專利名稱：一種人41型腺病毒(Ad41)包裝細胞株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因治療和重組疫苗領域中一種腺病毒Ad41的包裝細胞及其應用。
背景技術：
腸道作為基因治療的靶器官有諸多優點(a)給藥方式簡便，可以直接口服給藥或選擇內窺鏡給藥；(b)腸道上皮的表面積大，便于載體的充分吸附和感染；(c)腸道上皮的隱窩細胞是干細胞，對其的感染能延長目的基因的表達時間(Croyle MA, Stone M, Amidon GL, Roessler BJ. In vitro and in vivo assessment of adenovirus41 as a vector for gene delivery to the intestine. Gene Ther，1998，5(5) :645-654. [pubmed 9797869])。粘膜是多數病原微生物入侵機體的第一道屏障，口服給藥的疫苗能激發粘膜免疫和系統免疫，是今后疫苗研究的重要方向。腺病毒載體(Adenovector，Ad)由于具有遺傳穩定、感染細胞效率高、不整合入細胞基因組(安全性好)等優點被廣泛用于基因治療和重組疫苗研究。人F組腺病毒包括Ad40和Ad41兩個成員，能引起嬰幼兒急性胃腸炎，是天然的腸道病原，被稱為腸腺病毒(entericadenovirus)(Tiemessen CT, Kidd AH. The subgroup F adenoviruses. J Gen Virol, 1995, 76 (Pt 3) :481-497. bubmed :7897343])。研究表明 Ad41 對胃酸和腸消化液有很強的耐受性，對分化的腸上皮細胞感染能力強，是理想的用于腸道給藥的基因治療載體(Favier AL, Burmeister WP, Chroboczek J. Unique physicochemical properties ofhuman enteric Ad41 responsible for its survival and replication in thegastrointestinal tract. Virology,2004,322 (1) :93-104. bubmed : 15063120])。前期研究中，發明人從嬰幼兒腹瀉標本中分離到一株野生型Ad41病毒，以其基因組DNA為基礎，構建了穿梭質粒pSh41-CMV和骨架質粒pAdbone41。利用這2個質粒，能夠構建攜帶目的基因的重組Ad41質粒，腺病毒質粒經限制性內切酶RiieI線性化后，轉染 ^3E12包裝細胞，能夠拯救和擴增重組Ad41病毒。但 3E12的病毒包裝能力較弱，重組病毒需要擴增10-12代，病毒產量才能達到IO12顆粒(viral particles, vp) (Lu ZZ, Zou XH, Dong LX, Qu JG, Song JD, Wang M, Guo L, Hung T. Novel recombinant adenovirus type 41vector and its biological properties. J Gene Med,2009,11(2) 128-138. [pubmed 19097028])。293細胞是腺病毒Ad5El區轉化的人胚腎細胞，組成型表達Ad5El基因(包括 ElA, E1B19K和E1B55K)。腺病毒E1B5^(蛋白具有型特異性，Ad5的E1B5^(不能完全替代 Ad41ElB55K的生物功能，野生型Ad41在293細胞復制困難，El區缺失的重組Ad41載體無法在293細胞拯救和包裝。^3E12包裝細胞是表達Ad41 E1B5^(的293細胞，如果進一步提高Ad41 E1B55K 表達量，有可能提高Ad41病毒包裝效率。腺病毒晚期基因mRNA的5’非翻譯區含有一段共有序列，它來源于主要晚期啟動子下游的3個外顯子，被稱為三聯體前導序列 (tripartiteleader sequence, TPL)，TPL 有利于病毒晚期 mRNA 的轉運和翻譯(Huang W,Flint SJ. The tripartite leader sequence of subgroup Cadenovirus major late mRNAs can increase the efficiency of mRNAexport. J Virol,1998,72(1) :225-235. [pubmed :9420219] ；Dolph PJ, Racaniello V, Villamarin A, Palladino F, Schneider RJ. Theadenovirus tripartite leader may eliminate the requirement forcap-binding protein complex during translation initiation. J Virol,1988,62 (6) :2059-2066. [pubmed :2835510])。研究表明，如果將TPL添加于啟動子和目的基因編碼區之間，轉錄后 TPL位于目的基因mRNA 5’非翻譯區，這樣能夠提高目的基因的表達量(Sheay W, Nelson S, Martinez I,Chu ΤΗ, Bhatia S, Dornburg R. Downstreaminsertion of the adenovirus tripartite leader sequence enhancesexpression in universal eukaryotic vectors. Biotechniques，1993，15(5) :856-862. [pubmed :8267981])。
發明內容
本發明中，發明人克隆了 Ad41的TPL，將其插入到pcDNA3-ElB5^(載體的CMV啟動子和Ad41 E1B5^(基因之間，構建了新的Ad41 E1B5^(表達載體；轉染293細胞，篩選建立了 1株新的包裝細胞^3TE7。相對^3E12，293TE7細胞對重組Ad41 DNA的拯救能力提高了 23倍，重組病毒包裝能力提高了 8-13倍。在一個實施方案中，本發明提供了一種腺病毒Ad41包裝細胞株^3TE7，其于2010 年10月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所(郵編100101)，其保藏號為CGMCC No. 4M8，分類命名為人胚腎細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了一種Ad41 E1B55K真核表達質粒 PCDNA3TPL-E1B55K，其特征在于在pcDNA3質粒的多克隆位點處插入腺病毒Ad41的三聯體前導序列TPL、腺病毒Ad41 E1B5^(基因。優選地，其中TPL位于CMV啟動子和Ad41 E1B55K 基因之間。在一個優選的實施方案中，上述的真核表達質粒PCDNA3TPL-E1B55K的Ad41 E1B55K基因來源于人腺病毒Ad41。在另一個實施方案中，本發明提供了一種包含上述真核表達質粒 PCDNA3TPL-E1B55K的腺病毒Ad41包裝細胞株，優選地所述細胞為293細胞。。在另一個實施方案中，本發明提供了一種構建上述的包裝細胞株的方法，其特征在于包括下述步驟(1)以上述質粒pcDNA3TPL_ElB5^(轉染四3細胞；(2)以G418篩選持續、穩定、高水平表達Ad41 E1B55K的293細胞；(3)挑取陽性細胞進行克隆、擴增培養，選擇重組Ad41包裝能力強的克隆化細胞持續培養作為野生型或重組Ad41包裝細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了一種使用上述方法構建的包裝細胞株。在另一個實施方案中，本發明提供了一種生產重組腺病毒Ad41的方法，使用前述任一種包裝細胞株。在一個優選的實施方案中，所述真核表達質粒pcDNA3TPL_ElB5^(被穩定整合到前述包裝細胞的染色體上。
在另一實施方案中，本發明提供了一種生產重組腺病毒Ad41的方法，其中使用了上述的包裝細胞株。利用本包裝細胞株能夠拯救或擴增El區缺失的重組Ad41腺病毒。采用DNA轉染或病毒感染的方式將重組病毒的基因組運輸到包裝細胞的細胞核，重組Ad41基因組缺失El區(包括E1A，E1B19K和E1B55K基因)，而包裝細胞表達Ad5 E1A、Ad5 E1B19K和 Ad41ElB55K能夠替代Ad41 El的功能，結果重組病毒基因組復制，結構蛋白表達，在細胞內包裝形成完整的具有感染性的Ad41病毒顆粒。由于Ad41是天然的腸道病原，預計本發明產生的重組Ad41病毒在腸道基因治療和口服重組疫苗研究中有廣闊的應用前景。
圖1是Ad41 E1B55K真核表達質粒pcDNA3TPL_ElB5^(構建示意圖。圖中Amp 氨芐青霉素抗性開放讀碼框(ORF) ；CMVp 巨細胞病毒啟動子；TPL :Ad41三聯體前導序列；Ad41 E1B55K :Ad41ElB55K ORF ；pAl :BGH多聚 A信號；SV40p :SV40 啟動子；Neo 新霉素抗性 ORF ； pA2 :SV40 多聚 A 信號；ColEl =ColEl 起點。圖2是熒光顯微鏡觀察攜帶GFP報告基因的重組Ad41病毒(Ad41_GFP)在克隆化細胞的復制。293TE克隆化細胞傳代到M孔板，1天后，各孔接種5X IO5Vp (viral particle)的Ad41_GFP病毒，接毒后7天和9天熒光顯微鏡觀察并照相，這里給出的是 293TE7，293TE14，293TE15 和 293TE17 的結果。圖3是^3TE7細胞與^3E12細胞比較病毒包裝能力的結果。拯救或擴增的子代病毒利用293細胞測定感染滴度。限制性內切酶RiieI線性化的重組病毒質粒pAd41_GFP 轉染^3TE7、293E12或293細胞，結果顯示^3TE7細胞拯救產生的病毒約為^3E12的23 倍，而293細胞中未檢出重組病毒(A)；當用5 X IO5Vp的重組病毒AcMl-GFP感染IX IO5包裝細胞時，在感染7-9天后，293TE7細胞產生的子代病毒數量為^3E12細胞的8_13倍，比 293細胞產生的病毒量高IO4倍(B)。圖4是免疫熒光檢測 3TE7細胞中Ad41 E1B5^(表達的結果。結果顯示^3TE7細胞中Ad41 E1B5^(表達水平明顯高于細胞，而對照293細胞不表達Ad41 E1B55K。
具體實施例方式本文涉及的pcDNA3-ElB5^(質粒、pAd41_GFP質粒、純化的重組Ad41_GFP病毒和 ^3E12細胞由前期工作構建或保存，請見中國發明專利(魯茁壯，屈建國，洪濤。復制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統及其應用，申請號200810U6855. 3，申請日期2008年7月1 日；具體參見說明書第8頁第1段關于pcDNA3-ElB5^(質粒的構建，說明書第9頁第2段關于pAd41-GFP質粒的構建，說明書第8頁實施例4重組腺病毒Ad41_GFP的制備，以及說明書第7頁實施例3包裝細胞系的構建，以上內容通過引用的方式納入本文)或文獻(LuZZ, Zou XH, Dong LX, Qu JG, Song JD, Wang M, Guo L, Hung T. Novel recombinant adenovirus type 41 vector and its biologicalproperties. J Gene Med,2009,11(2) 128-138. [pubmed :19097028]，以上內容通過引用的方式納入本文)實施例1、Ad41 E1B55K真核表達質粒pcDNA3TPL_ElB55K的構建
l)Ad41 TPL 的克隆Ad41-GFP為攜帶GFP基因的重組Ad41病毒。指數生長的^3E12細胞接種25cm2 培養瓶，培養基為含有8%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的DMEManvitrogen公司)，1天后接種AcMl-GFP病毒2 X IO8Vp ；感染48小時后，去除培養基，以5ml IOmM磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌細胞1次，添加TRIzol (Invitrogen公司)lml，按TRIzoI說明書操作提取細胞 RNA。使用引物 tpl-R2(SEQ ID NO 1 :agcatggcct cctcgtca)用 AMV 逆轉錄酶(Promega 公司)將RNA逆轉錄為cDNA (依據AMV逆轉錄酶說明書操作)。使用tpl_Fl (SEQ IDNO 2 actttcttcc gcatcgctgt)和 tpl-R2 為引物，以 KOD-Plus 耐熱 DNA 聚合酶(Toyobo 公司) 進行第1輪PCR擴增；反應體系為滅菌水32 μ 1，IOXPCR緩沖液5 μ l，2mM dNTP 5μ 1, 25mM MgSO4 2 μ 1，引物(10 μ Μ)各 1· 5 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1, KOD-plus DNA 聚合酶 1μ 1，共計 50μ 1。反應條件為94°C 2min ； 94 °C 30s, 55 °C 30s, 68 °C 30 s，30 個循環；68°C 5min。 以第一輪 PCR 產物為模板，再使用 tpl-Fl 和 tpl-Rl(SEQ ID NO 3 :cgcatctgtc gcaacacc) 為引物，進行第2輪PCR擴增(反應體系和反應條件同第一輪反應)。第2輪PCR反應結束后，添加重組iTaq DNA聚合酶(Takara公司)1 μ 1 (5U)，72度保溫lOmin，以便在PCR產物3， 端添加A。加A后的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，利用DNA凝膠回收試劑盒(Takara公司)回收。將回收的PCR產物克隆到pMD18_T載體(Takara公司)中，得 pMD-TPL 質粒。具體步驟為:pMD18-T 載體 1 μ 1 (50ng)，PCR 產物 1 μ 1 (15ng)，滅菌水 3 μ 1， Solution I 5μ 1(DNA連接試劑盒，Takara公司)；16°C連接3小時，取5 μ 1轉化T0P10感受態細菌(Tiangen公司)，挑取3個菌落，用液態LB培養基擴大培養后，保存菌種，提取質粒pMD-TPL。對插入片段進行測序，測序結果與Ad41基因組序列比對，可知Ad41 TPL序列為SEQID NO :4 中所示的序列(Genbank accession no. HM565136)。2)將 Ad41 TPL 插入 pcDNA3_ElB55K 質粒 CMV 啟動子下游以 pMD-TPL 為模板，添力口弓丨物 0901TPL_F3(SEQ ID NO 5 :ccccaagctt actttcttcc gcatcgctgt)和 0901TPL-R3(SEQ ID NO 6 :ccccaagctt gcgactgtga ttggctcgat), 以 KOD-Plus擴增TPL序列，所得PCR產物(220bp)經瓊脂糖凝膠電泳后回收，方法同步驟 1)。取PCR產物200ng, HindIII限制性內酶切酶IOU(Takara公司)，反應緩沖液4ul,并補加水至40ul，于37°C酶切3小時，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收210bp條帶；取 pcDNA3-ElB55K質粒500ng, HindIII酶10U,以40 μ 1酶切體系于37°C酶切3小時，補加牛小腸堿性磷酸酶CIP(NEB公司)0. 2 μ 1，于37°C繼續保溫15min，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收約6. 8kb條帶。上述210bp和6. 8kb DNA片段各取2 μ 1，補加4μ 1滅菌水和Solution I 8μ 1(DNA連接試劑盒，Takara公司)，16°C連接2小時，取5μ 1轉化 Τ0Ρ10感受態細菌，挑取菌落，擴大培養，提取質粒pcDNA3TPL-ElB55K(參見圖1)。在質粒 pcDNA3TPL-ElB55K 中，TPL 位于 CMV 啟動子和 Ad41 E1B55K 基因之間。實施例2、293TE克隆化細胞株的建立和篩選1) 293TE克隆化細胞的建立對數生長的293細胞接種6孔細胞培養瓶，添加含8 %胎牛血清(FBS，Hyclone 公司)的DMEM培養基anvitrogen公司)^iil/孔，于37°C下和飽和濕度下培養。1天后， 將4μ g pcDNA3TPL-ElB55K質粒添加到250 μ 1無血清DMEM培養基中，將10 μ 1脂質體 (Lipofectamine2000, Invitrogen公司)添加到所述250 μ 1無血清DMEM培養基中，2者混勻后室溫靜置20min，再直接添加到含293細胞的6孔板的1個孔中，混勻后繼續培養。轉染1天后，使用含0. 胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液(PBS)消化細胞，取1/100或1/1000的細胞接種于直徑IOcm的細胞培養皿中，每皿添加含G418(終濃度0. 8mg/ml)的8% FBS DMEM IOml, 5-7天換液1次，篩選10-14天；挑取20株克隆化細胞，擴大培養并凍存，分別命名為 293TE1-293TE20。2) 293TE克隆化細胞的篩選對數生長的^3TE1_293TE20傳代到M孔板中，密度為1 X IO5細胞/孔，每株細胞傳2孔；配制含AcMl-GFP病毒1 X 106vp/ml的2% FBS DMEM培養基，棄去M孔板中原有培養基，添加新配制的含重組病毒的培養基0. 5ml/孔，培養5天后，更換1次2% FBS DMEM培養基，繼續培養5天。每2-3天熒光顯微鏡觀察各孔熒光細胞數量和熒光強度的變化(部分克隆的代表性結果如圖2所示)，以此作為病毒復制強弱的指標，GFP+細胞多、熒光強說明病毒復制強。記錄熒光細胞數量較多孔的編號，最終篩得3株產毒能力較強的克隆化細胞^3TE7J93TE12和^3TE20，其中^3TE7的產毒能力最強。實施例3J93TE7病毒拯救和病毒包裝能力的定量分析1) 293TE7與^3E12病毒拯救能力的比較腺病毒質粒pAd41-GFP 15 μ g，限制性內切酶RneI 25U(NEB公司)，10X酶切緩沖液20 μ 1，以200 μ 1體系酶切6小時。采用酚-氯仿法抽提質粒，乙醇沉淀回收 DNA。將^3ΤΕ7、293Ε12和四3細胞分別傳代到6孔板中，1天后，按照脂質體使用說明書(Lipofectamine2000，hvitrogen 公司)操作，將 PmeI 酶切線性化的 pAd41-GFP 轉染 293TE7J93E12和293細胞(具體步驟同實施例2第1)部分)。轉染1天后，將培養基更換為2% FBS DMEM，繼續培養10天(第5天換液1次)。將培養物于_80°C和室溫之間凍融3 次，以12000g離心2分鐘去除細胞碎片，將上清利用293細胞測定病毒感染滴度。如圖3A 所示，293TE7產生的重組Ad41-GFP病毒滴度是^3E12細胞的23倍，而在轉染pAd41_GFP 的293細胞中未檢出重組病毒。病毒感染滴度的具體測定方法如下對數生長的293細胞按照1. 5 X IO4細胞/孔接種96孔細胞培養板，每孔含100 μ 10% FBS DMEM培養基，培養18- 小時。病毒液用 2% FBS DMEM培養基進行10倍梯度稀釋，稀釋IO1-IO6倍，每孔取100μ 1病毒稀釋液添加到 96孔板中，每個稀釋度添加8個孔(96孔板中的1列)。培養2天后，熒光顯微鏡下觀察， 先確定適宜的稀釋度(每孔約5-50個GFP+的綠色熒光細胞)，計數該稀釋度下各孔GFP+ 細胞個數，得出單個孔的均數，病毒原液的感染滴度(IU/ml)計算公式為單孔GFP+細胞個數/每孔添加的病毒稀釋液體積(0. lml) X稀釋倍數。2)293TE7與^3E12、293細胞病毒包裝能力的比較對數生長的^3TE7、293E12和293細胞按照1 X IO5細胞/孔的密度分別傳代到2 塊M孔板中，每塊培養板中每株細胞傳6個孔；繼續培養18- 小時后，將純化的Ad41-GFP 病毒用2% FBS DMEM稀釋為1 X 106vp/ml，并且去除培養板中原有培養液，加入病毒稀釋液 0. 5ml，每株細胞感染3孔，另3孔補加2% FBS DMEM 0. 5ml作為對照。于感染后7天或9 天，分別將培養板直接轉移到-80°C下。培養物凍融3次，離心去除細胞碎片，上清利用四3 細胞測定子代病毒感染滴度(圖3B)。結果表明^3TE7包裝重組Ad41的能力約為^3E12 細胞的8-13倍，比四3細胞高IO4倍以上。
實施例4、免疫熒光檢測^3TE7細胞Ad41 E1B55K的表達將對數生長的^3TE7、293E12或四3細胞傳代于96孔板，繼續培養18- 小時后，去除培養基，用PBS洗滌1次；加入冰甲醇并于_20°C下固定15min，吸去固定液，用含
牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(1% BSA-PBS，漂洗液)洗滌2次，每次5min ；將抗Ad41 E1B55K小鼠抗血清用漂洗液1 100稀釋，每孔50 μ 1，室溫下振搖Ih;再用漂洗液洗滌3 次，每次5min;然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司) 室溫結合Ih (用漂洗液1 200稀釋)；再用漂洗液洗滌3次后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。結果如圖4所示，293TE7細胞中Ad41 E1B5^(表達量高于^3E12 Q93細胞不表達 Ad41 E1B5^()，這說明TPL有促進目的蛋白表達的作用，較高的Ad41 E1B5^(表達水平有利于提高^3TE7的病毒包裝能力。
權利要求
1.一種腺病毒Ad41包裝細胞株^3TE7，其保藏號為CGMCC No. 4248
2.一種Ad41 E1B55K真核表達質粒pcDNA3TPL_ElB55K，其特征在于在pcDNA3質粒的多克隆位點處插入腺病毒Ad41的三聯體前導序列TPL、腺病毒Ad41 E1B5^(基因。
3.權利要求2所述的真核表達質粒pcDNA3TPL-ElB55K，其特征在于TPL位于CMV啟動子和Ad41 E1B5^(基因之間。
4.權利要求2或3所述的真核表達質粒pcDNA3TPL-ElB55K，其特征在于所述Ad41 E1B55K基因來源于人腺病毒Ad41。
5.一種包含權利要求2或3所述的真核表達質粒pcDNA3TPL-ElB5^(的腺病毒Ad41包裝細胞株。
6.權利要求5所述的腺病毒Ad41包裝細胞株，其特征在于所述細胞為293細胞。
7.—種構建權利要求1所述的包裝細胞株的方法，其特征在于包括下述步驟(1)以權利要求2或3所述的質粒pcDNA3TPL-ElB5^(轉染293細胞；(2)以G418篩選持續、穩定、高水平表達Ad41E1B5^(的293細胞；(3)挑取陽性細胞進行克隆、擴增培養，選擇重組Ad41包裝能力強的克隆化細胞持續培養作為野生型或重組Ad41包裝細胞。
8.一種使用權利要求7所述方法構建的腺病毒Ad41包裝細胞株。
9.權利要求5、6或8所述的腺病毒Ad41包裝細胞株，其中所述真核表達質粒 pcDNA3TPL-ElB5^(被穩定整合到所述細胞的染色體上。
10.一種生產重組腺病毒Ad41的方法，其中使用了權利要求1、5、6、8或9所述的包裝細胞株。
全文摘要
本發明涉及基因治療和重組疫苗領域中一種人41型腺病毒(Ad41)的包裝細胞株及其應用，具體地說，本發明涉及一種人41型腺病毒(Ad41)包裝細胞株293TE7及其應用，該包裝細胞株穩定表達Ad41 E1B55K基因，可以用于包裝野生型Ad41或E1區缺失的重組Ad41。
文檔編號C12R1/91GK102533657SQ20101062298
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者洪濤, 王敏, 鄒小輝, 魯茁壯 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所