專利名稱：雅致放射毛霉zgb1及其在微生物合成atp中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGBl，及其在微生物合成ATP中的應用。
背景技術：
ATP即腺苷三磷酸，作為一種生化藥物，已被用于肌肉萎縮、心肌梗塞、肝炎等和各種急救病癥的治療或輔助治療。目前國內外主要采用微生物轉化法生產ATP，具體有采用腺苷和腺嘌呤為前體原料的兩種主要生產方法。已經公開報道的采用腺嘌呤為前體原料的微生物轉化合成ATP的方法主要有日本協和發酵公司采用產氨桿菌(Cornebacterium ammoniagenes)轉化合成 ATP (Biosci. Boitechnol. Biochem.，65(3)，644 650，2001)；國內中山大學采用啤酒酵母轉化合成ATP (中山大學學報自然科學版，3，15 沈，1975)；詹谷宇等采用生香毛霉(Mucor armaticus)等7株毛霉菌轉化合成ATP (西北大學學報自然科學版，02，118 129，1980) 等，至今還沒有以腺嘌呤為前體原料采用雅致放射毛霉菌種轉化合成ATP的文獻或專利報道。腺嘌呤目前已經采用化學合成法大量生產，因此采用腺嘌呤為前體原料的生產方法，具有原料價格較低、來源豐富、合成ATP的理論轉化率較高等優點，以毛霉轉化合成ATP 還具有菌體培養基原料簡單，菌體容易分離等優點。
發明內容
本發明目的是提供一株篩選到的能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉 (Actinomucor elegans) ZGBl，及其在微生物合成ATP中的應用。本發明采用的技術方案是雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGB1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 郵編100101，保藏編號=CGMCC No. 4313，保藏日期:2010年11月8日。本申請發明人通過菌種培養搖瓶轉化，然后用紙電泳法測定轉化液中ATP含量的方法，篩選具有合成ATP能力的微生物時，篩選到了該菌種。在根據平板菌落特征、菌絲形態、產孢結構及孢子形態等對其鑒定的基礎上，結合18S rDNA序列分析對比(測序公司生工生物工程(上海)有限公司)，確定該菌為雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。至今未見有以腺嘌呤為前體原料采用雅致放射毛霉菌種轉化合成ATP的文獻或專利報道。本發明菌株的18S rDNA部分序列(SEQ ID No. 1)如下TAGGATTCCTCGTTGAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGTTTAC CCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGCTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGC ATCACAGACCTGTTATTGCCTAAAACTTCCTTCGGCTTGAAGCCGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAGATAGATAAATC TATTCACCAACTAAAAAGTTGGCCTGCCTATTTAGCAGAATAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAAT
3CACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCTAGAAAGAGCTTTCAATCTGTCAATCCTTACT ATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTC AATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGTCCCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAGATGCTGAGC CAGTCATAATAAACAGGCCCAATCTCTAGTCGGCATAGTTTGTGGTTAAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGA TCCCTTAACTTTAGACCTTGATCAATGAAAACGTCCTGGGTCAAATGCTTTCGCAGTAGTTTGTCTTCGGTCAATCC AAGAATTTCACCTCTAGCGACCAAATACAAATGCCCCCAACCGTTTCTATTCATCATTACTCAAGTTCCTGAACCAA CGAAATAGGGACTAGAGTCATATTTCATTATTCCATGCTAACACATTCAAGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCTG ATTTGCTCATGGTAATCATTTGGCTAGAGACTATAGGCGACCGAAGCCACCCATAGCATAACCAAATACAAAAGCCT CGGCAGAAGCGAGCTTGATCAATGAAGACCAGGCCACCTCGCCTAAAGGCTAAAGTTTGACTACGGACGTTTTAACT GCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCT CGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTGCAAGACCTTAAAGGCCCTGCATTGTTATTTATTGTCACTACCT CACCATGTCGGTATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCC GGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGTAGGCATTGTAAGCCTCTATCTTACAATCTCAACCATGATAGGGC AGAAAATCGAGTGGACCGTCGCCAGCACAAGGCCATGCGATCCGCTTAATTATTATGAATCACCAAGGGAAACTGGT TTTACCCAGCGTTGGCTTTATCTAATAAGTGCACCCCTTCCGAAGTCAGGGCTTTTTTGCATGTATTAGCTCTAGAA TTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGAATATGTCACGTAGATCATAACTGATTAATGAGCCATCGCA。ZGBl菌株形態特征及培養方法1.形態特征菌落形態(參見圖1 圖4)與一般毛霉近似，棉絮狀，氣生菌絲高度超過lcm， 初期為純白色，后逐漸轉為灰黃色，有匍匐菌絲和不發達的假根，孢囊梗直立，直徑10. 5 26. 3 μ m。主枝頂端有一較大的孢子囊，其下常有3 8個輪生分枝，每一分支頂端都生有孢子囊。孢子囊呈球形或洋梨形，表面絨毛狀，成熟后呈黑褐色，大小不一，直徑30 70 μ m0囊壁易消解，有囊領，囊軸圓形、卵圓形或梨形，表面光滑，大小不均，直徑Q5.0 60. 0) X 5 55. 0) μ m，大者可達67. 3 66. Iym0孢囊孢子呈短卵形和球形、略透明、 表面光滑，大小不均，大小為(10. 5 21. 0) X (7. 9 24. 0) μ m,大者可達28. 9X28. 9 Um0 孢囊孢子萌發時膨大，呈典型的單極萌發。能形成厚垣孢子。該菌最適生長溫度觀1，371生長受抑制，401幾乎不生長。2.采用的培養基固體斜面培養基1 馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。固體斜面培養基2:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂 20g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5。液體種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為 7jC, pH 6· 0 6· 5。發酵培養基葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5 2g/L，FeSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5。3.培養條件經^°C、3 4d培養的斜面菌種制成孢子懸液，以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養基中，置于^°C，160r/min旋轉式搖床中培養12h。以10% (V/V)的接種量將液
4體種子液接入發酵培養基中，置于，160r/min旋轉式搖床中培養12h，發酵結束。本發明還涉及所述的雅致放射毛霉ZGBl在微生物合成ATP中的應用。具體的，所述應用為以腺嘌呤為底物，以雅致放射毛霉ZGBl發酵獲得的菌體為酶源，于25 35°C下進行轉化反應6 M小時，反應結束后轉化液中ATP產物含量可以達到10g/L以上。按常規離交、濃縮、結晶等分離純化方法處理即可得到所述產物ATP。優選的，所述應用方法如下(1)雅致放射毛霉ZGBl接種至發酵培養基，28 30°C培養12 18小時，發酵液分離收集菌體，清洗、濾干后40 80°C恒溫干燥2 4小時，得到雅致放射毛霉ZGBl菌體； 所述發酵培養基終濃度組成為葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L， MgSO4 · 7Η20 0· 5 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L, K2HPO4 · 3H20 1 5g/L，pH 6. 0 6. 5 ；發酵結束后的發酵液經過濾收集的菌體先經通透化處理(即恒溫干燥箱40 80°C干燥處理2 4h)。由于毛霉菌過濾收集菌體非常方便，使用該通透化處理方法具有操作簡便、轉化活性高的特點，由于不需要在轉化反應液中添加二甲苯等處理方法， 還具有環保的優點；(2)取步驟(1)雅致放射毛霉ZGBl菌體與底物配制轉化反應液，于30 35°C下進行轉化反應6 M小時，反應結束后轉化液經后處理得到所述ATP ；所述轉化反應液初始組成如下葡萄糖 60 90g/L, Na2HPO4 · Iffl2O 30 90g/L, MgCl2 · 6H203 6g/L，腺嘌呤2 6g/L，毛霉菌體50 100g/L。反應Mi后，每隔池用紙電泳法跟蹤檢測轉化情況， 適時終止反應。反應液中的ATP可以達到10g/L以上，已有毛霉菌轉化文獻報道最高ATP 產率在8g/L左右。轉化反應產物分析及計算方法取樣5 20 μ L，點樣在20mm寬的普通濾紙上，以pH 2. 5的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液為緩沖液，電壓400V，電泳時間為30 60min。電泳結束后，用電吹風吹干濾紙，在紫外分析儀下描出與標準ATP斑點相同位置的產物斑點，將斑點剪成2mm左右的細條，用5ml 0. 01mol/L的HCl溶液在^°C，160r/min旋轉式搖床中浸提4h，測定浸提液在^Onm處吸光度(OD26tl),按摩爾吸光系數計算ATP產率。ATP產率計算公式ATP 產率=OD260 · MrATP · C/EATP式中MrATP為ATP分子量，C為稀釋倍數，Eatp為ATP摩爾吸光系數。轉化率，等于摩爾轉化率，數值等于實際ATP產率與理論ATP產率之比。本發明的有益效果主要體現在篩選獲得一株能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGBl，利用該菌株可以腺嘌呤為前體合成ATP，具有原料價格較低、來源豐富、菌體培養基原料簡單、菌體容易分離等優點，且轉化效率高在含有3g/ L以上腺嘌呤的反應液中能夠產生10g/L以上的ATP。
圖1為本發明菌株營養菌絲電鏡照片(10X4倍)圖2本發明菌株氣生菌絲電鏡照片(10X4倍)圖3本發明菌株呈總狀分枝的孢囊梗電鏡照片(10X 10倍)
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圖4本發明菌株囊壁開始消融的孢子囊電鏡照片(10X40倍)。 具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 雅致放射毛霉ZGBl (CGMCC No. 4313)接種至PDA斜面培養基，培養3 4d，以生理鹽水洗滌制成孢子懸液(約IO6 IO7CfuAiL)；孢子懸液以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養基(葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)中，置于 ，160r/min 旋轉式搖床中培養12h，得到液體種子液；液體種子液以10% (V/V)的接種量接入發酵培養基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L， 玉米漿 10g/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 2g/L, NH4Cl 3g/L, K2HPO4 · 3H20 3g/L，溶劑為水，pH 6.0 6. 5)中，置于觀1，1601·/!^!!旋轉式搖床中培養12h，發酵結束。發酵液經抽濾收集菌體，并用無菌水沖洗濾干，濾干菌體再經過恒溫干燥箱65°C 干燥池的細胞通透化處理，得毛霉菌體備用。轉化反應液組成葡萄糖90g/L，Na2HPO4 · 12H20 90g/L, MgCl2 · 6H20 4g/L，腺嘌呤 3g/L，毛霉菌體80g/L。上述配制的轉化反應液于33°C、160r/min旋轉式搖床中進行轉化反應，IOh時以 ATP · 2Na計的產量為11. 14g/L，摩爾轉化率可達91. 07%。實施例2 雅致放射毛霉ZGBl (CGMCC No. 4313)固體斜面培養基(葡萄糖20g/L，蛋白胨IOg/ L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)，培養3 4d，以生理鹽水洗滌制成孢子懸液(約IO6 107CfU/mL)；孢子懸液以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養基(葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)中，置于 ，160r/min 旋轉式搖床中培養12h，得到液體種子液；液體種子液以10% (V/V)的接種量接入發酵培養基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L， 玉米漿 10g/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 2g/L, NH4Cl 3g/L, K2HPO4 · 3H20 3g/L，溶劑為水，pH 6.0 6. 5)中，置于觀1，1601·/!^!!旋轉式搖床中培養12h，發酵結束。發酵液經抽濾收集菌體，并用無菌水沖洗濾干，濾干菌體再經過恒溫干燥箱60°C 干燥池的細胞通透化處理，得毛霉菌體備用。轉化反應液葡萄糖90g/L，Na2HPO4 · 12H20 90g/L, MgCl2 · 6H20 4g/L，腺嘌呤 4g/ L，毛霉菌體80g/L。上述轉化反應液于33°C、160r/min旋轉式搖床中進行轉化反應，反應20h時 ATP · 2Na 產量為 13. 64g/L, ATP · 2Na 的摩爾轉化率 83. 63%。
權利要求
1.雅致放射毛霉(Actinomucorelegans) ZGB1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號:CGMCCNo. 4313，保藏日期2010年11月8日。
2.如權利要求1所述的雅致放射毛霉ZGBl在微生物合成ATP中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用為以腺嘌呤為底物，以雅致放射毛霉ZGBl發酵獲得的菌體為酶源，于25 35°C下進行轉化反應6 M小時，轉化液經后處理得到所述ATP。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用如下(1)雅致放射毛霉ZGBl接種至發酵培養基，28 30°C培養12 18小時，發酵液分離收集菌體，清洗、濾干后40 80°C恒溫干燥2 4小時，得到雅致放射毛霉ZGBl菌體； 所述發酵培養基終濃度組成為葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L， MgSO4 · 7Η20 0· 5 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L, K2HPO4 · 3H20 1 5g/L, pH 6. 0 6. 5 ;(2)取步驟(1)雅致放射毛霉ZGBl菌體與底物配制轉化反應液，于30 35°C下進行轉化反應6 M小時，反應結束后轉化液經后處理得到所述ATP ；所述轉化反應液初始組成如下葡萄糖 60 90g/L, Na2HPO4 · Iffl2O 30 90g/L, MgCl2 · 6H203 6g/L，腺嘌呤 2 6g/L，雅致放射毛霉ZGBl菌體50 100g/L。
全文摘要
本發明提供了一株能夠合成ATP的新菌株——雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1及其應用。該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No.4313，保藏日期2010年11月8日。本發明有益效果主要體現在利用該菌株可以腺嘌呤為前體合成ATP，具有原料價格較低、來源豐富、菌體培養基原料簡單、菌體容易分離等優點，且轉化效率高在含有3g/L以上腺嘌呤的反應液中能夠產生10g/L以上的ATP。
文檔編號C12N1/14GK102154117SQ20101061570
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者朱家榮, 楊光輝, 楊善巖 申請人:浙江工業大學