用于提取和純化神經節苷脂的方法

專利名稱：用于提取和純化神經節苷脂的方法
技術領域：
本文描述用于提取和純化神經節苷脂，例如單唾液酸神經節苷脂(GMl)的方法。
背景技術：
帕金森氏病(Parkinson’ s disease,PD)是一種緩慢但持續進行性神經退化性病癥，導致臨床癥狀的時間依賴性惡化。臨床癥狀包括震顫、運動遲緩(緩慢運動)、肌強直、 受損的姿態和平衡、失去自動運動和語音變化。盡管各患者之間存在明顯臨床變異，但抗PD 藥物的目前醫療設備雖短暫卻有效地改善了大多數患者的大部分主要帕金森征兆和癥狀。 盡管傳統藥物療法引起短暫癥狀改良，但功能性殘疾日益惡化。左旋多巴(levodopa)療法的出現已延長了 PD患者的存活，不過這一療法不能減慢癥狀的進展。左旋多巴，一種多巴胺的代謝前體(L-3，4-二羥基苯丙氨酸)，目前是治療 PD的單一最有效藥劑。聯合左旋多巴施用以防止口服施用的左旋多巴或者兒茶酚-0-甲基轉移酶(COMT)抑制劑(例如托卡朋(tolcapme)和恩他卡朋(entracapone))分解代謝； 因而增加血漿半衰期和到達CNS的左旋多巴的百分數。使用左旋多巴療法的一個持續存在的問題是在患者中存在長期療效之后，減少癥狀的有效性在每劑之后持續較短時間。另外， 久而久之會出現運動障礙。持續使用左旋多巴所產生的這些效應是進行性多巴胺變性的結果尚未鑒別出明確減慢或終止PD的進展或者大致上阻止PD患者的不可避免的功能衰退的藥物。迫切需要可緩和臨床進展、修復運動或認知障礙、恢復或增強多巴胺(“DA”)系統殘余部分的功能或者激活補償機制的藥物。然而，迄今所研究的藥劑均未取得神經保護或疾病緩和的令人信服的證據，并且沒有藥劑作為神經修復劑加以研究。臨床前體外和體內研究已顯示GMl挽救受損DA神經元，刺激多巴胺能神經元的存活和修復以及功能性多巴胺能末端的萌芽，增加紋狀體中的DA水平并且上調殘余神經元中的 DA 合成能力。參見例如 “GM1 Ganglioside in the Treatment of Parkinson' s Disease, "Schneider, Ann. N. Y. Acad. Sciences 845，363-73 (2006 年 2 月)。PD 患者中 GMl 的初步臨床研究也顯示在短期使用GMl的患者中的臨床改善，和在使用GMl達五年之久的一小群患者中的最小癥狀進展，隨后在停止長期GMl使用后癥狀存在顯著進展。因此，一種治療PD的可能成功的途徑是由施用例如GMl等藥劑組成，所述藥劑可使受損或垂死的DA神經元穩定化，刺激新的多巴胺能纖維和末端萌芽，或增強殘余多巴胺能神經元的功能，或者刺激或維持補償過程。GM 1，一種單唾液酸神經節苷脂，是神經細胞膜的正常組分，并且已知它調節多種細胞表面和受體活性以及在神經元分化和發育、蛋白質磷酸化和突觸功能中起重要作用。在數種臨床前研究中，在中樞神經系統出現不同類型的病變之后用GMl長期治療已引起生物化學和行為恢復，并且這些效應在受損DA系統中尤其令人印象深刻。迄今為止，臨床上使用的唯一的GMl形式一直來源于牛腦。每個腦所獲得的有限量的GMl和與腦提取程序有關的成本已限制了 GMl作為商業化產品的發展。此外，使用母牛的腦作為GMl來源使得有理由擔憂朊病毒疾病，例如牛海綿狀腦病(“瘋牛病”)。對于提取和純化GM 1的新的改良方法，特別是使用非牛來源的方法存在持續且未滿足的需要。

發明內容
本發明公開用于從非牛來源提取和純化神經節苷脂，例如單唾液酸神經節苷脂GMl的新方法。本文提供一種通過制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織來分離GMl神經節苷脂的方法，所述方法包括從組織分離GMl神經節苷脂生成細胞；在促進GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從培養物分離GMl神經節苷脂。GMl生成細胞可為神經細胞。另一方面，所述細胞可為成纖維細胞。如本文所用，GMl生產細胞是與正常細胞相比以基線水平或以升高的水平表達GMl的細胞。在另一實施方案中，所述方法可包括從來源于非牛和非豬成纖維細胞的神經細胞分離GMl，所述成纖維細胞是從患有I型GMl神經節苷脂沉積癥的受試者收獲而來。因此，GMl不含BSE污染物。在另一實施方案中，提供一種GMl神經節苷脂組合物，其中所述GMl神經節苷脂組合物是由本文所公開的方法生產，所述方法包括制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織；從所述組織分離GMl神經節苷脂生成細胞；在促進所述GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從所述培養物分離所述GMl神經節苷脂。因此，GMl神經節苷脂大致上不含或不含BSE污染物。通過參考下文發明詳述和實施例可了解其它特征。


圖1描述的表格列出在本文所述的1型培養基中在低&培養物中綿羊海馬細胞的擴增統計資料。圖2描述海馬神經祖細胞的累積群體倍增的線圖。圖3描述的表格列出海馬細胞在本文所述的1型培養基中在低&培養物中的總
倍增和產量。圖4描述的表格列出在本文所述的1型培養基中在低&培養物中綿羊成纖維細胞的擴增統計資料。圖5描述綿羊成纖維細胞的累積群體倍增的線圖。
圖6描述的柱狀圖描述肺相對于硬膜外結締組織的擴增。圖7描述的表格列出肺相對于結締組織的成纖維細胞擴增。
具體實施例方式本文描述用于從來源于患有GMl神經節苷脂沉積癥的綿羊的細胞或從來源于患有GMl神經節苷脂沉積癥的人類患者的細胞純化和提取GMl神經節苷脂作為GMl的穩定且可再生來源的新方法。本文提供一種通過制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織來分離GMl神經節苷脂的方法，所述方法包括從組織分離GMl神經節苷脂生成細胞；在促進GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從培養物分離GMl神經節苷脂。GMl生成細胞可為神經細胞。另一方面，所述細胞可為成纖維細胞。如本文所用，GMl生產細胞是與正常細胞相比以升高的水平表達GMl的過度產生細胞。具體說來，所述細胞可來源于患有神經節苷脂沉積癥的綿羊和/或人類。可分離和制備細胞的組織包括腦部的半卵圓中心、小腦皮質、海馬、尾狀頭、額葉、 頂葉皮質或腦室壁、顆粒下區或者腦室襯里區。從這些不同區域提取的細胞的任何組合均可在本發明方法中擴增和培養。GM生產細胞為來源于表皮組織或肺組織的成纖維細胞，其中GMl生產細胞包括核心腦組織細胞或祖細胞。另一方面還公開一種制備非牛或非豬組織的方法，所述方法包括切下組織部分；將所述組織固定于轉運培養基中，其中所述培養基可為高葡萄糖DMEM、4mM L-谷氨酰胺、5-10%、10-20%或20-30 %胎牛血清、MEM非必需氨基酸溶液IX、青霉素(penicillin) 100U/ml、鏈霉素(streptomycin)、雙霉素(amphomycin)禾口慶大霉素 (gentamycin)；以及在足以維持所述細胞擴增的溫度下冷凍組織。在一個實施方案中，神經細胞來源于GMl神經節苷脂被過表達的腦組織，或來源于患有GMl神經節苷脂沉積癥的腦。神經細胞可具有0-半乳糖苷酶缺陷，導致與正常細胞相比GMl過表達。所述方法中使用的神經細胞可具有部分a_神經氨酸酶活性。在另一實施方案中，所述方法可包括從非牛和非豬成纖維細胞分離GM1，所述成纖維細胞是從患有I型GMl神經節苷脂沉積癥的人類受試者收獲而來。因此，GMl不含BSE污染物。本文所使用的BSE污染物意指任何生物分子蛋白、朊病毒蛋白或可經由蛋白的抗體檢測的任何生物分子。GMl的市售來源一般是來自牛并且可以被照射的形式發現以去除可能存在的污染物，但這類來源仍有治療風險。所述典型GMl來源包括Sigma Aldrich0在另一實施方案中，提供一種GMl神經節苷脂組合物，其中所述GMl神經節苷脂組合物是由本文所公開的方法生產，所述方法包括制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織；從所述組織分離GMl神經節苷脂生成細胞；在促進所述GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從所述培養物分離所述GMl神經節苷脂。因此，GMl神經節苷脂大致上不含或不含BSE污染物。本發明涉及使用來源于患有GMl神經節苷脂沉積癥的綿羊的細胞或來源于患有 GMl神經節苷脂沉積癥的人類的細胞來獲得商業上可行的量的GMl神經節苷脂，以便用于治療帕金森氏病和其它神經病癥。神經節苷脂可單獨或與PD患者或患有其它類型的神經退化性疾病(包括但不限于亨廷頓氏舞蹈病(Huntington’ s Disease)等)的患者的標準醫療護理一起施用。單獨GMl或其與其它神經節苷脂的組合可經由皮下或靜脈內注射或經鼻或粘膜施用等來施用。這也可包括延長作用的劑型，并且神經節苷脂可使用控釋制劑(脂質體、納米粒子、微球體)來施用以延長藥物活性。它們也可綴合于適當轉運分子以便越過血腦屏障。患有GMl神經節苷脂沉積癥的綿羊和從這類動物的腦提取GMl和其它神經節苷脂的方法描述于美國專利第5，532，141號中，該專利的全文以引用的方式并入本文。這些動物中的疾病的特征在于0-半乳糖苷酶活性和部分a_神經氨酸酶活性的缺陷，導致動物腦組織中累積大量GMl神經節苷脂(與未患病動物相比達40倍之多)。使用優化的提取程序時，據估計單一神經節苷脂沉積癥綿羊腦將產生l_2g GMl。進一步估計，Ikg患病腦將產生大約15g GM 1。相比之下，據估計Ikg豬腦產生250mg GMl0然而，即使在這些增強的表達水平下，每年仍將需要幾十萬只綿羊來獲得商業量的GMl。使用細胞技術，可以從來源于GMl神經節苷脂沉積癥綿羊的數種可能來源獲得GMl0舉例來說，可以生長且擴增神經前體細胞，使其轉向神經元表型，優化其生長和發育(以及或許甚至使用各種操作來產生GM1，包括但不限于抑制B系列神經節苷脂產生(例如通過抑制⑶3合成酶)和停止A-系列神經節苷脂在GMl處的生物合成途徑，因此避開更多針對GM 1的神經節苷脂產生)且接著從培養的神經細胞以及細胞所脫落的GMl提取GMl到培養基中。也可進行其它改變以增強神經節苷脂脫落和進一步優化神經節苷脂從培養的細胞中的收集。或者或與上文所概述的一般方案組合，成纖維細胞或肝細胞也可在培養物中生長且用作GMl來源。本發明方法中所使用的細胞可來源于腦組織，包括但不限于半卵圓中心、小腦皮質、海馬、尾狀核、大腦皮質、腦室壁或其組合。GMl的另一種可能來源為來自I型(嬰幼兒)GMl神經節苷脂沉積癥患者的成纖維細胞(或肝細胞)。I型GMl神經節苷脂沉積癥患者的細胞傾向于具有小于的正常量的-半乳糖苷酶并且因此其細胞傾向于產生極高水平的GMl神經節苷脂。正常的人成纖維細胞可含有每毫克蛋白質大約0.7nmol GMl0 GMl神經節苷脂沉積癥成纖維細胞可含有每毫克蛋白質多達2.58nmol GMl0從培養的人GMl神經節苷脂沉積癥成纖維細胞獲得的GMl的量將使用最佳細胞生長參數、培養和滋養條件，并且通過確定收獲細胞用于GMl提取的最佳時間來優化。另外，將從GMl I型患者供體篩選數種樣品以發現因在各患者之間不同的半乳糖苷酶缺陷嚴重性而提供最佳GMl累積的細胞系。另外，來自相同患者的肝細胞可用作GMl的替代或補充細胞來源。在獲得來自神經節苷脂沉積癥綿羊的細胞后，有數種可能的方式更進一步提高這些細胞的GMl產量。一種方法將是用低濃度的氯喹(chloroquine)處理細胞，氯喹是一種弱堿，它將引起GMl在核內體(endosome)中和細胞表面上顯著累積(Yuyama等，2006)。另一種方法將是用唾液酸酶(神經氨酸酶)處理細胞，唾液酸酶將使完整細胞上的所有主要的腦復合型神經節苷脂(例如⑶la、⑶Ib和GTlb)轉化為GMl (Schauer等，1980)。另一種方法將是利用非酶方法使用DoWex-50W-H+來催化多唾液酸神經節-N-四糖系列神經節苷脂的高度選擇性去唾液酸作用以便主要產生GMl (Schengrund和Kovac，1999)。使用這些方法，有可能從細胞和膜回收增加量的GMl以及增加脫落到培養基中并從培養基回收的GMl的量。一種通過基于細胞的技術產生GMl神經節苷脂的額外可能方式可包括通過多重基因組工程改造和加速進化來程序性設計細胞以誘導大腸桿菌(E. coli)產生GMl神經節苷脂。使用多重自動基因組工程改造(“MAGE”)，可以工程改造大腸桿菌中GMl的生物合成途徑以便過度產生GMl神經節苷脂。舉例來說，可以同時修飾多個基因組位置以用某些具有任選調整的表達的相關基因和某些受到抑制或被消除以便優化GMl產生并且抑制其它神經節苷脂產生的基因修飾GMl生物合成。大腸桿菌可通過本領域技術人員已知的方法進行修飾，從而經由本領域中已知的標準方法將神經節苷脂基因并入大腸桿菌系統中。舉例來說，標準方法包括分離已被修飾以表達GMl合成酶，從而在培養物中產生GMl的質粒DNA。 其它神經節苷脂生成基因包括⑶3合成酶。大腸桿菌可以在特定條件下生長，在這些特定條件下必要時可在培養基中獲得前體物質，例如合成的乳糖神經酰胺(lactosylceramide) (LacCer，植物來源)和唾液酸(可獲自非動物來源或可合成)。酶活性(例如唾液酸轉移酶、N-乙酰氨基半乳糖基轉移酶、 半乳糖基轉移酶)可利用MAGE方法微調，并且可提供激活劑(用于激活轉移酶的鳥苷三磷酸)，以及N-乙酰氨基半乳糖和半乳糖(這些糖需要轉化為它們的核苷酸衍生物以便用作糖供體)。GMl目前是從牛或豬腦中提取，這一方法產率較低，昂貴。本發明將提供一種安全且高效的基于細胞的GMl神經節苷脂生產方法。它也將提供人GMl神經節苷脂的第一商業來源。除GMl外的其它神經節苷脂種類也可由這一技術生產，并且GMl和其它神經節苷脂可用于多種神經病癥，例如帕金森氏病。描述用于提取、分離和純化腦神經節苷脂的典型程序，其涉及用緩沖的四氫呋喃或本領域中已知的其它適當溶劑充分提取腦；相繼用乙醚和蒸餾水分配提取物；透析所獲得的水相，并且對透析后的硅膠柱溶液進行色譜分析。充分提取后的殘余物含有所有的腦糖蛋白。后面的程序包括以氯仿方法進行提取過程。實施例實施例1接受綿羊腦組織，其包括下列組織來源半卵圓中心、小腦皮質、海馬、尾狀核、大腦皮質(例如額葉、頂葉)和腦室壁。所有組織個別地經由以下方法處理用PIPES緩沖溶液沖洗各組織類型；在含抗生素/抗真菌藥的木瓜蛋白酶(Papain)/DNase I/分散酶(Dispase) (Neutral Protease) 混合液中消化各組織；中和這些酶并且使解離的細胞通過細胞過濾網；細胞離心并且重懸于含有5%含抗生素/抗真菌藥的FBS的DMEM/F12/N2中；細胞計數，接著接種于涂有纖維連接蛋白(fibronectin)2的燒瓶中的培養基中a. 1號培養基類型含有5%含抗生素 / 抗真菌藥的 FBS 的 DMEM/F12/N2 ；補充有 10ng/ml bFGF 和 20ng/ml EGF。Neurocult Proliferation-A培養基；各培養基類型中的細胞在37°C潮濕孵育箱中在低O2和高O2下生長以作比較。
權利要求
1.一種分離GMl神經節苷脂的方法，所述方法包括制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織；從所述組織分離所述GMl神經節苷脂生成細胞；在促進所述GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從所述培養物分離所述GMl神經節苷脂。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述GMl生成細胞是神經細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是成纖維細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述組織是從腦部的半卵圓中心、小腦皮質、海馬、尾狀頭、額葉、頂葉皮質或腦室壁、顆粒下區或腦室襯里區或其任何組合制備。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述GM生產細胞是來源于表皮組織或肺組織的成纖維細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述GMl生產細胞包括核心腦組織細胞。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述GMl生產細胞包括祖細胞。
8.根據權利要求1所述的方法，其中制備非牛或非豬組織包括切下組織部分；將所述組織固定于轉運培養基中，其中所述培養基包含高葡萄糖DMEM、4mM L-谷氨酰胺、5-10%、10-20%或20-30%胎牛血清、MEM非必需氨基酸溶液IX、青霉素(penicillin) 100U/ml、鏈霉素、雙霉素和慶大霉素；以及在足以維持所述細胞擴增的溫度下冷凍所述組織。
9.根據權利要求2所述的方法，其中所述神經細胞來源于GMl神經節苷脂被過表達的腦組織。
10.根據權利要求2所述的方法，其中所述神經細胞來源于患有GMl神經節苷脂沉積癥的腦。
11.根據權利要求2所述的方法，其中所述神經細胞包含0-半乳糖苷酶缺陷。
12.根據權利要求2所述的方法，其中所述神經細胞包含部分a_神經氨酸酶活性。
13.根據權利要求2所述的方法，其中所述神經細胞來源于人成纖維細胞，所述人成纖維細胞是從患有I型GMl神經節苷脂沉積癥的受試者收獲而來。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述GMl不含BSE污染物。
15.一種GMl神經節苷脂組合物，其產生方法包括制備包含GMl生產細胞的非牛和非豬組織；從所述組織分離所述GMl神經節苷脂生成細胞；在促進所述GMl生產細胞的擴增的合適條件下在培養物中擴增所述細胞；在合適條件下在培養物中表達GMl神經節苷脂表達；從所述培養物分離所述GMl神經節苷脂。
16.根據權利要求15所述的GMl神經節苷脂，其中所述GMl不含BSE污染物。
17.—種生產GMl神經節苷脂的方法，所述方法包括從非牛和非豬動物分離所述神經節苷脂。
全文摘要
用于從來源于患有GM1神經節苷脂沉積癥的綿羊的細胞或從來源于患有GM1神經節苷脂沉積癥的人類患者的細胞純化和提取GM1神經節苷脂作為GM 1的穩定且可再生來源的方法。
文檔編號C12P19/26GK102575275SQ201080040771
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月1日 優先權日2009年9月1日
發明者C·巴伯, G·亨伍德, J·S·施奈特, R·佛羅倫提 申請人:Lz治療公司