專利名稱：抗ckm單克隆抗體與產生其的雜交瘤細胞株以及其的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗人肌酸激酶M型亞基(Creatine Kinase M Type, CKM)的單克隆抗體和產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及該單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應用。 特別是涉及一種能特異性結合并抑制CKM亞基活性的單克隆抗體和產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及該單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應用。
背景技術：
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應。肌酸激酶活性測定對骨骼肌損傷和心肌損傷，特別是急性心肌梗塞的診斷具有非常重要的意義。肌酸激酶已知有兩個亞基M型(肌型)和B型(腦型)，兩兩組合而成 CK-BB、CK-MM和CK-MB三種同工酶。CK-BB主要存在于腦或腎等內臟器官中，CK-MM主要存在于骨骼肌及心肌等肌肉中，而CK-MB主要分布于心肌中。作為肌酸激酶同工酶之一的CKMB，由于在心肌中特異性地存在，因此，CKMB的測定在心肌梗塞的診斷中為特別有用的標記。已知在患急性心肌梗塞后3小時就可以發現血清內的CKMB升高，36小時后升高為100%。在臨床領域中，CKMB活性增高是心肌損傷的特異指標，對心肌梗塞早期診斷很有價值。對于CKMB活性的測定以往就提出了很多方法，目前廣泛采用的是免疫抑制法。這類方法是通過用抗體來抑制酶的部分酶活或部分同工酶的酶活，從而測得CKMB的活性。作為一般的測定方法，通常是將抑制CKM的抗體加入到雙試劑試劑盒中的試劑1中，該抗體可以完全抑制CKM亞基的活性而不影響CKB亞基的活性 (CKBB亞基的活性忽略不計)，將測得的CKB亞基的活性乘以2即為CKMB的活性。因此，基于免疫抑制法的原理，CK-MB檢測試劑盒中的抗體需要具有較好的特異性。非專利文獻1中公開了一種抗CKM單克隆抗體的制備方法，該方法用CKMB全酶作為免疫小鼠與陽性細胞株檢測的抗原，然后根據酶活抑制情況進一步篩選(參見非專利文獻1) O專利文獻1中也提出了一種抗CKM的單克隆抗體及其制造方法。該抗CKM的單克隆抗體為與肌酸激酶反應，阻礙CKMB活性的抗體。(參見專利文獻1)。非專利文獻1 一種骨骼肌肌酸激酶單克隆抗體(A monoclonal antibody against the skeletal muscle enzyme, creatine kinase)，，，Glenn E. Morris 與 Linda P. Head，歐洲生物化學學會聯合會簡訊(FEBS LETTERS)，第145卷，第1期，第163-168頁， 1982年8月。專利文獻1 日本公開昭63-49095
發明內容
發明要解決的問題
但是，由非專利文獻1中公開的抗CKM單克隆抗體的制備方法而得到的抗體中，很多都不具備酶活抑制特性，造成篩選的工作量大，效率低。 而專利文獻1中的抗CKM的單克隆抗體特異性雖然得到了提高，但是對CKMB酶活的抑制率很難接近50%。 因此，目前的抗CKM的單克隆抗體特異性還不能滿足要求，需要一種特異性好，且對CKMB酶活抑制率在50%左右的雜交瘤細胞株。本發明是針對上述課題，進行大量研究而完成的，其目的在于提供一種特異性結合并抑制CKM亞基活性、且能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，以及由該雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，進一步提供一種應用該單克隆抗體為主要原料的CKMB檢測試劑盒。解決問題的手段本發明者們從CKM和CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接ELISA法進行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選，最終獲得了 1株能夠產生特異性結合CKM、且酶活抑制率接近50%的雜交瘤(2C3)作為目標細胞株，從而完成了本發明。本發明的目的在于提供一種特異性結合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明的另一個目的在于提供一種由該雜交瘤細胞株所產生的抗CKM單克隆抗體。本發明的目的還在于提供一種該雜交瘤細胞株的制備方法。另外，本發明的目的在于提供一種單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應用。因此，本發明提供了下面所述的⑴至(6)的內容。(1)產生能特異性結合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細胞株。(2) (1)中所述的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC4333。(3) (1)至(2)任一項所述的雜交瘤細胞株所產生的抗CKM單克隆抗體。(4) 一種抗CKM單克隆抗體，其特征在于，能識別(2)中的雜交瘤細胞株產生的抗 CKM單克隆抗體所識別的表位，并特異性抑制CKM酶活性。(5) 一種制備(1)或(2)中所述的雜交瘤細胞株的方法，其特征在于，包括從CKM 和CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接 ELISA法進行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選的工序。(6) (3)或(4)所述的抗CKM單克隆抗體在CKMB試劑盒制備中的應用。發明效果本發明的雜交瘤細胞株能夠特異性地結合并抑制CKM亞基酶活性，對CKMB酶活的抑制率接近50%，而由該雜交瘤細胞株產生的抗CKM單克隆抗體可以特異性地識別CKM亞基的抗原決定簇，而不與CKB亞基結合。由于該抗CKM單克隆抗體很好得滿足CKMB檢測的要求，因此可以應用于CKMB檢測試劑盒中。
圖1為由2C3雜交瘤細胞株所產生的單克隆抗體應用于試劑盒中的相關性分析圖。
具體實施例方式在本發明下文的詳細描述中，本領域的技術人員能夠使用本領域中的已知技術在不同的實施方案中實現本發明，此外本發明并不局限于以下所列舉的實施方案中。本發明所說的“CKM”除非特別說明，是指具有肌酸激酶活性的人肌酸激酶M型亞基及其相關產物，如肌酸激酶M型亞基的前體、成熟形式或片段。本發明所說的“特異性結合”是指抗CKM單克隆抗體僅與CKM亞基結合，而不與CKB
亞基結合。本發明所說的“抗體”是指能夠與完整的全長度的CKM分子或CKM片段特異性結合的單克隆抗體，或者這些抗體的部分片段。本發明所說的“抑制率接近50% ”是指抗CKM單克隆抗體具有抑制CKMB酶活的能力，但抗體的加入只能使酶活性下降到不加抗體時的50%左右。本發明中的雜交瘤細胞株與抗CKM單克隆抗體可以通過下文所述的方法產生。進一步，本領域的技術人員可以使用這些根據下文描述及本領域中已知技術改造過的更適合的方法。 (1)免疫原的制備本發明采用原核表達純化的CKM亞基作為免疫原。CKM的氨基酸序列為NCBI網站上公布的序列，其序列號為NP_001815，具體地參見SEQ ID No. 1。將氨基酸序列用Vector NTI軟件翻譯成不帶大腸桿菌稀有密碼子的核苷酸序列，具體序列見SEQ ID No. 2。本發明是通過構建含有編碼CKM的DNA片段(SEQ ID No. 2)的表達載體并通過在宿主細胞導入及表達該載體的方式來獲得重組人CKM。宿主細胞可以使用常用的宿主細胞，例如可以舉出E. coli BL 21(DE3)或其他的E. coli感受態細胞，優選為E. coli BL21(DE3)。使用宿主細胞表達后，通過用菌落PCR的方法挑選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子在LB培養基中培養，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達。誘導表達后的菌液進行細胞破碎，經過濾膜過濾后，用GST親和純化柱，優選GE公司的GSTrap FF預裝柱進行純化。對于細胞破碎，可以采用常規的細胞破碎方法，例如在8000-12000轉/分的條件下、 離心5-10分鐘，離心后的上清用0. 22um濾膜過濾，然后按純化柱填料產品說明書提供的方法進行純化。(2)檢測抗原的制備本發明是通過采用CKM與CKB亞基差異較大的多肽片段作為雜交瘤細胞的檢測抗原來進行單克隆抗體的篩選。具體的為用DNAStar軟件所帶的同源性比對軟件MegAlign 分析CKM與CKB亞基的序列，找出CKM與CKB的一些差異較大的片段，從中選取3段多肽片段進行合成作為檢測抗原。本發明所選3段多肽序列示于表1中。表 權利要求
1.一種產生能特異性結合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC4333。
3.一種根據權利要求1或2所述的雜交瘤細胞株所產生的抗CKM單克隆抗體。
4.一種抗CKM單克隆抗體，其特征在于，能識別權利要求2所述的雜交瘤細胞株產生的抗CKM單克隆抗體所識別的表位，并特異性抑制CKM酶活性。
5.一種制備權利要求1或2所述的雜交瘤細胞株的方法，其特征在于，包括從CKM和 CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接ELISA 法進行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選的工序。
6.權利要求4或5所述的抗CKM單克隆抗體在CKMB試劑盒制備中的應用。
全文摘要
本發明提供一種抗CKM單克隆抗體與產生其的雜交瘤細胞株以及其的應用。所述抗CKM單克隆抗體能夠特異性地結合并抑制CKM亞基酶活性，進一步，本發明的產生抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細胞株，能夠特異性地結合并抑制CKM亞基酶活性，對CKMB酶活的抑制率接近50％。
文檔編號C12N5/20GK102154216SQ201010623039
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者不公告發明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司研發中心