專利名稱：納米硒小分子微生物多糖及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用物理分散、修飾的方法處理經微生物發酵、小分子化后獲得的細菌多糖而制備新的活性更高的多糖衍生物，具體屬于一種納米硒小分子微生物多糖及其生產方法與應用。
背景技術：
近年來，微生物多糖作為一類極具開發潛力的生物活性物質備受世人矚目，從屬 于真菌類的靈芝多糖、香菇多糖到屬于細菌類的黃原膠、乳酸菌胞外多糖等，已經開發了多種微生物多糖產品。其中，很多多糖類產品被用作食品添加劑、增稠劑、懸浮劑和化工凝固齊U、潤滑劑、絮凝劑等，廣泛應用于醫藥、食品、石油、輕工及化工等多個領域，也有一部分生物多糖具有抗腫瘤、提高機體免疫力作用而被用作免疫增強劑、抗氧化、抗癌藥物等應用于保健品、醫藥等領域。然而，天然的微生物多糖一般具有分子量大、難于溶解及生物活性(增強免疫力、抗氧化活性及抗腫瘤活性等)較低等缺陷，極大的限制了其在醫藥領域的應用。因此，對微生物多糖進行修飾改性以提高其溶解度及生物活性逐漸成為近年來的研究熱點之一，目前國內外對微生物多糖的修飾改性主要集中在多糖的小分子化、硫酸酯化、磷酸化、羧甲基化、燒基化、砸化等方面。含硒多糖是一類由無機硒和多糖通過多種硒化方式結合形成的具生物活性的復合物。作為一種新型的有機硒復合物，含硒多糖對多種癌癥都有療效，如肺癌，乳腺癌，卵巢癌，惡性胸腺瘤，膽囊癌，食道癌以及膀胱癌等。比起單獨使用硒或者多糖，含硒多糖的療效更為顯著且毒副作用更小，進年來對含硒多糖抑瘤活性的研究已經成為大家關注的焦點。同時，有科學家提出其潛在抑制腫瘤細胞生長的分子機制可能包括過抗氧化，促進癌細胞調亡，阻斷癌細胞周期，增強機體免疫力等，含硒多糖在癌癥預防及治療領域具有更加明顯的優勢及更好的應用前景。含硒多糖主要有天然存在的含硒多糖、通過培養基中添加硒產生的富集硒多糖、利用化學方法使多糖被亞硒酸、氯氧化硒等硒化產生硒化多糖以及利用納米技術獲得納米硒并與多糖復合形成的納米硒多糖等。其中，納米硒多糖因具備較大的生物學活性和極低的細胞毒性而成為目前硒化多糖的研究焦點。納米硒即零價硒，最初是由我國科學家以蛋白質的酰胺平面為吸引源及分散物質而制得的紅色納米顆粒，其生物功能優異甚至勝過有機硒，毒性劑量遠遠小于其他價態的硒，納米硒可殺傷人白血病細胞、人肺癌細胞、肝癌細胞等，具有良好的抗腫瘤、增強免疫力、護肝保健的作用。綜上所訴，目前已有開發報道的多糖很多，其中絕大多數為真菌多糖，受資源限制較為明顯；具有生物學活性的細菌多糖較少，但產量比真菌多糖要高；對微生物多糖進行小分子化與修飾改性已經成為目前多糖領域的研究熱點，也開發出一些經過修飾的多糖產品，但多存在多糖產量偏低、修飾過程復雜等缺陷。因此，開發一種產量高、制備工藝簡便、生物活性較強而毒副作用小的多糖產品是很有必要的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有較強免疫活性、抗腫瘤活性的納米硒小分子微生物多糖，其生產方法簡單、原料廉價且無毒；這種納米硒小分子微生物多糖能夠用于制備提高免疫功能、抗腫瘤的藥品及保健品。本發明提供的一種納米硒小分子微生物多糖(Nano-Se-LREPS)，采用通過包括如下步驟的方法制得
(I)取分子量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成5 7mg/mL (優選6mg/mL)的多糖溶液；同時配制50 70mg/mL (優選60mg/mL)的維生素C (簡稱，Vc)溶液和50 70 ii g/mL(優選60 u g/mL)的SeO2溶液；(2)取上述LREPS和Vc溶液混合，磁力攪拌25 35min使其充分混合均勻；將SeO2溶液緩慢加入，邊滴邊攪拌；而后加入超純水；所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0.05 0.15 I. 2 2. 8 2 3，優選為I : 0. 08
0.12 I. 6 2. 4 2. 5 ；(3)上述體系在超聲狀態下反應5 lOmin，使硒顆粒分散均勻；(4)將反應體系用超純水透析24 36h,直到檢測透析外液中沒有硒為止；(5)冷凍干燥，得納米硒小分子微生物多糖產品。所述的LREPS，是將錦雞爾根瘤菌胞外多糖(可按照專利號ZL 200510048129. O制備)經過微波福照氧化降解處理(見文獻魏國琴等，小分子Rhizobium sp. N613胞外多糖的制備及其抗腫瘤活性，微生物學通報，2011，38 (5) :743-749)，獲得的分子量約為7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖。所述步驟(I)中的LREPS的分子量優選為9 13KD。所述的Nano-Se-LREPS可以在制備抗癌藥物中的應用，也可以在在制備保健品中的應用。本發明Nano-Se-LREPS經過透射電鏡及掃描電鏡檢驗，表明其中的硒以納米硒顆粒形態存在，且均勻分布于多糖之中，多糖的形態也較修飾前發生了較大的改變；粒徑分布檢測表明Nano-Se-LREPS中的硒顆粒平均粒徑約為380nm ;動物試驗證明Nano-Se-LREPS具有很強的抗腫瘤活性，對小鼠S180肉瘤抑瘤率可達到70 %以上(同等劑量下LREPS的抑瘤率為52%左右)，且對動物臟器有明顯的保護作用。本發明Nano-Se-LREPS可作為免疫增強劑、抗腫瘤藥物等被開發應用于醫藥、保健品等領域。本發明所采用的檢測方法(I)多糖含量測定苯酚硫酸法。(2)分子量測定凝膠過濾層析法。 (3)硒含量測定比色法。(4)粒徑分布采用激光粒徑分布儀結合投射電鏡觀察、測定。(5)多糖表觀結構采用掃描電鏡觀察。與現有技術相比本發明有以下優點和效果本發明涉及的原料錦雞爾根瘤菌胞外多糖具有生產速度快、質量穩定及價格較低等特點，利用本發明的方法生產的Nano-Se-LREPS硒含量可達15. 2 16. 4 y g/mg，硒顆粒平均粒徑為380nm左右，多糖收率達到70%以上。與目前同類技術產品相比，質量穩定、成本較低，具有較強的競爭優勢。Nano-Se-LREPS具有較高的腫瘤生長抑制率，在較小劑量下即可對小鼠S180肉瘤產生70%以上的抑瘤率，具有誘人的應用前景。
圖INano-Se-LREPS透射電鏡照片圖2Nano-Se_LREPS掃描電鏡照片
具體實施例方式實施例I(I)取分子量11. 4KD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液 (2)取上述LREPS溶液20mL、Vc溶液2mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和成均一體系。(3)將48mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入超純水50mL。(4)上述體系在超聲狀態下反應5min。(5)將反應體系用超純水透析30h,檢測透析外液中不再有硒析出。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為16. 2 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為380nm。納米硒小分子微生物多糖經過透射電鏡及掃描電鏡檢驗，表明其中的硒以納米硒顆粒形態存在，且均勻分布于多糖之中(見附圖I)，多糖的形態也較修飾前發生了較大的改變(見附圖2)。實施例2(I)取分子量約11. OKD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液(2)取上述LREPS溶液20mL和Vc溶液I. 6mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和 成均一體系。(3)將32mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入超純水50mL。(4)上述體系在超聲狀態下反應7min。(5)將反應體系用超純水透析，直到檢測透析外液中沒有硒為止。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為15. 2 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為370nmo實施例3(I)取分子量約10. 2KD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液。(2)取上述LREPS溶液IOmL和Vc溶液I. 2mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和成均一體系。
(3)將20mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入純水25mL。(4)上述體系在超聲狀態下反應lOmin。(5)將反應體系用超純水透析,直到Vc檢測透析外液中沒有硒為止。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為16. 4 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為380nm。實施例4有關Nano-Se-LREPS的抗腫瘤動物試驗實施例如下 (I)建立荷瘤小鼠模型昆明小鼠每組20只，全部為雌性小鼠，隨機分組。分成I、
3、5、10mg/lg劑量組和陰性、陽性對照組。抽取肝癌S180的腫瘤鼠的腹水，以生理鹽水配制成濃度為IO6個/mL的腫瘤細胞懸液，在小鼠左腋皮下接種0. 2mL，建立荷瘤小鼠模型。(2)給藥分別按分組劑量給小鼠腹腔注射Nano-Se-LREPS，給陰性對照組注射生理鹽水，陽性對照組注射環磷酰胺，連續注射10天。(3)抑瘤率及臟器指數測定與計算處死腫瘤試驗小鼠，以實體瘤重法表征抑瘤率；測定和計算臟器指數，結果見下表。表I.不同劑量Nano-Se-LREPS (硒含量16. 2 ii g/mg)對S180荷瘤小鼠瘤重及臟
器指數的影響
劑量體重增加值胸腺指數~脾指數 *抑瘤率
(mg/kg)fe)__(mg/g)(mg/g)__怖里⑶(%)
陰性對照組5.36±0.40 1.67±0.226.18±0.25 1.34±0.08O
陽性對照組(Cy)- 20" 3.87±0.41**~ 0.78士0.07**~6.55±0.12** 0.53士0.08*廠60.4
I4.88士1.00 1.92士 0.07**7.6U0.19* 0.87±0.05*35.1
34.97士0.732.11士 0.158.01±0.12** 0.65 士 0.13* 51.5
Nano-Se-LREPS------
56.10±0.902.24±0.18** 8.43±0.28* 0.39±0.02** 70.9
10 5.90±0.462.10士0.07** 8.02±0.14** 0.38士0.05* 71.權利要求
1.一種納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，采用通過包括如下步驟的方法制得 (1)取分子量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成5 7mg/mL的多糖溶液；同時配制50 70mg/mL的維生素C溶液和50 70 y g/mL的SeO2溶液； (2)取上述多糖溶液和維生素C溶液混合，磁力攪拌25 35min使其充分混合均勻；將SeO2溶液緩慢加入，邊加入邊攪拌；而后加入超純水；所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0.05 0.15 12 2. 8 2 3; (3)上述體系在超聲狀態下反應5 IOmin； (4)將反應體系用超純水透析，直到檢測透析外液中沒有硒為止； (5)冷凍干燥，得納米硒小分子微生物多糖產品。
2.按照權利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(I)取分子 量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成6mg/mL的多糖溶液；同時配制60mg/mL的維生素C溶液和60 u g/mL的SeO2溶液。
3.按照權利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(2)中所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0. 08 0. 12 I. 6 2.4 2. 5。
4.按照權利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(I)中的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖的分子量為9 13KD。
5.按照權利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖在制備抗癌藥物中的應用。
6.按照權利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖在制備保健品中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種納米硒小分子微生物多糖，是采用小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖為原料，經均勻分散后與二氧化硒及還原劑共同作用，在超聲條件下制備而成。具體生產方法配制合適濃度的小分子細菌多糖溶液，小分子錦雞爾根瘤菌多糖與維生素C混合均勻，混合體系中緩慢滴加二氧化硒，超聲分散反應，透析，冷凍干燥。通過該制備工藝制備的納米硒小分子微生物多糖產品，其硒含量可達15.2～16.4μg/mg，硒顆粒平均粒徑為380nm左右，多糖收率達到70％以上。經小鼠試驗表明，該納米硒小分子多糖具有良好的抗癌活性，可在制備抗癌藥物、保健品中應用。
文檔編號A23L1/09GK102643361SQ20121012462
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者呂利華, 趙良啟, 魏國琴 申請人:山西大學