專利名稱：乙型腦炎病毒熒光定量pcr檢測新方法及乙型腦炎病毒檢測pcr體系的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及登乙型腦炎病毒的快速定性和定量檢測方法及乙型腦炎病毒檢測PCR體系，提供一對特異性引物和探針。
背景技術：
流行性乙型腦炎(印idemic encephalitis B，邛)簡稱乙腦，由乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒經蚊蟲媒介傳播，引起以中樞神經系統損害為主的急性病毒性傳染病。分布較廣，包括熱帶、亞熱帶、溫帶和中溫帶地區，東南亞一些國家尤其多，全球報告病例數每年在16000以上，死亡5000例。目前對于乙腦使用的診斷方法有ELISA血清學檢測、血凝抑制試驗(HI)、RT-PCR核酸檢測等。但熒光定量PCR核酸檢測的方法還未曾使用，它不失為一種更直觀、準確、快速的適合早期診斷的檢測標準。
發明內容
本發明的目的在于提供一種乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法及乙型腦炎病毒檢測PCR體系，該方法能夠快速定性和定量檢測乙型腦炎病毒，包括一對特異性更高、 靈敏度高、重復性好的引物和探針。
為實現上述目的，本發明乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其中設計采用的引物探針為
權利要求
1.乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法中設計采用的引物探針為
2.如權利要求1所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法具體為1)設計引物探針；2)根據儀器選擇熒光素；3)合成引物和探針；4)制備陽性質粒標準品；5)運行PCR；6)數據分析；7)提取病毒RNA進行體系驗證。
3.如權利要求2所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 2)中熒光素的供選擇的熒光發射基團有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 熒光淬滅基團有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如權利要求2所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟4)中采取基因合成方式制作陽性質粒CBG2^-1作為陽性樣品將引物設計過程中篩選出的高保守區域bp5-bpl04前后分別延長5 50bp進行基因合成，然后將其克隆至pMD19_T 載體中，即為所述陽性質粒樣品，編號CBG2^-1。
5.如權利要求2所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟5)中熒光定量PCR反應適用于所有熒光定量PCR反應儀。
6.權利要求5中所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應儀包括SmartCyclerll、ABI實時PCR系統、BioRad實時PCR檢測系統、 Stratagene定量多聚酶鏈反應儀。
7.如權利要求2所述的乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 5)中最佳擴增條件為95°C 60s950C 5s 54。C 30s } 45 摘環。
8.—種乙型腦炎病毒檢測PCR體系，其特征在于，該體系包括引物或者其他能與乙型腦炎全長序列特異性結合并擴增的等同引物，其相似同源性不能超過90%，引物序列如下
9. 一種乙型腦炎病毒檢測PCR體系，其特征在于，該體系包括引物及能與乙型腦炎全長序列特異性探針，探針序列如下
能與乙型腦炎全長序列特異性結合并擴增的等同探針，其位點區域的覆蓋率不能超過 50 %，其同源性不能超過70 %。
全文摘要
本發明公布了一種乙型腦炎病毒熒光定量PCR檢測新方法及乙型腦炎病毒檢測PCR體系，由引物和探針、Premix Ex Taq反應液、滅菌Tris水組成，該引物和探針檢測特異性好，靈敏度高，非常適用于乙腦病毒，與登革熱病毒、黃熱病毒無交叉反應。
文檔編號C12N15/11GK102199673SQ20101060549
公開日2011年9月28日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者楊宇, 胡孔新, 王靜, 姚李四, 白琳 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院