金屬提取肽標簽和相關方法

專利名稱：金屬提取肽標簽和相關方法
金屬提取肽標簽和相關方法相關申請的交叉引用本申請要求2008年5月13日提交的美國臨時專利申請序列號61/052，918的優 先權，其通過引用并入本申請中。本發明得到美國國立衛生研究院的資助(資助號P20 RR-17708)而開發。美國政 府可以擁有本發明的某些權利。
背景技術：
目前，使用金屬從組合物中提取多肽(如蛋白質或蛋白質片段)已成為常用技術。 這樣的提取是基于金屬能夠與組合物中的特異性多肽絡合，而不與組合物中的其它物質發 生絡合。已知可使用兩種不同的基于肽的金屬結合標簽從組合物中分離出肽。然而，這些 結合標簽具有用于實現結合的特定類型氨基酸和特定數目或特定序列的氨基酸，這與本發 明所述的結合標簽有顯著不同。例如，這兩種結合標簽可能不結合相同類型的金屬，或者與 本發明不使用同樣的幾何構造。有關所述第一種結合標簽的其它信息可以從Haroon等的 美國專利US 7，208，138 B2獲得，并涉及包含序列NXEQVSP的肽。有關所述第二種結合標 簽的信息可以從Arbogast等的美國專利申請公開20040018974獲得，并涉及似乎是其中所 述完整蛋白質的標簽序列。可以在生物體的遺傳材料中編碼、用于蛋白質重組表達的標簽已廣泛用于蛋白質 產品的純化和鑒定。其最出名的實例是His-tag技術，該技術提供了通過使用固定化金屬 親和層析(immobilized metal affinitychromatography, IMAC)從完整細胞中有效分離帶 標簽蛋白質的簡便方法。已開發了多種其它的基于肽之標簽用于通過使用識別該肽標簽的 抗體來檢測細胞培養測定或細胞溶解物中的帶標簽蛋白質。這些技術可用于原位或體外測 定，但是它們一般不能用于體內分析。肽標簽的優點在于，標簽與目的蛋白質共價結合，而 無需另外的化學步驟標記蛋白質。MRI成像是研究活的動物和人的結構特征的常用方法。這一技術安全并且是非介 入性的。已開發了造影劑以改善該方法的靈敏度，以及用于加強MRI圖像中觀察到的特征。 之所以得到改善，是由于造影劑中包含改變了來自鄰近分子(通常是水)之信號的金屬。 最常用的試劑螯合Gd(III)，但是其它金屬可用于增強對比度。含有Gd的造影劑不能用于 患有腎功能損傷的患者，因為可能會引發已知如腎源性系統性纖維化或腎源性纖維性皮膚 病的嚴重并發癥。需要替代性的成像劑來滿足這些患者的需求。螯合金屬的化合物還用于 PET和SPECT成像中以觀察分子水平的細節。

發明內容
本公開內容一般性地涉及三肽基序以及使用該基序的方法。這些肽具有結合金屬 的能力，這使得它們可用于多種應用。特別地，本公開內容的三肽可應用于成像、研究、化學 療法和螯合療法。根據一些實施方案，本公開內容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽的組合物，其中X是使得^(C1C2能夠以平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有地結合金屬的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。根據另一些實施方案，本公開內容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽和金屬的組 合物，其中所述金屬與所述三肽絡合，X是使得三肽和金屬形成具有平面四方形取向或四角 錐形取向或兩者兼有的絡合物的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨 立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。根據另一些實施方案，本公開內容提供了包括使金屬與具有序列^(C1C2之三肽絡 合以形成金屬-XC1C2絡合物的方法，其中X是使得金屬-XC1C2絡合物具有平面四方形取向 或四角錐形取向或兩者兼有的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨立 地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。對于本領域技術人員來說，在閱讀了以下實施方案的描述后，本發明的特征和優 點將變得顯而易見。


參考以下描述并結合附圖可以更全面地理解本發明。圖1顯示結構1——GGH樣金屬絡合物NGH，具有4個N配位。結構2和結構3—— GGH樣結構，其包括金屬與若干去質子化主鏈N原子發生配位。圖2顯示人PRL酶(包括PRl-l、PRL-2和PRL-3) C端部分的序列比對。PRL-1的 H166是顯示為藍色的NGH基序的一部分。PRL-I的C170和C171殘基是顯示為紅色(框) 的CaaX基序的一部分。NCC基序用粗體標出。圖3顯示A.在pH 10下獲得的結合鎳之三肽的ESI-MS譜圖，其中所示質量表明 鎳與肽結合。B.將樣品的pH降至5之后的ESI-MS譜圖，其顯示鎳從肽中釋放出來。圖4顯示Cu-NCC磁共振成像(MRI)。圖5顯示在切割和除去His-標簽后，在pH 7. 4下，在Ni (II)存在下純化的純化 野生型PRL-I的照片。照片顯示其特征性的鐵銹色。圖6顯示A)在Ni2+離子存在下純化的PRL-I變體的電子吸收譜。在800 200nm 之間記錄每種蛋白質變體的三(兩)幅譜圖，并取平均值。所有變體的蛋白質濃度為5mg/ ml至10%以內(基于A280比較)。所顯示的是700 300nm的譜圖。可見的特征為吸收 最大值位于318nm和421nm。插圖以便于觀察421和526nm處吸收最大值的更小比例顯示 600 400nm的譜圖。各曲線如下PRL-1_WT，黑色(最上部)；PRL-1-H166A，紅色(緊鄰最 上部)；PRL-l-CHOS-CniS，橙色(底部)；PRL-1-C170S，綠色(緊鄰底部)；PRL-1-C171S, 藍色(中部)。B)PRL-I野生型的解析譜圖，使用5條曲線將經Ni純化的PRL-I野生型蛋 白在300 700nm之間的紫外-可見光解析譜圖與數據擬合。將318nm肩部(shoulder) 解析成306、325和372nm的峰。顯示了經解析的吸收峰(灰色虛線)和原始數據(黑色實 線)的總和。還存在421和526nm的峰。本專利或申請文件包含至少一幅彩圖。經請求和支付必要費用后，可以從專利局 獲得包括彩圖的本專利或專利申請公布文件的副本。盡管本公開內容允許多種改動和替代性形式，但是附圖中顯示了具體實施例實施方案并且在本文中進行了詳細描述。然而，應當理解，對具體實施例實施方案的描述不旨在 限制本發明至所公開的特定形式，與之相反，本公開內容將覆蓋所附權利要求定義的所有 改動和等同形式。發明詳述本發明一般性地涉及短肽基序和使用該基序的方法。這些肽具有選擇性地結合金 屬的能力，這使得它們可用于多種應用。特別地，本發明的肽可應用于成像、研究、化學療法 和螯合療法。一般地，本公開內容涉及與選定金屬強烈結合的短的新型肽基序，稱為MAP標簽。 因此，這些MAP標簽可用于從組合物中提取選定金屬等。本公開內容的MAP標簽的長度為 三個氨基酸，并且可以位于較長多肽和蛋白質的N端、C端或其間任意位置。然而，在一些 實施方案中，將MAP標簽置于多肽或蛋白質構型中使MAP標簽展示(用于結合金屬)的位 置(例如該金屬存在在環狀物表面)可以是有利的。MAP標簽還可以與非肽實體連結。此 外，可以使特定分子上存在多于一個MAP標簽。已知多種蛋白質與金屬結合。但是，此類結合通常利用折疊蛋白質結構中不連續 的氨基酸序列來實現緊密結合，一旦該蛋白質解折疊，則很容易釋放出金屬。另一方面，金 屬與MAP標簽的結合通過使用非常靠近的原子來實現，因此需要極端的條件才能釋放出金 屬。蛋白質的熱變性和化學變性允許金屬的緩慢釋放。例如，使用極端條件(如沸騰溫度、 強酸)可以在一段時間(如幾個到很多個小時)內緩慢釋放金屬。A.化學結構在一些實施方案中，本公開內容提供了新的基于肽的標簽或金屬結合劑(MAP標 簽)。該MAP標簽可用于在多肽或蛋白質中直接編碼高親和力的金屬結合位點。本公開內 容的MAP標簽的特征在于，它們能夠以平面四方形或四角錐形幾何構造結合金屬。1.肽序列本公開內容的MAP標簽一般地包含能夠結合金屬的至少三個連續氨基酸殘基。本 公開內容的MAP標簽一般地具有表示為XC1C2的序列，其中C1和C2可以相同或不同并且可 以是半胱氨酸或半胱氨酸樣非天然氨基酸(如含硫的α-或β-氨基酸)，X可以是另一種 天然或非天然的氨基酸或氨基酸類似物(只要所形成的肽標簽能夠以平面四方形或四角 錐形幾何構造結合金屬即可)。本文使用的L-氨基酸對映體的縮寫形式是常規的(如下所 示)表1 天然氨基酸的縮寫氨基酸單字母符號三字母符號丙氨酸AAla精氨酸RArg天冬酰胺NAsn天冬氨酸DAsp半胱氨酸CCys谷氨酸EGlu谷氨酰胺QGln甘氨酸GGly
組氨酸HHis異亮氨酸 IIle亮氨酸LLeu賴氨酸KLys甲硫氨酸 MMet苯丙氨酸 FPhe脯氨酸PPro絲氨酸SSer蘇氨酸TThr色氨酸 W Trp酪氨酸Y Tyr纈氨酸V Val在一些實施方案中，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺⑴)、組氨酸(H)、賴氨酸(K) 或精氨酸(R)。當氨基酸序列用三字母或單字母氨基酸縮寫表示時，應當理解左側方向是氨基端 方向，右側方向是羧基端方向，這與標準用法和慣例是一致的。本公開內容的MAP標簽可以采用任意重組技術系統與基因或用于表達的核苷酸 序列一同編碼。此外，還可以通過使用針對肽或蛋白質生產的任意合成或生物合成方法將 所述MAP標簽摻入肽或蛋白中。在應用中，所述MAP標簽自發地與金屬反應，形成肽-金屬 絡合物。這種肽-金屬絡合物可以在溶液中形成或者通過金屬交換或任何其它過程而形 成。所述MAP標簽可以單獨使用，或者作為可連接至多肽鏈之N-端、C-端的標簽或插 入多肽鏈內柔性接頭或環中的標簽。除了參與金屬配位的側鏈以外，所述MAP標簽可以在 任意位置進行修飾。相應地，所述MAP標簽可包含如Z-XC1C2-Z1的序列，Z可以為任意氨基 酸或任意氨基酸序列，Z1可以是與Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基酸 如上表1所示。該表中未列出非天然氨基酸和氨基酸類似物，但是可將它們摻入Z、Z1和/ 或X中。在一些實施方案中，所述MAP標簽可以連接置另一分子。例如，所述MAP標簽可以 連接至非肽實體(如碳水化合物，例如透明質酸)。該連接可以是共價的，也可以通過接頭 進行連接。在一些實施方案中，所述MAP標簽可包含以下序列=NC1C2 ；Z-NC1C2-Z1 ；Z-NC1C2 ； NC1C2-Z1 ； QC1C2 ；Z-QC1C2-Z1 ；Z-QC1C2 ； QC1C2-Z1 ；HC1C2 ； Z-HC1C2-Z1 ； Z-HC1C2 ；HC1C2-Z1 ；KC1C2 ； Z-KC1C2-Z1 ；Z-KC1C2 ；KC1C2-Z1 ；RC1C2 ；Z-RC1C2-Z1 ；Z-RC1C2 或 RC1C2-Z10 如上所述，Z 可以為任 意氨基酸或氨基酸序列，Z1可以為與Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基 酸如上表1所示。該表中未列出非天然氨基酸和氨基酸類似物，但是可將它們摻入Z和Z1 中。在一些實施方案中，所述MAP標簽包含具有如下結構式的NCC
權利要求
1.組合物，其包含具有序列^(C1C2的三肽，其中X是使得^(C1C2能夠以平面四方形取向 或四角錐形取向或兩者兼有地結合金屬的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中 C1和C2獨立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。
2.權利要求1的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
3.權利要求1的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
4.權利要求1的組合物，其還包含如下非肽實體，所述非肽實體包含具有序列^(C1C2的 三肽。
5.組合物，其包含具有序列^(C1C2之三肽和金屬，其中所述金屬與所述三肽絡合，其中 X是使得三肽和金屬形成具有平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有的絡合物的任意 氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天 然氨基酸。
6.權利要求3的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
7.權利要求3的組合物，其中所述金屬選自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
8.權利要求3的組合物，其中所述金屬為放射性同位素。
9.權利要求3的組合物，其中所述金屬為62Cu。
10.權利要求3的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
11.權利要求3的組合物，其還包含如下非肽實體，所述非肽實體包含具有序列^(C1C2的三肽。
12.方法，其包括使金屬與具有序列^(C1C2之三肽絡合以形成金屬-XC1C2絡合物，其 中X是使得金屬-XC1C2絡合物具有平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。
13.權利要求12的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
14.權利要求12的組合物，其中所述金屬選自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
15.權利要求12的組合物，其中所述金屬為放射性同位素。
16.權利要求12的組合物，其中所述金屬為62Cu。
17.權利要求12的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
18.權利要求12的組合物，其還包含如下非肽實體，所述非肽實體包含具有序列^(C1C2 的三肽。
19.權利要求12的方法，其中所述金屬存在于生物樣品中。
20.權利要求12的方法，其中所述金屬存在于對象中。
21.權利要求12的方法，其還包括檢測所述金屬-XC1C2絡合物。
22.權利要求12的方法，其還包括對所述金屬-XC1C2絡合物成像。
全文摘要
包含具有序列XC1C2之三肽的組合物，其中X是使得XC1C2能夠以平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有地結合金屬的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸；以及金屬-XC1C2絡合物和形成該絡合物的方法。
文檔編號A61K33/24GK102088991SQ200980127523
公開日2011年6月8日 申請日期2009年5月13日 優先權日2008年5月13日
發明者安托尼·安德魯·瓦爾蒂亞, 瑪麗·伊麗莎白·克勞斯, 珍妮弗·安·斯托厄爾·勞倫斯 申請人:堪薩斯大學