專利名稱：具有減少的金屬肽酶表達、適于重組多肽產生的突變細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及產生至少一種目標異源多肽的突變的細菌細胞，其中所述細胞與其他為同基因的但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平；用于產生所述突變細胞的方法；和用于使用所述突變細胞產生目標多肽的方法。
背景技術：
多肽，具體而言，酶的重組工業生產，是競爭激烈的領域，其中技術水平非常之高。 芽孢桿菌屬(Bacillus)中多肽的工業產生尤其受到完善的研究，且目前而言，在該領域甚至穩步改善多肽產率或生產力也是需要的。長年以來已知在芽孢桿菌屬中胞外和細胞壁相關蛋白酶的失活在許多情況下導致改善的產物穩定性并因此導致更佳的產率(W0 1992/01664幻。在枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)WB600 株中失活了多至六種的蛋白酶(Wu 等 1991. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases. J Bacteriol 173(16) :4952-4958)。SEQ ID NO :1中所示的開讀框(ORF)編碼表示為BL00^9的推定的金屬蛋白酶，其氨基酸序列示于 SEQ ID NO 2 (NCBI "Entrez Protein” 或“Entrez Gene” 登錄號 YP_080660)，其為最初從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580的基因組測序中由 Rey 等在 2004 :Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species, Genome Biol. (10) :R77所預測的。據我們所知，在此之后尚未公開任何關于該預測的ORF 或推定的編碼的金屬蛋白酶活性的研究。
發明內容
在幾種地衣芽孢桿菌酶產生株中SEQ ID NO 1中所示的推定開讀框的失活導致顯著改善的酶產率，如實施例中所示。宿主株已經失活了兩個主要的胞外蛋白酶，即堿性和中性蛋白酶(apr，npr)，以及C-組分(BLC)。這些失活目前(by far)消除了胞外細胞膜活性的主要部分(>90%)。預期失活仍舊另一個蛋白酶會至多(at best)提供僅為非常次要的改善。鑒于此， 如實施例中所見，失活本發明的推定的金屬蛋白酶導致如此顯著改善的產物產率是非常令人驚訝的。相應地，在第一個方面，本發明涉及突變的細菌細胞，其產生至少一種目標異源多肽，其中所述細胞與其他為同基因但非突變的細胞(otherwise isogenic but non-mutatedcell)相比，具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同，或優選與SEQ ID NO 2至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。本發明的第二個方面涉及用于構建突變的細菌細胞的方法，所述方法包括下述步驟a)使細菌細胞突變；和b)選擇突變細胞，其與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO 2中所示序列至少70%相同，或優選與SEQ ID NO 2至少75%、 80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。本發明的最后一個方面涉及用于產生目標異源多肽的方法，所述方法包括下述步驟a)培養產生至少一種目標異源多肽的突變細菌細胞，其中所述突變細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同，或優選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平，和b)分離目標多肽。
圖1顯示質粒pMDT081的概略圖。圖2顯示質粒pAN^9的概略圖。圖3顯示質粒pM0L2598的概略圖。圖4顯示質粒pM0L2606的概略圖。圖5顯示質粒pAN369的概略圖。圖6顯示質粒pAN405的概略圖。定義分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優選的方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，并且最優選至少90%純。基本上純的多肽術語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10 %，優選至多8 %，更優選至多6 %，更優選至多5 %，更優選至多 4%,更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1 %，并且甚至最優選至多0. 5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少 95 %純，更優選至少96 %純，更優選至少96 %純，更優選至少97 %純，更優選至少98 %純， 甚至更優選至少99%純，最優選至少99. 5%純，并且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式。具體而言，優選所述多肽是“基本上(substantially)純的形式”， 即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現通過公知的重組方法或由經典純化方法制備多肽。同一性參數“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等，2000,Trendsin Genetics 16:276-277)的Needle程序(優選3· 0· 0版或更高版本)中所執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來測定。使用的可選參數為缺口罰分(gap penalty) 10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性(longest identity)”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上文)的Needle程序(優選3· 0· 0版或更高版本)中所執行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)分離的多核苷酸術語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。 在一個優選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優選至少5%純，更優選至少10 %純，更優選至少20 %純，更優選至少40 %純，更優選至少60 %純，甚至更優選至少80%純，并且最優選至少90%純。基本上純的多核苷酸術語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計優選至多10%，更優選至多8 %，更優選至多6 %，更優選至多5 %，更優選至多4 %，更優選至多3 %，甚至更優選至多2 %，最優選至多1%，并且甚至最優選至多0. 5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計優選至少90%純，更優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，并且甚至最優選至少99. 5%純的。本發明所述多核苷酸優選為基本上純的形式。具體而言，優選在本文公開的多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術語“編碼序列，，或“開讀框”意指直接指定其蛋白產物氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG 和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。核酸構建體術語“核酸構建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區段，或其為合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。調控序列(control sequence)術語“調控序列”在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最低限度，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的 (susceptible)0修飾術語“修飾”在本文的意思是，對由SEQ ID NO 2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼此種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側鏈的置換。雜交就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQ ID NO :1的多肽編碼序列；SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列；其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-ray film)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優選方面，核酸探針是SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優選方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸序列，或其至少IOObp的亞序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQ ID NO :1。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在 42°C，在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴格性為35%的甲酰胺、或對于高和非常高嚴格性為50%的甲酰胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2X SSC、0.2% SDS優選至少在 450C (非常低嚴格性)，更優選至少在50°C (低嚴格性)，更優選至少在55°C (中嚴格性)， 更優選至少在60°C (中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65°C (高嚴格性)，并且最優選至少在70°C (非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。突變能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后進行相應的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 和 Sauer, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 WO 95/22625 公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美國專利 5，223，409 ；WO 92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。亦可采用通過移碼或部分甚至完全缺失進行的標準基因破壞(gene disruption)。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQ ID NO 1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由在SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變的核苷酸組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特征的克隆DNA片段，從而實現從此種基因組 DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR :A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應 (LCR)、連接活化轉錄(ligated activated transcription ；LAT)和基于核苷酸序列的擴增 (NASBA)。可以從芽孢桿菌屬菌株，或其它或相關生物體克隆多核苷酸，并且因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(species variant)。本發明還涉及用于產生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導致在相同條件下培養時，與親本細胞相比突變的細胞產生較少的所述多肽。可以使用本領域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變細胞。在一個優選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區或其對活性關鍵的部分，或表達編碼區所需的調節元件。此種調節或調控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分， 即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用于可能的修飾的其它調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子。可以通過向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核苷酸序列的修飾或失活。誘變(其可為特異性的或隨機的)可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過對所述DNA序列進行PCR產生的誘變來進行。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合于本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate) (EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優選的誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉錄或翻譯所需的調控元件可以實現所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產生的誘變可以完成此種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內進行，即， 直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。
消除或減少核苷酸序列通過細胞的表達的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應于內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷性的核酸序列，然后將其轉化入親本細胞中以產生缺陷基因。 通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代內源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化體。在一個特別優選的方面，用選擇性標記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列。或者，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉錄并且能夠與細胞中產生的mRNA雜交。由此在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下， 減少或消除翻譯的蛋白質的量。本發明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產生更少的多肽或不產生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細胞作為表達天然和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發明進一步涉及生產天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有助于生產多肽的條件下培養所述突變細胞；和(b)回收所述多肽。術語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA 技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含編碼目標多肽的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。或者，可以通過在適當的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的多核苷酸序列。在構建表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而使得該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA 步驟，并且能夠實現核苷酸序列的表達。載體的選擇通常取決于載體與待引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外， 可以使用單獨的載體或質粒，或者兩個或更多個共同含有待引入宿主細胞基因組的完整 DNA (total DNA)的載體或質粒，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophy to auxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性。
本發明的載體優選含有允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制的元件。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或任何其它載體元件以通過同源或非同源重組整合入基因組。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列， 所述序列用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10，000堿基對，優選400至10，000堿基對，并且最優選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的目標序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合入宿主細胞的基因組。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質粒復制子(r印licator)，其在細胞中發揮功能。術語“復制起點”或“質粒復制子”在本文定義為能夠使質粒或載體體內復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177 和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUBllO、pE194、pTA1060和 ρΑΜβ 1的復制起點。用于連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸，其有利地用于所述多肽的重組產生。將包含本發明多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復制的染色體外載體維持。術語“宿主細胞”包括親本細胞的任何后代，其由于復制過程中發生的突變而不同于親本細胞。宿主細胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus) 0革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌(E. coli)、假單胞菌屬(I^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬 (Ureaplasma)屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。可通過如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang 和 Cohen，1979，Molecular General Genetics 168 :111-115)，使用感受態細胞 (參見，例如，Young 禾口 Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81 :823-829 或 Dubnau 和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56 :209-221)，電穿孔(參見， 例如，Shigekawa 和 Dower，1988，Biotechniques 6 :742-751)或接合(參見，例如，Koehler 和 Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169 :5771-5278)。可通過如下方法實現將 DNA 引入到大腸桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166 557-580)或電穿孑L (參見，例如，Dower 等，1988，Nucleic Acids Res. 16 :6127-6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如， Gong 等，2004，Folia Microbiol. (Praha) 49 :399-405)，接合(參見，例如，Mazodier 等， 1989，J. Bacteriol. 171 :3583-3585),或轉導(參見，例如，Burke 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :6289-6294)。可通過如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi 等，2006，J.Microbiol. Methods 64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo 禾口 Smets，2005，Appl. Environ. Microbiol. 71 :51-57)。產生方法本發明還涉及用于產生重組多肽的方法，其包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下培養突變的細菌細胞，所述細胞產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優選的方面，所述細胞是芽孢桿菌屬的細胞。在一個更優選的方面，所述細胞是地衣芽孢桿菌。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法(enzyme assay) 可用于確定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取 (參見，例如，Protein Purification，J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers,New York,1989)。發明的具體描述微牛物本發明的微生物(微生物菌株或細胞)可獲得自任何屬的微生物，如那些下述列舉的細菌來源。在一個優選實施方案中，本發明第一個方面的細胞是原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞，更優選枯草桿菌屬細胞，且最優選嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、 環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。突變細胞在本發明的一個優選實施方案中，所述包含與SEQ ID NO 2中所示序列至少70% 相同，或優選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或 99%相
同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。在另一個優選實施方案中，本發明的突變細胞在編碼多肽的基因中突變，所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同，優選與SEQ ID NO :2至少75%、80%、 85^^90^^92%,94^^96^^98%或99%相同的氨基酸序列；優選本發明的突變細胞在具有與SEQ ID NO 1中所示序列至少70%相同，優選與SEQ ID NO 1至少75%、80%、85%、 90%,92^^94%,96^^98%或99%相同的核苷酸序列的多核苷酸中突變。優選地，本發明的細胞在至少一個多核苷酸中突變，其中所述至少一個多核苷酸具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴格雜交條件下，優選在中-高嚴格條件下，或更優選在高嚴格條件與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應互補序列雜交。在一個優選實施方案中，本發明的突變細胞是其中編碼多肽的基因部分或完全從染色體缺失，或包含至少一個移碼突變或無義突變的突變細胞，所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同，優選與SEQ ID NO :2至少75%、80%、85%、90%、92%、 94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列。這些突變的一個優選結果是，與其他為同基因但非突變的細胞相比，本發明的細胞具有至少兩倍減少的多肽表達水平，所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70% 相同，優選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或 99%相同的氨基酸序列；或所述細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，不具有可測量的該多肽表達。目標多肽在一個優選實施方案中，目標多肽可獲得自細菌或真菌來源。例如，目標多肽可獲得自革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌屬菌株，例如嗜堿芽孢桿菌、 解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株；或鏈霉菌屬菌株，例如淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces livickns)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)菌株；或來自革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌或假單胞菌屬菌種。目標多肽可獲得自真菌來源，例如，來自酵母菌株如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)菌株，例如，卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces ovifoirmis)菌株。目標多肽可獲得自絲狀真菌菌株，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬 (Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、 鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)J^ 絲毒屬(Myceliophthora)、新考瑪月旨毒屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、 擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬 (Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株，具體而言目標多 Ι Pj^til §Ml^(Aspergillus aculeatus) Λ^^^β (Aspergillus awamori) λ^^ 霉(Aspergillus foetidus)、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿抱狀,廉抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、庫威德抱(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、 禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱 (Fusarium negundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、 粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓,廉抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides)、 鑲片鐮孢(Fusarium venenatum)、特異腐質霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質 M (Humicola lanuginosa) Λ τ|<: M ^β (Mucor miehei) Λ ^1 ^ (Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木毒(Trichoderma harzianum)、康寧木毒(Trichoderma koningii)、 長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉 (Trichoderma viride)菌株。這些種的菌株在許多培養物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、 德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)。就本發明而言，用于本文與給定的來源相連的術語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。目標多肽可為肽或蛋白質。本發明優選的肽包含2至100個氨基酸；優選10至80 個氨基酸；更優選15至60個氨基酸；甚至更優選15至40個氨基酸。在一個優選實施方案中，所述蛋白質是酶，特別是水解酶(根據Enzyme Nomenclature ；Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry為分類EC 3)。在一個具體的優選實施方案中，優選下述的水解酶蛋白酶合適的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物來源的。優選微生物來源。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。所述蛋白酶可為酸性蛋白酶，絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶， 優選為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是那些來源于芽孢桿菌屬的，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、 枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。 胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例為描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中的變體，特別是在一個或多個下述位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、 101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235 和 274。優選的商業上可獲得的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASE 、PRIMASE 、 DURALASE 、 ESPERASE 、 RELASE 禾口 KANNASETM(Novozymes A/S)、 MAXATASE 、 MAXACAL 、MAXAPEM 、PROPERASE 、PURAFECT 、PURAFECT 0ΧΡ 、FN2 和 FN3 (Genencor International Inc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質霉屬(Humicola)(同義詞嗜熱霉屬(Thermomyces)) 的脂肪酶，例如描述于EP 258 068和EP 305 216的來自疏棉狀腐質霉(H. lanuginosa) (Μ 毛嗜熱霉(T. Ianuginosus))或如描述于WO 96/13580的來自特異腐質霉(H. insolens)的脂肪酶，或假單胞菌屬脂肪酶，例如來自如產堿假單胞菌(P. alcaligenes)和類產堿假單胞菌(P. pseudoalcaligenes) (EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (EP 331 376)、施氏假單胞菌(P. stutzeri) (GB 1，372，034)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株 SD 705 (W0 95/06720 和 WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(P. wisconsinensis) (TO 96/12012)的脂肪酶，芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993)， Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(W0 91/16422)的脂肪酶。其他的實例為脂肪酶變體，如WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。優選的商業上可獲得的脂肪酶包括LIPOLASE 、LIPOLASE ULTRA 和 LIPEX (Novozymes A/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β )包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如來自特定地衣芽孢桿菌菌株的淀粉酶，更加詳細地描述于GB 1，296, 839。有用的淀粉酶的實例為WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424 和WO 01/66712中描述的變體，特別是在一個或多個下述位置有取代的變體15、23、105、 106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 和
444。商業上可獲得的淀粉酶為DURAMYL 、TERMAMYL 、FUNGAMYL 、NATALASE 、 TERMAMYL LC 、TERMAMYL SC 、LIQUIZYME-X 禾口 BAN (Novozymes A/S)、RAPIDASE 和 PURASTAR (來自 Genencor International Inc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的和蛋白質工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如 US 4，435，307、US 5，648，263、US 5，691，178、US 5，776，757 和 WO 89/09259中公開的產自特異腐質霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶為具有護色益處(colour care benefit)的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例為 EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、 WO 98/08940中描述的纖維素酶。其他實例為纖維素酶變體，如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5，457，046、US 5，686，593、US 5，763，254、WO 95/24471、WO 98/12307 和 PCT/ DK98/00299中描述的那些。商業上可獲得的纖維素酶包括CELLUZYME 、CAREZYME 和CAREZYME CORE (Novozymes A/S)、CLAZINASE 禾口 PURADAX HA (Genencor International Inc.)和 KAC-500(B) (Kao Corporation)。氧化還原酶根據本發明可處理的氧化還原酶包括過氧化物酶和氧化酶如漆酶和過氧化氫酶。其他優選的水解酶為糖水解酶(carbohydrolase)包括MANNAWAY 。其他優選的酶為轉移酶、裂合酶、異構酶和連接酶。用于目標多肽的表達構建體在一個優選實施方案中，本發明的細胞包含一個或多個編碼所述至少一個異源多肽的多核苷酸的染色體整合的拷貝。優選本發明所述至少一個異源多肽由從至少一個異源啟動子轉錄的多核苷酸編碼；優選所述至少一個啟動子包含人工啟動子。合適的啟動子構建體描述于WO 93/10249, 其通過提述以其整體并入本文。此外，優選的人工啟動子包含一個或多個mRNA穩定序列，優選來源于cryllla啟動子。合適的構建體描述于WO 99/43835，其通過提述以其整體并入本文。
鍾本發明可用于任何工業規模的發酵，例如用于任何具有至少50升，優選至少100 升，更優選至少500升，甚至更優選至少1000升，特別是至少5000升的培養基的發酵。所述細菌菌株或細胞可通過本領域任何已知方法發酵。發酵培養基可為包含復合氮源和/或碳源的復合培養基，如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米漿、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、馬鈴薯蛋白、馬鈴薯蛋白水解物、糖蜜等。所述發酵培養基可為化學限定的培養基，例如如WO 98/37179中所限定的。所述發酵可作為分批、補料分批、重復補料分批(i^peated fed-batch)或連續發酵工藝進行。在分批補料工藝中，在發酵起始之前，將包含一種或多種結構和/或催化元件的化合物的部分添加至培養基，或不添加任何化合物，相應地，該包含一種或多種結構和/或催化元件的化合物剩余部分或全部在發酵工藝過程中補料。選用于補料的化合物可一同補料或彼此分開補料至發酵工藝。在重復分批補料或連續發酵工藝中，在發酵過程中額外補料完全的起始培養基。 所述起始培養基可以與所述結構元件補料一同或分開補料。在重復分批補料工藝中，按間隔去除包含生物質的發酵液部分，而在連續工藝中，發酵液的部分的去除連續進行。因此， 發酵工藝是根據取出的發酵液的量補充部分新鮮培養基。在本發明的一個優選實施方案中，優選補料分批、重復補料分批工藝或連續發酵工藝。目標多肽的回收本發明的進一步方面涉及發酵液的下游加工。在發酵工藝結束之后，可使用針對目標多肽開發的標準技術，從發酵液回收目標多肽。待施用的相關下游加工技術取決于目標多肽的特性。用于從發酵液回收目標多肽的方法通常會涉及(但不限于)下述步驟中的一些或全部1)預處理發酵液(例如絮凝)2)從發酵液去除細胞和其他固體材料(初次分離)3)過濾4)濃縮5)過濾6)穩定和標準化除了上述列舉的單元操作，可施用多種其他回收方法和步驟，例如pH調整，溫度變化，結晶，用活性炭處理包含目標多肽的溶液，和使用多種吸附劑。通過使用本發明的方法，當通過在發酵過程中添加例如MPG使晶體形成減少或消除時，目標多肽在回收中的產率更高。本發明進一步在下述實施例中進行說明，其并不旨在以任何方式限制要求保護的本發明的范圍。
實施例
培養基LB瓊脂，TY bullion培養基和BPX搖瓶培養基均描述于WO 94/14968。PS-I搖瓶培養基(10%蔗糖，4%大豆粉，Na2SO4 ·12Η20，0· 5% I CaCO3 和 0. 01% Pluronic Acid) 描述于美國專利6，255，076號的實施例28。菌株和供體生物枯草芽孢桿菌PL1801該菌株為具有破壞的apr和npr基因的枯草芽孢桿菌DN1885 (Diderichsen，B.， Wedsted, U. , Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , Sjoholm, C. (1990)Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from i Bacillus brevis. J. Bacteriol.，172,4315-4321)。地衣芽孢桿菌PP1962該菌株是WO 2005/123915 (Novozymes)中公開的菌株MDT223的衍生物，具有下述其他修飾，描述于三個步驟步驟1 插入地衣芽孢桿菌L-氨肽酶基因以替代MDT223中amyL基因座處存在的蛋白酶基因。如WO 1996/029418 (Novozymes)中所述，通過接合導入整合載體，其攜帶來自地衣芽孢桿菌的L-氨肽酶基因，其側翼為異源串聯物(tandem)/蛋白酶基因上游的 cryIIIa啟動子5’區和3’ amyL區，將其整合入并從染色體切出。步驟2 將串聯物/cryll IA 啟動子，其公開于 WO 1999/043835 (Novozymes), 其后為大腸桿菌rrnB轉錄終止子，插入gntP基因座，從而構建了 gntP缺失。使用質粒 pMDT081(SEQ ID而3;圖1)以供整合入地衣芽孢桿菌的染色體上的gntP基因座。步驟3 修飾L12基因的核糖體結合位點(RBS)以提供L12蛋白表達的強減少。如 WO 1996/029418 (Novozymes)中所述，導入具有變體核糖體結合位點的整合載體質粒，并通過整合和切出將變體基因插入染色體，替代天然的L12基因。分離了所得的紅霉素敏感菌株，其包含變體L12基因。L12 RBS的最終變化如下所述(下劃線所示堿基為L12基因的起始密碼子)(SEQ ID NO 4) Sf^Mi^^J :atgaaagaggaggaatgaaataatg(SEQ ID NO :5)突變的 EF 變體atgaaagacgcgtaatgaaata幽地衣芽孢桿菌PL4198該菌株是描述于WO 2005/123915中的菌株MDT223的衍生物，具有下述逐步添加的修飾步驟1 將串聯物/cryIIIA 啟動子，其公開于 WO 1999/043835 (Novozymes), 其后為大腸桿菌rrnB轉錄終止子，插入gntP基因座，從而構建gntP缺失。使用質粒 pMDT081(SEQ ID NO 3)以供整合在地衣芽孢桿菌染色體上的gntP基因座。步驟2 修飾L12基因的核糖體結合位點(RBS)以提供L12蛋白表達的強減少。如上所述，導入具有變體核糖體結合位點的整合載體質粒，并通過整合和切出將變體基因插入染色體，替代天然的L12基因。分離了所得的紅霉素敏感菌株，其包含變體L12基因。對于PP1962菌株，L12 RBS的最終變化已示于步驟1)。步驟3 插入地衣芽孢桿菌amyL基因以替代MDT223中amyL基因座處存在的JP170 蛋白酶基因。如WO 1996/029418 (Novozymes)中所述，通過接合導入整合載體質粒，其攜帶來自地衣芽孢桿菌的amyL基因，其側翼為異源串聯物/蛋白酶基因上游的cryllla啟動子 5’區和3’ amyL區，將其整合入并從染色體切出。步驟4 插入修飾的枯草芽孢桿菌aprE蛋白酶基因(SEQ ID NO 6)以替代在步驟 3中插入的amyL基因。如上所述，通過結合導入整合載體質粒，其攜帶所述蛋白酶基因，該基因側翼為5’串聯物/cryIIIA和amyL3’區段，將其整合入并從染色體切出。步驟5 通過缺失765bp spoIIAC基因的核苷酸70至436來使spoIIAC基因 (sigF)失活。缺失是通過標準方法使用溫度敏感性質粒和同源重組實施的。步驟6 通過缺失從基因pgsB中的核苷酸607至pgsAA基因中的核苷酸180(兩個核苷酸均包含在內)的染色體區來使PgsB-、pgsC-和pgsAA-基因失活。缺失是通過標準方法使用溫度敏感性質粒和同源重組實施的。質粒 ρΑΝ^9編碼地衣芽孢桿菌推定的金屬肽酶BL00829的基因的缺失型式是使用通過重疊延伸的剪切(SOE)通過 PCR 來構建的(Horton 等，1989，Gene 77(1) :61-68)。將 BL00^9 基因的5，和3，區從地衣芽孢桿菌SJ1904DNA通過對于5，BLOOS^片段使用引物AN354 (其導 Λ 5，sacll限制位點)和引物AN355而對于BL008293'片段使用引物AN356和AN357 (其導入NotI限制位點)進行PCR擴增。引物序列如下所示弓丨物 AN354(SEQ ID NO 7) :ttgcacccgcggatacgagggagtggcgatgtiJ^IjANS55 (SEQ ID NO 8) :gaatgaataaaagtgaagcccaagagaaggctttttcacaagatta弓丨物AN356(SEQ ID NO :9) :taatcttgtgaaaaagccttctcttgggcttcacttttattcattc弓丨物 AN357(SEQ ID NO :10) :aagcatgcggccgcgatctttctgcatcatatgcPCR擴增是在標準條件下運行，并使用瓊脂糖-0. 5X TBE凝膠顯影具有預期大小639bp(5，片段)和648bp(3，片段)的產物。最終SOE片段命名為8 Δ 14 (SEQ ID NO: 11)，并根據Horton等，1989使用引物對AN354和AN357生成。存在于SOE產物829 Δ 14上的BL00^9基因的截短型式編碼14aa的多肽，其缺失了天然BL00^9蛋白中間的138aa。質 U pAN829 (SEQ ID N0:12;圖2)是通過將用限制酶sacll和NotI切割的PCR產物8 Δ 14 連接至包含ΡΕ194的溫度敏感性起點的載體質粒來構建的。該質粒用于通過雙交換事件從地衣芽孢桿菌染色體缺失BLOOS^基因。對于合適宿主菌株和整合步驟的進一步描述可見于 TO 2005/123915。實施例1.突變的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶宿主的構建該實施例描述了包含兩個拷貝的編碼分泌的α-淀粉酶的基因的地衣芽孢桿菌菌株的構建。然后通過在編碼推定的金屬蛋白酶見00擬9的基因中導入缺失來構建該菌株的突變體。用于該實施例的α-淀粉酶為最初由嗜堿的芽孢桿菌菌種JP170產生的 JEl α-淀粉酶多肽。這是包含于質粒pTVB115，描述于W099/23211的基因。該特定基因在下文中會稱作“jel”。M0L2650 二拷貝iel α -淀粉酶菌株如W02005/123915的實施例6中所述，將jel基因轉移至設計以允許α -淀粉酶表達盒整合入地衣芽孢桿菌菌株染色體的整合載體，所述整合載體已經含有整合在amyL 基因座和xylA基因座的人工串聯物/cryIIIA啟動子。這是通過在該啟動子的cryIIIA穩定子區(stabilizer region)和在amyL和xylA的下游區段分別使用雙重同源重組來完成的。對于合適宿主菌株和整合步驟的進一步描述可見于WO 2005/123915。分別用于amyL和xylA基因座的整合載體pM0L2598(SEQ ID N0:13;圖3)和 PM0L2606 (SEQ ID NO 14 ；圖4)是通過將編碼JEl淀粉酶的DNA片段插入pE194衍生載體來構建的。這些質粒亦可通過從已知的標準載體如PE194克隆PCR片段或連接合成的DNA 片段來制備。將載體pM0L2598轉化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態細胞，在30°C就紅霉素抗性 O微克/ml)進行選擇。所得的轉化體為M0L2598(PL1801/pM0L2598)。然后通過感受態 (competence)、電穿孔或接合將該質粒重新轉化入上述的地衣芽孢桿菌PP1962，并通過雙重同源重組用jel淀粉酶基因替代L-氨肽酶基因。所得的菌株分離為M0L2614。將載體pM0L2606亦轉化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態細胞，在30°C就紅霉素抗性O微克/ml)進行選擇。所得的質粒為M0L2608(PL1801/pM0L2606)。然后通過感受態、 電穿孔或接合將該質粒重新轉化入上述的地衣芽孢桿菌M0L2614，并通過雙重同源重組將 jel基因整合入xyl基因座。所得的菌株分離為M0L2650。最終的M0L2650菌株具有從描述于W02005/123915實施例6的強啟動子P17表達的二拷貝的jel淀粉酶基因。該整合載體亦在下述位置含有來自地衣芽孢桿菌的prsA基因，所述位置將克隆的bmyl基因置于雙順反子操縱子中的prsA的上游。拷貝之一位于amyL 基因座，而第二拷貝位于xyl基因座。如專利W02005/123915中所述，該菌株進一步在編碼蛋白酶AprE和C-組分的基因中有缺失。此外，L12基因的核糖體結合位點經修飾，從而導致L12蛋白表達的強減少(見上)。AN407 突變的 M0L2650 菌株通過接合將質粒pAN^9轉移至地衣芽孢桿菌M0L2650(如上所述)，并通過雙重同源重組用截短的BL00^9基因偽四替代BL00^9基因。所得的菌株分離為AN407。除了編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因通過缺失突變之外，AN407菌株與 M0L2650菌株同基因。實施例2突變的地衣芽孢桿菌β -淀粉酶宿主的構建該實施例描述了兩個包含編碼分泌的淀粉酶的基因的地衣芽孢桿菌菌株； 除了其一通過在編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因中缺失而突變之外，這兩個菌株是同基因的。用于該實施例的β-淀粉酶是最初由嗜熱細菌熱產硫磺梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)產生的β -淀粉酶，其用源自地衣芽孢桿菌amyL的異源分泌信號序列替代天然信號序列。該特定雜合基因在下文中會稱作“bmyl”，且其核苷酸序列示于SEQ ID NO :15。AN411 二拷貝bmyl β -淀粉酶菌株如W02005/123915的實施例6中所述，將bmyl基因(SEQ ID NO 15)轉移至設計以允許β -淀粉酶表達盒整合入地衣芽孢桿菌菌株染色體的整合載體，所述染色體已經含有整合在amyL基因座和xyIA基因座的人工串聯物/cryIIIA啟動子。這是通過在cryIIIA 穩定子區和在amyL和xylA的下游區段分別使用雙重同源重組來完成的。對于合適宿主菌株和整合步驟的進一步描述可見于WO 2005/123915。分別用于amyL和xylA基因座的整合載體pAN369 (SEQ ID NO 16 ；圖5)和PAN405 (SEQ ID NO :17 ；圖6)是通過將編碼bmyl β -淀粉酶的DNA片段插入ρΕ194衍生載體來構建的。這些質粒亦可通過從已知的標準載體如ΡΕ194克隆PCR片段或連接合成DNA 片段來制備。將載體ρΑΝ369轉化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態細胞，在30°C就紅霉素抗性 (2微克/ml)進行選擇。所得的轉化體為AN369 (PL1801/pAN369)。然后通過感受態、電穿孔或接合將該質粒重新轉化入上述的地衣芽孢桿菌PL4198菌株，并通過雙重同源重組用 bmyl β -淀粉酶基因替代蛋白酶基因。所得的菌株分離為ΑΝ374。將載體ρΑΝ405亦轉化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態細胞，在30°C就紅霉素抗性 (2微克/ml)進行選擇。所得的轉化體為AN405 (PL1801/pAN405)。然后通過感受態、電穿孔或接合將該質粒重新轉化入上述的地衣芽孢桿菌AN374，并通過雙重同源重組將bmyl基因整合入xyl基因座。所得的菌株分離為AN411。最終的AN411菌株具有從描述于W02005/123915實施例6的強啟動子P17表達的二拷貝的bmyl β -淀粉酶基因。拷貝之一位于amyL基因座，而第二拷貝位于xyl基因座。 此外，該菌株在編碼蛋白酶AprE和C組分的基因中有缺失，如專利W02005/123915中所述。 此外，L12基因的核糖體結合位點經修飾，從而導致L12蛋白表達的強減少(見上)。AN420 突變的 AN411 菌株通過接合將質粒pAN^9轉移至地衣芽孢桿菌AN411 (如上所述)，并通過雙重同源重組用截短型式偽四替代SEQ ID NO :1的推定的金屬蛋白酶編碼基因。所得的菌株分離為 AN420。除了編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因通過缺失突變之外，AN420菌株與 AN411菌株同基因。實施例3.在來自實施例2的地衣芽孢桿菌菌株中的β -淀粉酶產生如下所述進行來自實施例2的地衣芽孢桿菌菌株的補料分批發酵工藝。所有的培養基通過本領域已知方法滅菌。除非另行描述，使用自來水。在下述配方中提及的成分濃度是進行任何接種之前的濃度。培養基LB瓊脂10g/l來自酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母提取物；10g/l氯化鈉；12g/l細菌瓊脂，調整至PH 7. 0+/-0. 2。使用來自Merck的預混物(LB-瓊脂(Miller) 110283)。M-9緩沖液磷酸氫二鈉，2H20 8. 8g/l ；磷酸二氫鉀3g/l ；氯化鈉4g/l ；硫酸鎂， 7H20 0. 2g/l (在該緩沖液中使用去離子水)。PRK-50 :110g/l 大豆粗粒(soy grits)；磷酸氫二鈉，2H20 5g/l ；消泡劑 (Struktol SB2121 ；Schill & SeiIacher，Hamburg，Germany) lml/1。在滅菌之前用 NaOH/ H3PO4將pH調整至8.0。組成培養基(Make-up medium)胰蛋白胨(來自Difco (Bacto 胰蛋白胨胰消化酪蛋白211699的酪蛋白水解物)30g/l ；硫酸鎂，7H20 4g/l ；磷酸氫二鉀7g/l ；磷酸氫二鈉，2H20 7g/l ；硫酸銨4g/l ；檸檬酸(鹽)0.78g/l ；維生素(硫胺素二氯化物34. 2mg/ 1 ；核黃素2. 9mg/l ；煙酸23mg/l ；D-泛酸鈣28. 5mg/l ；吡哆醛-HCl 5. 7mg/l ；D-生物素 1. lmg/1 ；葉酸 2. 9mg/l)；微量金屬(MnSO4, H2O 39. 2mg/l ；FeSO4, 7H20 157mg/l ；CuS04，5H20 15. 6mg/l ；ZnCl2 15. 6mg/l)；消泡劑(Struktol SB2121 ；Schill & SeiIacher，Hamburg,Germany) 1. 25ml/l ；在滅菌之前用 Na0H/H3P04 將 pH 調整至 6. 0。給料培養基；葡萄糖，IH2O 820g/l發酵步驟將地衣芽孢桿菌菌株在37°C在LB瓊脂斜面上生長一日。然后用M-9緩沖液洗滌瓊脂，并測量所得的細胞懸液在650nm處的光密度(OD)。將接種搖瓶(含100ml PRK-50培養基)用0D(650nm)xml細胞懸液=0. 1的接種物來接種。將搖瓶在37°C以300rpm溫育 20小時。使用的發酵器為配備有溫度控制系統、使用氨水和磷酸的pH控制和在整個發酵過程中測量> 20%的氧飽和度的溶解氧電極的標準實驗室發酵器。在主發酵器(發酵罐)中的發酵是通過用來自燒瓶的生長培養物接種主發酵器來起始的。接種體積為10% (對于720ml組成培養基為80ml，在接種之后得到800ml起始液)。發酵參數為溫度38°C;pH 6. 8至7.2(使用氨水和磷酸，控制6.8(氨水)，7. 2磷酸)。通氣1.5升/分鐘，攪拌1500印111。如下所述添加補料培養基在發酵起始時起始補料速率為0. 05g/分鐘/kg，在8 小時之后線性增加至0. 16g/分鐘/kg，并維持在0. 16g/分鐘/kg直至發酵結束，這些都是相對于發酵液恰在接種之后的起始重量。發酵在3日之后終止(大約70小時)。β -淀粉酶泖丨定β-淀粉酶作用于麥芽六糖(G6)的非還原端以形成麥芽糖(G2)和麥芽四糖 (G4)。產生的G4與G6相比在乳糖氧化酶和&存在下形成H2A的反應更強。形成的H2A 在過氧化物酶存在下激活4-氨基安替比林(AA)和N-乙基-N-磺丙基-間甲苯胺(TOPS) 的氧化縮合以形成紫色產物，其可通過其在540處的吸光度加以量化。該反應是由麥芽六糖起始的。當除淀粉酶之外所有的組分均過剩時，吸光度上升速率與存在的淀粉酶活性成比例。該分析由Konelab自動進行的。一個β -淀粉酶單元(BAMU)定義為在此文件中描述的條件下每分鐘降解一 μ mol 麥芽六糖的酶量。活性是相對于酶標樣來確定的。亞硫酸鹽和Termamyl并不顯著干擾BAMU結果。其他過氧化氫產生或消耗劑可顯示假BAMU活性。裝置· Konelab Arena 30 分析儀·分析天平(例如 Mettler AT200, Mettler AE100)·稀釋裝置(例如Hamilton稀釋器)·磁力攪拌器· pH 計(例如 Radiometer PHM 93)·移液管表1反應條件
權利要求
1.一種突變的細菌細胞，所述細胞產生至少一種目標異源多肽，其中所述細胞與其他為同基因的但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。
2.權利要求1的細胞，其為原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞。
3.權利要求2的細胞，其為芽孢桿菌屬細胞。
4.權利要求3的細胞，其為嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽 ？包桿菌(Bacillus lichenifprmis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細胞。
5.權利要求1-4任一項的細胞，其中所述包含與SEQID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
6.權利要求1-5任一項的細胞，其在編碼包含與SEQID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
7.權利要求6的細胞，其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
8.權利要求1-7任一項的細胞，其在至少一個多核苷酸中有突變，其中所述至少一個多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴格雜交條件下與具有SEQ ID N0:1中所示的序列的多核苷酸或其相應互補序列雜交。
9.權利要求6-8任一項的細胞，其中所述基因部分或完全從染色體缺失，或包含至少一個移碼突變或至少一個無義突變。
10.權利要求1-9任一項的細胞，與其他為同基因但非突變的細胞相比，不具有包含與 SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測量的表達。
11.權利要求1-10任一項的細胞，其中所述至少一種異源多肽包含酶。
12.權利要求11的細胞，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。
13.權利要求1-12任一項的細胞，其與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有目標異源多肽的改善的產生。
14.一種用于構建突變的細菌細胞的方法，所述方法包括下述步驟a)使細菌細胞突變；和b)選擇突變細胞，其與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。
15.權利要求14的方法，其中所述細胞為原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述細胞為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。
18.權利要求14-17任一項的方法，其中所述包含與SEQID NO :2中所示序列至少70% 相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
19.權利要求14-18任一項的方法，其中步驟(a)中的細胞在編碼包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
20.權利要求19的細胞，其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
21.權利要求14-20任一項的方法，其中步驟(a)中的細胞在至少一個多核苷酸中突變，其中所述至少一個多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴格雜交條件下與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應互補序列雜交。
22.權利要求14-21任一項的細胞，其中步驟(a)中的細胞通過下述方法突變使所述基因部分或完全從細胞的染色體缺失，或將至少一個移碼突變或至少一個無義突變導入所述基因。
23.權利要求14-22任一項的方法，其中在步驟(b)中選擇的細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，不具有包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測量的表達。
24.權利要求14-23任一項的方法，其中所述至少一種目標異源多肽包含酶。
25.權利要求對的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。
26.權利要求14-25任一項的方法，其中所述細胞包含一個或多個染色體整合的多核苷酸拷貝，所述多核苷酸編碼至少一種目標異源多肽。
27.一種用于產生目標異源多肽的方法，所述方法包括下述步驟a)培養產生至少一種目標異源多肽的突變細菌細胞，其中所述突變細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達水平，和b)分離目標多肽。
28.權利要求27的方法，其中所述細胞為原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞。
29.權利要求觀的方法，其中所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。
30.權利要求四的方法，其中所述細胞為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。
31.權利要求27-30任一項的方法，其中所述包含與SEQID NO 2中所示序列至少70% 相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
32.權利要求27-31任一項的方法，其中步驟(a)中的細胞在編碼包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
33.權利要求32的細胞，其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
34.權利要求27-33任一項的方法，其中步驟(a)中的細胞在至少一個多核苷酸中有突變，其中所述至少一個多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴格雜交條件下與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應互補序列雜交。
35.權利要求27-34任一項的細胞，其中步驟(a)中的細胞通過下述方法突變使所述基因部分或完全從細胞的染色體缺失，或將至少一個移碼突變或至少一個無義突變導入所述基因。
36.權利要求27-35任一項的方法，其中在步驟(a)中的細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，不具有包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測量的表達。
37.權利要求27-36任一項的方法，其中所述至少一種目標異源多肽包含酶。
38.權利要求37的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。
39.權利要求27-38任一項的方法，其中所述突變的細胞與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有目標異源多肽的改善的產生。
全文摘要
產生至少一種目標異源多肽的突變的細菌細胞，其中所述細胞與其他為同基因的但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ ID NO2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表達水平；用于產生所述突變細胞的方法；和用于使用所述突變細胞產生目標多肽的方法。SEQ ID NO2代表推定的金屬蛋白酶。
文檔編號C12N15/75GK102414317SQ201080018598
公開日2012年4月11日 申請日期2010年2月25日 優先權日2009年2月27日
發明者A.K.尼爾森, M.D.拉斯馬森, N.班克 申請人:諾維信公司