用高效液相色譜法(HPLC)，具體操作步驟見文獻(Zheng Yun Wu, Chun Lei Shi et al. Modeling of lutein production by heterotrophic Chlorella in batch and fed-batch cultures. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007,23 :1233-1238)。實施例1在5L生物反應器中加入下述異養培養基和水至2. 8L后進行蒸汽滅菌，然后當溫 度降到30°C時接入蛋白核小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30 士 1°C，空氣流量為lvvm，pH小于8.0，控制溶氧15%以上。在接種后53. 9h后第一次補料，之后每隔5 他進行補料，共補加4次，培養至 88. 40h細胞干重達到132. 2g/L(見圖1)，此時異養培養結束轉入光誘導培養。將異養培養結束后的高密度藻液稀釋到2. 55g/L，并加入下述光誘導培養基，轉入 到3L平板式光生物反應器中進行光誘導培養。光誘導培養條件溫度維持在^ 33°C，空 氣流量為lvvm，雙側光照，每側光強為15klx。光誘導培養2 后，細胞干重從2. 55g/L降 低到1. 82g/L，葉黃素從1. 57mg/gDcw上升至3. 6%ig/gDcW，光誘導27h時葉黃素的產率為 5. 88mg/L/d ；若光誘導1 時葉黃素的產率可達12. lmg/L/d(為目前微藻光自養生產葉黃 素最高產率4. 8mg/L/d的2. 5倍)(見圖2)。異養及補料培養基葡萄糖60. 0 克 尿素 8. 0 克MgSO4 · 7Η20 2. 0 克KH2PO4L 1 克 Nei2HPO4 · 12Η20 9. 0 克 CaCl2O. 02 克檸檬酸三鈉1.8克Fe-EDTA 溶液 1. Oml 微量元素溶液 4. 5ml 水 1000ml其中!^e-EDTA溶液配方為i^S04*7H20 15克/升和EDTA1. 4克/升，微量元素溶液 配方為 H3BO3 2. 11 克 / 升，MnCl2 ·4Η20 0. 81 克 / 升，ZnSO4 ·7Η20 0. 11 克 / 升，CuSO4 ·5Η20 10. 0 克 / 升，Na2MoO4 0. 05 克 / 升。光誘導培養基尿素0. 5克MgSO4 · 7Η20 1. 0克 檸檬酸三鈉0. 05克CaCl2O. 01 克Fe-EDTA 溶液 0. 4ml 水 1000ml其中！^e-EDTA溶液配方為!^eSO4 · 7H20 15 克 / 升和 EDTA1. 4 克 / 升。實施例2在50L生物反應器中加入下述異養培養基和自來水至25L后在121°C滅菌20min， 然后當溫度降至30°C左右時按工作體積的10%接入蛋白核小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30°C，空氣流量為lvvm，pH在6.0 8.0，控制溶氧15%以 上。在培養過程中，當葡萄糖消耗完后，進行補加碳源，當尿素消耗完時，補加氮源。通過6 次補加碳源，3次補加氮源后在98. 89h藻細胞密度達130. 5g/L (見圖3)。將異養培養結束后的高密度藻稀釋到2. 01g/L，并加入光誘導培養基，轉入到10L
11圓柱光生物反應器內進行光誘導。光誘導培養條件自然溫度，溫度在30°C，光強在3klx，空氣流量為lvvm。光誘導 培養30h后，細胞干重從2. 01g/L降低到1. 66g/L，葉黃素從2. 55mg/gDcw上升至3. 47mg/ gDcw，光誘導30h，葉黃素產率為4. 61mg/L/d ；若只光誘導Mh，葉黃素的產率達5. 73mg/L/ d(見圖4)。培養基與實施例1的培養基一致。實施例3在50L生物反應器中加入下述異養培養基和自來水至25L后在121°C滅菌20min， 然后當溫度降至30°C左右時按工作體積的13%接入普通小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30°C，空氣流量為lvvm，pH小于9. 0。在培養過程中，當碳 源消耗完后，進行補加葡萄糖，當氮源消耗完時，補加硝酸鉀。通過5次補加碳源和氮源， 58. 20h藻細胞密度最高達54. 5g/L(見圖5)。將異養培養的高密度藻稀釋到3. 2g/L左右，并加入光誘導培養基，轉入到30L平 板式光生物反應器在戶外進行光誘導培養。光誘導培養條件自然溫度，自然光照，空氣流 量為1. Ovvm0光誘導28h,葉黃素從初始的1. 10mg/gDcw上升至1. 82mg/gDcw ；光誘導23h 時，葉黃素含量為1. 67mg/gDcw,葉黃素產率達5. 23mg/L/d(見圖6)。異養和補料培養基葡萄糖60. 0克 硝酸鉀10. 0克MgSO4 · 7Η20 0. 2克KH2PO4O. 3 克 Nei2HPO4 · 12Η20 8. 8 克 CaCl20. 02 克Fe-EDTA 溶液 1. Oml 微量元素溶液 3. 5ml 水 IOOOml其中!^e-EDTA溶液配方為i^S04*7H20 15克/升和EDTA1. 4克/升，微量元素溶液 配方為 H3BO3 2. 86 克 / 升、MnCl2 ·4Η20 0. 11 克 / 升、ZnSO4 ·7Η20 9. 22 克 / 升、CuSO4 ·5Η20 1. 00 克 / 升、(NH4)6Mo7O24 · 4Η20 0. 1 克 / 升和 Co (NO3)2 · 6Η200· 9 克 / 升。光誘導培養基硝酸鉀0. 5 克MgSO4 · 7Η20 0. 6 克CaCl20.03 克Fe-EDTA 溶液 1. 5ml 水 IOOOml其中！^e-EDTA溶液配方為!^eSO4 · 7H20 8 克 / 升和 EDTA 10. 4 克 / 升。實施例4在5L生物反應器中加入下述異養培養基和水至2. 8L后進行蒸汽滅菌，然后當溫 度降到30°C時按工作體積的8%接入橢圓小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30士 1°C，空氣流量為lvvm，pH小于8. 5，控制溶氧5 %以上。補料兩次后在66h，藻細胞密度為53. Og/L(見圖7)，此時異養培養結束轉入光誘
導培養。將異養培養結束后的高密度藻液稀釋到4. Og/L，并加入下述光誘導培養基，轉入 到3L平板式光生物反應器中進行光誘導培養。光誘導培養條件溫度維持在觀 33°C， 空氣流量為1. Ovvm，雙側光照，每側光強為15klx。光誘導培養4 后，細胞干重從4. 0g/L 降低到2. 8g/L，葉黃素從1. 5mg/gDcw上升至3. 6mg/gDcw,葉黃素產率為5. 04mg/L/d ；光誘 導Mh，葉黃素產率可達9. 2%ig/L/d(見圖8)。培養基與實施例3的培養基一致。盡管上面已經描述了本發明的具體例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所 附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。
權利要求
1.一種快速積累微藻胞內葉黃素的方法，其特征在于，該方法包括微藻的異養培養步 驟，將所獲得的微藻異養培養液稀釋后進行光誘導培養的步驟，以及任選的藻細胞采收、葉 黃素分離提取的步驟。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述的微藻選自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、海水小球藻(Marine chlorella)、原殼 小球藻(Chlorella protothecoides)、捕圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)、Chlorella zofingiensis> Chlorella regularise Chlorella sorokina、Spongiococcum excentricum 禾口 Chlamydomonas agloeformis。
3.如權利要求1-2中任一項所述的方法，其特征在于，所述微藻異養培養的步驟包括 在生物反應器中加入pH為4. O 9. O的培養基，按工作體積的0. 1 30%接入微藻藻種進 行分批培養、補料分批培養、半連續培養或連續培養，培養溫度為10 40°C，控制pH小于 9.0，控制溶氧在以上。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述藻液稀釋包括用培養基將 異養獲得的藻液稀釋至細胞密度為0. 1 20克/升，所述培養基不含有機碳源，其pH為 4. O 9. O。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述光誘導培養包括將稀釋后 的藻液轉入光誘導裝置中進行光誘導，培養溫度為5 50°C，連續光照或間歇光照，光照強 度為0. 1 150klx，光誘導培養周期為1 150小時。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述異養培養基由氮源、有機碳 源、無機鹽、微量元素和水組成；所述光誘導培養基由氮源、無機鹽和水組成。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，所述異養步驟在搖瓶、機械攪拌 式、氣升式或鼓泡式可異養培養的生物反應器中進行，所述光誘導培養步驟在搖瓶或敞開 式的跑道池或圓池、封閉式的平板式光生物反應器或管道式光生物反應器或柱式光生物反 應器或薄膜立袋與吊袋等用于微藻光自養培養的裝置中進行，光源為自然光或人工光。
8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，當小球藻為普通小球藻時，異養所使用的培 養基基本上由以下成分組成=KNO3 5 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4 0. 3 0. 9 克 / 升、Nei2HPO4 · 12H20 1. O 10. O 克 / 升、MgSO4 · 7Η200· 2 1. O 克 / 升、CaCl2 0. 05 0. 3克/升、FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 05克/升、微量元素0. 5 和水，其中微量元素的 組成為H3BO3 5 15 克 / 升、ZnSO4 ·7Η20 5. 0 10. 0 克 / 升、MnCl2 · H2O 1. 0 2. 0 克 / 升、(NH4)6Mo7O24 · 4Η20 0. 5 1. 5 克 / 升、CuSO4 · 5Η201· 0 2. 0 克 / 升和 Co (NO3)2 · 6Η20 0. 1 0.9克/升。
9.如權利要求2所述的方法，其特征在于，當小球藻為蛋白核小球藻時，異養所使用的 培養基基本上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升、尿素2 8克/升、KH2PO4 1 2 克 / 升、Nei2HPO4 · 12Η20 1. 0 10. 0 克 / 升、MgSO4 · 7Η20 1 2 克 / 升、CaCl2 0. 05 0. 1 克/升、檸檬酸三鈉0. 1 2. 0克/升、Fe-EDTA溶液0. 5 lmL、A5溶液1 5mL和水；其中！^e-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA 20 40克/升；A5 溶液配方為 H3BO3 2. 5 4. 0 克 / 升、MnCl2 · 4H20 1. 0 2. 0 克 / 升、ZnSO4 · 7H20 0. 1 0. 6 克 / 升、CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升和 Na2MoO4 0. 01 0. 05 克 / 升。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將提取葉黃素后的藻體與其他色素混合進行噴霧干燥制成藻粉，或對藻體中的生物活性物質進行分離 提取。
全文摘要
本發明涉及一種快速積累微藻胞內葉黃素的方法，該方法包括異養培養、稀釋、光誘導培養、微藻采收以及葉黃素提取等步驟。采用本發明方法可充分發揮異養培養所獲得的微藻細胞在光誘導階段葉黃素快速積累的優勢，為解決源于微藻的葉黃素產業化提供重要的技術手段。
文檔編號C12P23/00GK102094061SQ201010567920
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者李元廣, 李淑蘭, 李際軍, 沈國敏, 王偉良, 范建華, 魏鴻剛, 黃建科 申請人:上海澤元海洋生物技術有限公司, 華東理工大學