專利名稱：埃博拉病毒熒光定量pcr檢測新方法及埃博拉病毒檢測pcr體系的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及埃博拉病毒的快速定性和定量檢測方法，提 供一對特異性引物和探針。
背景技術：
埃博拉病毒(Ebola virus, EB0V)能夠引起一種人畜共患傳染病，即埃博拉出血 熱(Ebola hemorrhagil fever，EBHF)，1976年在蘇丹南部和扎伊爾即現在的剛果(金)的 埃博拉河地區首次爆發，患者死亡率高達90%，引起醫學界的廣泛關注，埃博拉病毒由此得 名。埃博拉病毒感染性極強，可通過直接接觸感染者的體液或其他感染組織、皮膚潰破傷口 和飛沫等多種途徑傳播。感染者會出現嚴重的出血現象并導致休克綜合征。世界衛生組織 已經將EBOV列為對人類危害最嚴重的病毒之一，即第4級病毒，與其相關的試驗操作必須 在P4級實驗室中進行。目前用于埃博拉病毒的檢測方法已經有免疫組織化學檢查、血清學檢測、電鏡檢 查、病毒分離、RT-PCR核酸檢測、real-time RT-PCR核酸檢測，每種方法都有各自優勢與缺 陷，但熒光定量PCR核酸檢測的方法不失為公認的一種更直觀、更快速的一種適合早期診 斷的檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法及埃博拉病毒 檢測PCR體系，該方法能夠快速定性和定量檢測埃博拉病毒，包括一對特異性更高、靈敏度 高、重復性好的引物和探針。為實現上述目的，本發明埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法中設計采用的引物
探針為
權利要求
1.埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法中設計采用的引物探針為NameSequencePosition Tm°C Modification引物 1 CAAGGACTGATACAATATCCAACAG1025-1049 58引物 2 GAATTTGMATCACAGCATCGT1164-1185 5 7 探針TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG1052-1078 69 Texas Red/BHQ-2
2.如權利要求1所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法具體為1)設計引物探針；2)根據儀器選擇熒光素；3)合成引物和探針；4)制備陽性質粒標準品；5)運行PCR；6)數據分析；7)提取病毒RNA進行體系驗證。
3.如權利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 2)中熒光素的供選擇的熒光發射基團有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 熒光淬滅基團有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如權利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟4)中采取基因合成方式制作陽性質粒CBG233-4作為陽性樣品將引物設計過程中篩選出 的高保守區域bpl025-bpll85前后分別延長30 50bp進行基因合成，然后將其克隆至 PMD19-T載體中，即為所述陽性質粒樣品，編號CBG233-4。
5.如權利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟5)中Real-TimePCR反應適用于所有熒光定量PCR反應儀。
6.權利要求5中所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述熒 光定量PCR反應儀包括SmartCyclerll，ABI實時PCR系統、BioRad實時PCR檢測系統、 Stratagene定量多聚酶鏈反應儀。
7.如權利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 5)中最佳擴增條件為
8.一種埃博拉病毒檢測PCR體系，其特征在于，其中包括引物或者其他能與埃博拉全 長序列特異性結合并擴增的等同引物，其相似同源性不能超過90%，引物序列如下引物 1 (5,-3,):_CAAGGACTGATACAATATCCAACAG_引物 2 (5'-3') GAATTTGAAATCACAGCATCGT_-r --- ■ ■——---
9. 一種埃博拉病毒檢測PCR體系，其特征在于，其中包括引物及能與埃博拉全長序列 特異性探針，探針序列如下探針(5’-3,):_TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG""-‘■1 ‘“................................丨丨·.…. niniiiii-n—............. "'(“…...…”..............................1 丨丨丨丨丨丨-..............." """""能與埃博拉全長序列特異性結合并擴增的等同探針，其位點區域的覆蓋率不能超過 50 %，其同源性不能超過70 %。
全文摘要
本發明公開了一種埃博拉病毒熒光定量PCR檢測新方法及埃博拉病毒檢測PCR體系，由引物和探針、Premix Ex Taq反應液、滅菌Tris水組成，該引物和探針檢測特異性好，靈敏度高，非常適用于埃博拉病毒，與馬爾堡病毒無交叉反應。
文檔編號C12N15/11GK102140532SQ20101060551
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者孫肖紅, 徐寶梁, 楊宇, 王靜, 白琳, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院