專利名稱：白藜蘆醇及其衍生物的醫藥新用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，涉及白藜蘆醇衍生物(RV01，RV02, RV32)的醫藥新用 途，具體地說是涉及其在制備防治酗酒相關的人外周免疫疾病的保健食品及藥品方面的用 途。
背景技術：
白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，化學名為3，5，4'-三羥基-反-均二苯代乙烯 (3,5,4' -trihydroxysitlbene)。分子式為C14H1203，分子量228. 25，無色針狀晶體，難溶 于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性較強的溶劑。白藜蘆醇是許多植物中存在的一種 活性非黃酮類多酚化合物，天然的白藜蘆醇還有順、反式兩種結構，這兩種結構可各自與葡 萄糖結合，形成順式或反式白藜蘆醇苷，它們與白藜蘆醇的生物學活性有關。自1940年該 成分被發現以來，一直受到醫藥界的重視，迄今為止的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗 心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎、抑制血小板聚集等作用，它已成為科學家們高度重視的天 然活性成分，具有很大的藥用價值和市場前景。隨著對白藜蘆醇研究的深入，有關白藜蘆醇 衍生物也陸續有些報道，其中主要是一些白藜蘆醇的甲基化和羥基類衍生物。白藜蘆醇的 衍生物具有與白藜蘆醇相似的藥理活性，有些衍生物的活性和選擇性都強于白藜蘆醇，而 且衍生物的穩定性也往往好于白藜蘆醇。提示其良好的藥用前景及經濟價值。乙醇(Ethanol)是人們日常生活中可以廣泛接觸的化學物質，它是酒精類飲料的 主要成分，也是常用的有機溶劑。隨著經濟文化的發展、飲食習慣的存在以及飲食結構的變 化，乙醇的生產和消費也顯著增加，隨之而來的是因乙醇的濫用而導致的毒性作用。隨著研 究的開展及深入，乙醇的毒害作用逐漸被人們了解，它可經皮膚、呼吸道、消化道吸收，在機 體內代謝成乙醛同時產生各種有害物質，引起心血管系統、生殖系統、消化系統、神經系統 及外周免疫系統的損害，例如胃癌，食管癌，免疫功能低下等。國際癌癥研究署已經將酒精 劃分為人類的一類致癌物質。淋巴細胞是一種最易從人體得到的真核細胞，乙醇在淋巴細胞內誘導的毒性作用 可以從一定程度上反映乙醇對人體其他器官及細胞的毒性作用。淋巴細胞是一種具有特異 性免疫功能的白細胞，即T細胞和B細胞。它們在抗原刺激下可增大、分裂繁殖，并分別執 行細胞免疫和體液免疫的功能。從而改變了淋巴細胞是終末細胞的概念，確定了淋巴細胞 的特異性免疫功能。淋巴細胞按其發生過程和功能至少可以分為兩大類一類有賴于胸腺 的存在，稱為胸腺依賴淋巴細胞，簡稱T細胞；另一類在鳥類依賴于腔上囊的存在，稱為囊 依賴淋巴細胞，簡稱B細胞。人類的B細胞，是在骨髓中分化的。T細胞接受抗原刺激變成 致敏細胞后乃分化繁殖成具有免疫活性的細胞。T細胞隨血液或淋巴液流動到達抗原所在 地，通過與抗原的直接接觸，才分泌出免疫活性物質，發揮其免疫作用，如排斥移植來的異 體組織、破壞腫瘤細胞、抑制病毒與細胞繁殖等，故稱之為細胞免疫。B細胞被抗原激活后， 可轉化為漿母細胞，并分裂、分化為漿細胞。由于淋巴細胞具有上述重要的免疫功能，因此 淋巴細胞是外周免疫系統的重要組成部分，它們擔負起了人體第一道也是最為重要的免疫屏障。更重要的是，乙醇在被攝入人體后90%以上經胃直接吸收入血液，并隨血液循環到達 包括肝臟在內的全身各處。乙醇在被肝臟代謝完全前，會始終存在于血液中即乙醇會始終 作用淋巴細胞，從而對淋巴細胞產生毒性。這種毒性能夠嚴重影響淋巴細胞DNA功能，并降 低淋巴細胞表面免疫受體的表達及主要免疫指標，導致外周免疫缺陷病。
發明內容
本發明的內容是提供一種白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)在制備防治酗 酒相關疾病保健食品及藥品方面的用途。本發明是通過如下方案實現的本發明所述的白藜蘆醇衍生物為RVOl (E)-542-(喹啉-4-基)乙烯基)_1，3_苯 二醇、RV02 (E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯基)喹啉、RV32 (E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯
基)苯酚。三種白藜蘆醇衍生物能夠用于制備治療外周免疫功能低下疾病的保健食品及藥 品。所述外周免疫功能低下疾病是指與酗酒相關的外周免疫疾病。所述的白藜蘆醇衍生物和藥學或保健品上可接受的載體混合制成可接受的片劑、 膠囊、注射液、沖劑、口服液、果汁、碳酸飲料和酒。并可以時間及劑量依賴性的抑制酗酒狀 態下乙醇對人外周血淋巴細胞DNA的損傷，增強人外周血淋巴細胞對DNA的修復作用，恢復 人外周血淋巴細胞DNA的完整性，保證人外周血淋巴細胞免疫功能的正常。
圖1為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對乙醇誘導的人外周血淋巴細胞 DNA損傷的影響·ρ < 0. 001與空白組相比，***ρ < 0. 001給藥組與模型組相比·圖2為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對羥自由基清除能力的考察***ρ < 0. 001與空白組相比·圖3為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對乙醇代謝酶ADH1B，ALDffimRNA 表達的影響***ρ < 0. 001與空白組相比·
具體實施例方式實施例1、以人外周血淋巴細胞為試驗對象進行白藜蘆醇及其衍生物(RV01， RV02, RV32)對于細胞成活率的影響1.1 材料人淋巴細胞分離液中國醫學科學院生物工程醫學研究所。白藜蘆醇(Res)及 三種衍生物(RV01，RV02, RV32)由沈陽藥科大學制藥工程學院藥化教研室合成和提供；經 HPLC檢測，以上化合物純度均在99%以上。無水乙醇天津市北方化玻購銷中心。低熔點 瓊脂糖華美工程有限公司。正常熔點瓊脂糖華美生物工程公司。乙二胺四乙酸二鈉天 津市博迪化工有限公司。1.2 方法
細胞分為空白組，乙醇(IOOmM)組，白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)陰 性對照組(5 μ M，25 μ Μ, 50 μ Μ)，白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)保護組(5 μ Μ, 25μΜ，50μΜ)+乙醇(IOOmM)組。細胞先給于白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 作用l，6，12J4h，然后給予終濃度為IOOmM的乙醇共同作用細胞池。單細胞凝膠電泳試驗制片第一層取出載玻片，滴加100 μ 1正常熔點瓊脂糖凝膠溶液，附蓋玻片，盡 量避免產生氣泡，然后4°C固化10-15min。第二層取出已經鋪好第一層膠體的載玻片，揭 去蓋玻片，刮去第一層凝膠，將細胞懸液與低熔點瓊脂糖37°C按1 1的比例混合，在載玻 片上滴加100 μ 1含有細胞的LMA，蓋蓋玻片，置4°C下固化20min。移去蓋玻片，將載玻片浸 入新鮮配制的4°C預冷的細胞裂解液中lh。DNA堿解旋將載玻片取出，置于水平電泳槽中， 加入新鮮配制的堿性電泳緩沖液，約覆過載玻片膠面0. 25cm左右，放置30min。電泳在電 壓11V，電流300mA下，電泳20min。中和與染色電泳后取出載玻片，用0. 4mol/L tris-HCl 中和5min/每次，共三次。再將載玻片浸入無水乙醇中固定Ih后，取出晾干。每個載玻片 上滴加50 μ L溴化乙啶(EB)水溶液，蓋蓋玻片染色。閱片在熒光顯微鏡下，DNA被染成紅 色。每個樣本隨機觀察50個細胞，使用LUCIA軟件分析。1. 3 結果結果如圖1所示，白藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 25 μ M預先處理細 胞，后給予乙醇從他起均體現顯著性的DNA保護作用。RV02體現了最強的DNA保護作用， 其次是RV01，RV32及Res。各化合物均體現了較好的劑量依賴性。此結果表明，白藜蘆醇 及其三種衍生物(RV01，RV02，RV3》是一種有效的抗酗酒引起的外周免疫性疾病的新化合 物，本發明拓寬了白藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02, RV32)的醫藥應用。實施例2、白 藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02，RV3》對i^nton體系產生的羥自由基的清除活性的考 察2. 1 材料乙二胺四乙酸二鈉天津市博迪化工有限公司。磷酸氫二鈉沈陽市試劑三廠。磷 酸二氫鉀天津市博迪化工有限公司。白藜蘆醇(Res)及三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 由沈陽藥科大學制藥工程學院藥化教研室合成和提供；經HPLC檢測，以上化合物純度均在 99%以上。2. 2 方法羥基自由基的產生在IOmL的反應溶液中，含pH 5,9KH2P04-Na2HP04(0. 067mol/ L) 2mL, DMSO (1. Omol/L)，Fe2+-EDTA (0. 9mmol/L)，H2O2 (2. Ommo 1/L)，混合溶液于 37°C水浴反 應15min。在上述溶液中加入0. 5mLDNPH于60°C水浴反應20min.取出后，流水冷卻，再加 入2mL Κ0Η，溶液最終pH為于390nm測定吸光值。結果采用Mean士SEM表示，數據統計采用 ANOVA結合Dunnett，s t-test進行組間比較。2. 3 結果應用!^nton反應考察白藜蘆醇及其三種衍生物對羥自由基的清除活性將有助于 揭示該三種衍生物對DNA的保護作用的機制及與Res的差異。如圖2所示，Fenton體系在 啟動15min后羥自由基水平達峰并在30min內保持穩定。Res的三種衍生物分別體現了不 同于Res的羥自由基清除活性。Res體現了最強的羥自由基清除活性，其次是RVOl及RV32。然而RV02卻沒有體現任何羥自由基的清除活性。該結果顯示白藜蘆醇及其衍生物的DNA 保護作用可能部分是通過清除羥自由基來實現的。實施例3、白藜蘆醇及其三種衍生物對胞內DNA修復通路(BER)核心酶的激活作用3. 1 材料受試藥白藜蘆醇(Res)及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)由沈陽藥科大學制藥 工程學院藥化教研室合成和提供；經HPLC檢測，以上化合物純度均在99%以上。Trizol Sigma。氯仿天津博迪化學試劑公司。DEPC :Sigma。反轉錄試劑盒寶信生物公司。引物 沈陽聯星公司。一抗CellSignal公司。二抗北京中杉金橋生物公司。3. 2 方法RT-PCR 分析法，Western blotting 方法，白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02，RV32) 給藥終濃度為5，25，50μπιΟ1/1，作用時程為Mh。3. 3 結果如圖3所示，白藜蘆醇及其三種衍生物單獨處理細胞及預處理細胞均能上調細胞 的OGGl及XRCClmRNA和蛋白表達水平并具有一定的時間依賴性。四者激活OGGl及XRCCl 表達的能力由弱到強的順序為白藜蘆醇< RV32 < RVOl < RV02。
權利要求
1.白藜蘆醇及其衍生物在制備治療外周免疫功能低下疾病的保健食品及藥品中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述的白藜蘆醇衍生物為￠)-5- -(喹 啉-4-基)乙烯基)-1，3_苯二醇、(E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯基)喹啉和(E)-4-(3，5-二 甲氧基苯乙烯基)苯酚。
3.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述外周免疫功能低下疾病是指與酗酒 相關的外周免疫疾病。
4.根據權利要求1所述的用途，其特征在于白藜蘆醇衍生物時間及劑量依賴性的抑 制酗酒狀態下乙醇對人外周血淋巴細胞DNA的損傷，增強人外周血淋巴細胞對DNA的修復 作用，恢復人外周血淋巴細胞DNA的完整性，保證人外周血淋巴細胞免疫功能的正常。
5.根據權利要求1所述的白藜蘆醇衍生物的用途，其特征在于所述的白藜蘆醇及其 衍生物和藥學或保健品上可接受的載體混合制成可接受的片劑、膠囊、注射液、沖劑、口服 液、果汁、碳酸飲料和葡萄酒。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，提供了白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02，RV32)在制備抗酗酒引起的外周免疫功能低下保健食品及藥品方面的新用途。本發明研究了白藜蘆醇及其衍生物對酗酒狀態下乙醇誘導的人外周血淋巴細胞DNA損傷的保護作用。首次發現白藜蘆醇及其衍生物可以激活人外周血淋巴細胞內的BER修復通路中的核心酶的表達，提高細胞的DNA修復能力，從而保證DNA結構的完整性，進而保證外周淋巴細胞即外周免疫系統的正常功能。
文檔編號A23L1/29GK102125537SQ20101059162
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月7日 優先權日2010年12月7日
發明者吳春福, 楊靜玉, 王立輝, 王芳, 陳國良 申請人:沈陽藥科大學