經過修飾的啟動子的制作方法

專利名稱：經過修飾的啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及經過修飾的啟動子、各自包含該啟動子的表達載體和轉化體、以及使用該轉化體制備目標基因產物的方法。
背景技術：
通過微生物的使用，已經在以工業規模生產很多有用物質，包括食品，例如酒精飲料、味增、和醬油(大豆來源)；以及其他物質，例如氨基酸、有機酸、與核酸相關的物質、抗生素、糖、脂質、和蛋白質。這些物質可用于寬范圍的領域，例如食品、醫藥、諸如洗滌劑和化妝品的日用品、以及化學品的原材料。在通過微生物的介導來工業生產有用物質時，產率的加強是一個重要議題。被用來加強產率的一個手段是通過例如突變的遺傳技術來對產生目標物質的細菌進行育種。近年來，隨著微生物遺傳學和生物技術的發展，人們聚焦于更多基于重組技術等的有效方法， 以用來生產有用物質。已經對基因轉錄所需的啟動子進行了大量研究。就枯草桿菌而言，來源于芽孢桿菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的堿性纖維素酶基因的啟動子域(參見，例如非專利文獻 1)、來源于芽孢桿菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的堿性纖維素酶基因上游所存在的啟動子域(參見，例如專利文獻1和非專利文獻幻、以及其他啟動子域被用作使編碼外源蛋白質或多肽的基因活躍轉錄的啟動子域。然而，為在工業生產中減少生產成本，需要實現更高產率的啟動子或微生物。通常來說，啟動子域具有多個與轉錄調控相關的位點。通過外部信號的介導，這些位點在促進或抑制基因表達中發揮作用。例如，當微生物的培養基包含大量例如葡萄糖的降解物時，微生物主要將該降解物作為碳源進行利用，且用于降解高分子糖的酶的表達被抑制。這種現象被稱為“降解物阻遏”，其曾在大腸桿菌、芽孢桿菌等中被觀察到。已知枯草桿菌中的降解物阻遏發生在轉錄水平。芽孢桿菌中涉及降解物阻遏的區域被稱為“降解物應答元件(ere) ”。非專利文獻3已經公開，可以通過在來源于枯草桿菌的α -淀粉酶基因的降解物阻遏操縱基因域上進行點突變來增加或減少降解物阻遏。同時，在來源于枯草桿菌的內切葡聚糖酶的啟動子中，有一段與α-淀粉酶的降解物阻遏域相似的核苷酸序列，其被稱為 “降解物阻遏操縱基因類似序列”(非專利文獻2)。然而，該序列的真正作用還沒有被闡明。[專利文獻 1] JP-A-2000-210081[非專利文獻 1] Sumitomo et al. , Biosci. Biotech. Biochem. , 59 :2172-2175, 1995[非專利文獻2]Hakamada et al. , Biosci. Biotech. Biochem. 64 :2281-2289, 2000[非專利文獻 3]Weickert & Chambliss, Proc, Natl. Acad. Sci.USA,87 6238-6242，1990

發明內容
本發明涉及經過修飾的啟動子，其包含來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子的核苷酸序列，其中至少一個選自如下的核苷酸序列被修飾SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列；與SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；以及相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。本發明也涉及用于制備經過修飾的啟動子的方法，該方法包括在來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子中修飾至少一個選自如下的核苷酸序列SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列；與SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；以及相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。本發明也涉及上述經過修飾的啟動子或通過上述方法制備的經過修飾的啟動子， 其中一個或多個堿基被進一步取代、缺失、添加或插入。本發明也涉及表達載體，其包含上述經過修飾的啟動子或通過上述方法制備的經過修飾的啟動子。本發明也涉及轉化體，其包含上述經過修飾的啟動子或通過上述方法制備的經過修飾的啟動子。本發明也涉及制備目標基因產物的方法，該方法包括采用轉化體。在一個實施方式中，包含相對于SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。在另一個實施方式中，來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自枯草桿菌或枯草桿菌突變菌株的啟動子。在另一個實施方式中，來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自芽孢桿菌 KSM-64菌株(FERM BP-2886)中堿性纖維素酶基因的啟動子；來自芽孢桿菌KSM-S237菌株 (FERM BP-7875)中堿性纖維素酶基因的啟動子；或含有相對于任意上述啟動子的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列、并具有ere類似序列的啟動子。在另一個實施方式中，核苷酸序列的修飾是核苷酸序列中堿基的缺失、取代或添加。在另一個實施方式中，經過修飾的啟動子被可操作性地(operably)連接至編碼目標基因產物的基因的上游。


[圖1]通過SOE-PCR法制備具有缺失的突變啟動子的流程。[圖2]制備pDL2-S237質粒的流程。[圖3]本發明中轉化體以及野生型的β-半乳糖苷酶活性。A 在含有葡萄糖的培養基中的活性。B:在含有麥芽糖的培養基中的活性。C:在含有山梨醇的培養基中的活性。 D 在含有模型糖化液的培養基中的活性。
具體實施方式
本發明涉及提供加強基因轉錄的經過修飾的啟動子、各自含有該啟動子的表達載體和轉化體、以及通過使用該轉化體制備目標基因產物的方法。本發明者已經在屬于芽孢桿菌屬微生物中的纖維素酶基因的啟動子域上發現了多個與降解物阻遏序列相似的序列。本發明者也已經發現，當這些發現的序列被突變時，由該啟動子調控的基因表達顯著增加，且由該基因編碼的基因產物的產率增加。本發明的經過修飾的啟動子顯著增加了與啟動子下游相連的基因的轉錄量。因此，根據本發明，可更加有效地獲得目標基因產物。在本發明中，氨基酸序列之間的序列一致性以及核苷酸序列之間的序列一致性都是通過Lipman-Pearson法(Science，227，1435 (1985))確定的。具體而言，序列一致性是通過使用遺傳信息處理軟件Genetyx-Win(Software Development Co. , Ltd.)的同源性分析(同源性檢索)程序來分析計算，其中參數ktup (Unit size to compare)設為2。除非另外指出，用在本說明書中的枯草桿菌DNA的核苷酸序列和堿基號都是基于枯草桿菌轉錄因子檢索網站(http://dbtbs. hgc. jp)。本發明的經過修飾的啟動子是通過修飾與降解物應答元件(下文中稱為“ere類似序列”)相似的核苷酸序列而制備的，其中該降解物應答元件存在于編碼啟動子的多核苷酸上，該啟動子來源于含有ere類似序列的屬于芽孢桿菌屬微生物的基因。ere類似序列的例子包括SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；以及與SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入。ere類似序列的例子還包括相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高、優選80%或更高、更優選90%或更高的序列一致性的核苷酸序列。再次，“多個”是指1 6個，優選為1 3個。取代、缺失、添加或插入堿基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，581-621，1995)中有過公開。通過采用該技術,一個或多個堿基可以被取代、缺失、添加、或插入。對于確認目標序列是否為ere類似序列，例如，可以通過以類似于下述實施例的方式，在將突變引入序列中時，觀察目標基因在例如葡萄糖的降解物的存在下加強表達來進行。相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有 70%或更高序列一致性的核苷酸序列的例子包括SEQID NO :2所表示的核苷酸序列。SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列與SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相當，只是其中三個堿基被取代。因此，SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列，具有76. 9%的同源性。對于來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子，而且本發明的經過修飾的啟動子是由該啟動子制備而得到的，即，該啟動子是對應于本發明的經過修飾的啟動子的親本啟動子， 則沒有特別的限制，只要該親本啟動子來源于屬于芽孢桿菌屬細菌且含有ere類似序列。 優選該親本啟動子來源于枯草桿菌或枯草桿菌的突變菌株。優選的親本啟動子的例子包括來源于芽孢桿菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的堿性纖維素酶基因的啟動子(SEQ ID N0: 3中的1 609號堿基)、和來源于芽孢桿菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的堿性纖維素酶基因的啟動子(SEQ ID NO 4中的1 572號堿基)。SEQ ID NO 1和2所表示的核苷酸序列，分別對應于來自SEQ ID NO :3中1 609號堿基所表示的KSM-64菌株的堿性纖維素酶基因的啟動子中的399 412號以及沈4 276號堿基的核苷酸序列，并且分別對應于來自SEQ ID NO :4中1 572號堿基所表示的KSM-S237菌株的堿性纖維素酶基因的啟動子中的359 372號以及223 235號堿基的核苷酸序列。本發明中親本啟動子的其他例子包括來源于屬于芽孢桿菌屬細菌且具有ere類似序列的啟動子，其具有與SEQ ID NO :3或4表示的堿性纖維素酶基因的啟動子的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；或相對于SEQ ID NO :3或4所表示的堿性纖維素酶基因的啟動子的核苷酸序列，具有70%或更高、優選為 80%或更高、更優選為90%或更高、甚至更優選為95%或更高、更優選為98%或更高的序列一致性的核苷酸序列。對于啟動子是否具有ere類似序列的證實，可以通過測序來確認 ere類似序列在啟動子的核苷酸序列中的存在；或者通過比較啟動子的序列與SEQ IDNO 3或4所表示的堿性纖維素酶基因的啟動子的序列來識別與ere類似序列對應的區域來進行。取代、缺失、添加或插入堿基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，581-621，1995)中公開。通過采用這個技術,一個或多個堿基可以被取代、缺失、添加或插入。對于鑒定啟動子序列，例如通過以類似于下述實施例的方式，在引入LacZ基因時觀察β -半乳糖苷酶的表達來進行。在親本啟動子包含兩種或更多種ere類似序列的情況下，至少一種存在于親本啟動子中的ere類似序列的核苷酸序列可以被修飾。換言之，一種、兩種或更多種、或全部存在于親本啟動子中的ere類似序列可以被修飾。例如，當親本啟動子具有兩種由SEQ ID N0 1和2表示的ere類似序列時，僅有由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO 2 表示的核苷酸序列可以被修飾，或者由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2表示的兩種核苷酸序列可以被修飾。優選由SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2表示的兩種核苷酸序列均被修飾。在一個實施方式中，本發明中經過修飾的啟動子是通過修飾至少一種存在于來自枯草桿菌或枯草桿菌突變菌株的啟動子中的ere類似序列而制備的。在另一個實施方式中，本發明中經過修飾的啟動子是通過在來源于KSM-64菌株 (FERM BP-2886)的堿性纖維素酶基因的啟動子(SEQID NO :3中1 609號堿基)中修飾由264 276號堿基表示的ere類似序列和由399 412號堿基表示的ere類似序列中的至少一種而制備的。優選地，由264 276號堿基表示的ere類似序列和由399 412號堿基表示的ere類似序列都被修飾。在另一個實施方式中，本發明中經過修飾的啟動子是通過在來源于KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的堿性纖維素酶基因的啟動子(SEQ ID NO :4中1 572號堿基)中修飾由223 235號堿基表示的ere類似序列和由359 372號堿基表示的ere類似序列中的至少一種而制備的。優選地，由223 235號堿基表示的ere類似序列和由359 372 號堿基表示的ere類似序列都被修飾。ere類似序列的核苷酸序列的修飾的例子包括核苷酸序列中部分或全部堿基的缺失、核苷酸序列中部分或全部堿基的取代、以及在核苷酸序列中任意位點上堿基的添加。用于本文中的術語“部分堿基”是指1個或更多個堿基，優選為3個或更多個堿基，更優選為 6個或更多個堿基，甚至更優選為10個或更多個堿基。堿基的缺失、取代、或添加可以通過技術領域內常用的方法來進行，例如定點突變(site-directed mutagenesis)。定點突變可以通過 Kunkel 法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，82，488，1985)、PCR 等來進行。或者，本發明中經過修飾的啟動子可以通過SOE(重疊延伸剪切)-PCR法(Gene， 77，51，1989)來制備，其中在存在于啟動子中的ere類似序列的核苷酸序列上，堿基被缺失、取代、或添加。根據SOE-PCR法，在下游端含有核苷酸序列修飾位點的上游DNA片段、以及在上游端具有核苷酸序列修飾位點的下游DNA片段都通過第一 PCR來制備。在制備出ere類似序列缺失的片段的情況下，設計引物，從而使得上游DNA片段的下游側以及下游DNA片段的上游側相互地退火，并得到ere類似序列缺失的核苷酸序列(圖1)。接下來，通過使用由第一 PCR制備的兩個DNA片段作為模板、上游DNA片段的上游引物、和DNA片段的下游引物來進行第二 PCR。結果，在上游DNA片段的下游端與下游DNA 片段的上游端之間發生退火，從而兩個DNA片段互相連接。因此，制備出含有ere類似序列缺失的啟動子序列的DNA片段(圖1)。在這種情況下，當PCR中采用的引物被設計成具有限制性內切酶識別序列(restriction sequence)時，制備出在末端包含限制性內切酶識別序列的啟動子DNA片段，并通過限制性內切酶法引入到載體中。相似地，當設計出引物從而使得上游DNA片段的下游側和下游DNA片段的上游側相互退火并制備出包含至少一個堿基被取代或添加的ere類似序列的核苷酸序列時，可以制備出包含至少一個ere類似序列的堿基已經被取代或添加的啟動子序列的DNA片段。在本發明的經過修飾的啟動子中，一個或多個堿基可以被進一步取代、缺失、添加或插入，只要能保持啟動子的功能和增強目標基因表達的效果。取代、缺失、添加、或插入堿基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York, 581-621,1995)中公開。通過采用這個技術，一個或多個堿基可以被取代、缺失、添加或插入。對于確認進一步被修飾的修飾啟動子是否具有啟動子功能且表現出加強目標基因表達的作用，例如，可以通過以類似于下述實施例的方式在例如葡萄糖的降解物的存在下觀察加強目標基因表達的效果。通過將本發明的由此制備的經過修飾的啟動子引入至合適的載體中，可以制備本發明的表達載體。對于引入經過修飾的啟動子的載體沒有具體的限制，且優選例如PDL2和 PMUTIN的載體。將經過修飾的啟動子引入至載體中可以根據任何本領域常用的方法進行。 例如，通過限制性內切酶的方式切割載體，并結合在末端含有上述限制性內切酶識別序列的啟動子，從而將啟動子引入到載體中(限制性內切酶法)。在本發明的表達載體中，本發明中經過修飾的啟動子被可操作性地連接至編碼目標基因產物的基因的上游。目標基因產物的例子包括蛋白質、多肽和非編碼RNA。對于蛋白質和多肽的種類沒有具體限制，且蛋白質或多肽包括用于例如洗滌劑、食品、纖維、飼料、 化學品、醫療、和診斷的工業用酶；以及生理活性肽。工業用酶的例子包括氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、和連接酶/合成酶。優選例如纖維素酶、α-淀粉酶和蛋白酶的水解酶基因。水解酶的具體例子包括由多糖水解酶分類所定義的屬于第5族的纖維素酶(Biochem. J.，280，309，1991)。其中，優選來源于微生物，例如屬于芽孢桿菌屬的微生物的纖維素酶。更具體的例子包括來源于芽孢桿菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列構成的堿性纖維素酶；來源于芽孢桿菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的由SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列構成的堿性纖維素酶；和相對于由SEQ ID NO :3或4表示的氨基酸序列，具有70%或更高、優選80%或更高、更優選90%或更高、甚至更優選95%或更高、更優選98%或更高的序列一致性的氨基酸序列構成的纖維素酶。α -淀粉酶的具體例子包括來源于微生物的α -淀粉酶。優選來源于屬于芽孢桿菌屬微生物的液化α-淀粉酶。更具體的例子包括來源于芽孢桿菌KSM-K38菌株(FERM ΒΡ-6946)的由SEQ ID NO :5表示的氨基酸序列構成的堿性淀粉酶；和相對于由SEQ ID NO: 5表示的氨基酸序列，具有70%或更高、優選80%或更高、更優選90%或更高、甚至更優選 95%或更高、更優選98%或更高的序列一致性的氨基酸序列構成的淀粉酶。蛋白酶的具體例子包括來源于屬于例如芽孢桿菌屬微生物等微生物的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。優選地，上述蛋白質基因或多肽基因被可操作性地連接到本發明經過修飾的啟動子區域以及分泌信號肽區域。例如，目標蛋白質或多肽的結構基因可以被可操作性地連接到來源于KSM-64菌株(FERMBP-2886)或KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的纖維素酶基因中的分泌信號肽區域。更加具體地，目標蛋白質或多肽的結構基因可以可操作性地連接至由SEQ ID NO 3的610 696號堿基表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO 4的573 659號堿基表示的核苷酸序列；相對于任意上述核苷酸序列，具有70%或更高、優選80%或更高、 更優選90%或更高、甚至更優選95%或更高、更優選98%或更高的序列一致性的核苷酸序列構成的DNA片段；或與任意核苷酸序列相當的DNA片段，只是部分堿基缺失。非編碼RNA是指在相應DNA的轉錄之后不翻譯為蛋白質的RNA。非編碼RNA的例子包括含有調控序列的非翻譯區域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(mRNA類似非編碼RNA)、 snRNA (核內小 RNA)、snoRNA (核內小 RNA)、miRNA (微小 RNA)、stRNA (時序小 RNA)、禾口 siRNA (短干擾RNA)。這些非編碼RNA涉及多個生物活性的機制，例如細胞表達、發育、分化和其他的調控，且可以在研究、醫療護理、診斷、藥物開發、農業(例如飼養或殺蟲劑生產)、 漁業、畜牧業、和化學制備中加以利用。本發明中經過修飾的啟動子和編碼目標基因產物或分泌信號肽區域的基因可以在將其引入載體前進行連接。或者，可以將本發明中經過修飾的啟動子引入至已經含有編碼目標基因產物的基因的載體或者還另外含有分泌信號肽區域的載體中。本文中使用的在啟動子和基因之間；或啟動子、基因和分泌信號之間的術語“可操作性地連接”，是指啟動子可以誘發基因的轉錄的連接、或者是通過分泌信號來分泌基因所編碼的蛋白質的連接。啟動子和基因之間；或啟動子、基因和分泌信號之間的“可操作性地連接”的過程是本領域技術人員所知的。通過將本發明所制備的表達載體通過普通轉化方法引入至宿主微生物中，得到本發明的轉化體。或者，本發明的轉化體也可以制備如下構建DNA片段，其中，與宿主微生物的基因組同源的合適區域、與以下片段相結合，該片段是通過使本發明中經過修飾的啟動子與編碼目標基因產物的基因、以及任選地分泌信號肽區域連接而制備的；并通過同源重組，直接將該DNA片段引入至宿主微生物的基因組。也可以使用普通重組技術，通過將本發明的表達載體引入至宿主微生物中來提供本發明的轉化體。目標基因產物可以使用本發明的轉化體并通過以下過程而制備將轉化菌株接種到含有可同化碳源、氮源、和其他必要成分的培養基中；通過普通培養方法培養轉化體；以及接下來收集或純化目標基因產物。如下文中實施例所述，與ere類似序列未被修飾的微生物相比，本發明的轉化體表現出更高的目標基因產物的產率。實施例本發明將通過實施例的方式做更加具體的描述。
實施例1制備來源于堿性纖維素酶基因的經過修飾的啟動子通過PCR制備來源于KSM-S237纖維素酶的啟動子DNA片段(Hakamada et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem. 64，2281-2289, 2000)。將已經被引入至大腸桿菌-枯草桿菌用的穿梭載體PHY300PLK中且為來源于芽孢桿菌KSM-S237堿性纖維素酶基因DNA(SEQ ID N0:4的1 572號堿基)中的啟動子區域的片段用作模板。將表1所示的EcoRI_ PS237Fff(SEQ ID NO :6)和 BamHI_PS237RV(SEQ ID NO :7)用作引物。使用上述模板和引物，通過PCR來制備上游側具有EcoRI識別位點且下游側具有BamHI識別位點的啟動子DNA 片段。之后，為制備啟動子DNA片段中目標序列被缺失的突變啟動子DNA片段，使用通過上述PCR制備的片段作為模板、以及各自在表1所示的AcrelFW(SEQ ID NO 8)和BamHI_ PS237RV的引物組或者EcoRI_PS237FW和AcrelRV(SEQ ID NO 9)的引物組來進行PCR，從而制備出分別在上游側和下游側含有目標序列缺失的區域的片段。將這樣得到的兩個片段相結合來用作混合模板。使用混合模板和EcoRI_PS237FW引物以及BamHI_PS237RV引物來進行PCR，以制備在SEQ ID NO :4表示的核苷酸序列中223 235堿基殘基被缺失的啟動子序列DNA片段(Acrel)(圖1)。以相似的方式，通過使用Acre2Fff(SEQ ID NO :10)來替代 AcrelFW，并用 Acre2RV(SEQ ID NO :11)來替代 Δ crelRV 以制備在 SEQ ID N0:4 表示的核苷酸序列中359 372堿基殘基被缺失的啟動子域序列DNA片段(Δ cre2)。進而，使用 Δ crel 作為模板、以及 Δ cre2FW和 BamHI_PS237RV 引物組或EcoRI_PS237FW和 Δ cre2RV 引物組來進行PCR。使用由此得到的這兩個片段作為混合模板，使用EcoRI_PS237FW和BamHI_ PS237RV引物來進行PCR，從而制備出在SEQ ID NO :4表示的核苷酸序列中223 235以及 359 372堿基殘基被缺失的啟動子序列DNA片段(Δ crel. 2)。為擴增DNA片段，通過GeneAmp PCR系統(Applied Biosystems的產品)的方式以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio的產品)和其附帶試劑的使用來進行PCR。制備 PCR液(50 μ L)，以便將適當稀釋模板DNA片段(1 μ L)、正義鏈引物和反義鏈引物中的每一個(每個IOpmol)、和Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U)進行組合。PCR包括30個循環的3步熱處理(98°C, IOsec ；55°C，30sec ；和 72°C，1 5min(約 lmin/kb，根據目標產物調節))， 并在72°C反應5min。[表 1]
權利要求
1.一種經過修飾的啟動子，其包含來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子的核苷酸序列，其中至少一個選自如下的核苷酸序列被修飾SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；與SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；以及相對于SEQ ID N0:1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的經過修飾的啟動子，其中，所述相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的經過修飾的啟動子，其中，所述來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自枯草桿菌或枯草桿菌的突變菌株的啟動子。
4.根據權利要求3所述的經過修飾的啟動子，其中，所述來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自芽孢桿菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中堿性纖維素酶基因的啟動子；來自芽孢桿菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中堿性纖維素酶基因的啟動子；或含有相對于任意所述啟動子的核苷酸序列具有70%或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有ere類似序列的啟動子。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的經過修飾的啟動子，其中，所述核苷酸序列的修飾是在所述核苷酸序列中堿基的缺失、取代、或添加。
6.一種用于制備經過修飾的啟動子的方法，其包括在來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子中修飾至少一個選自如下的核苷酸序列SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；與SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；以及相對于SEQ ID N0:1所表示的第一核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述相對于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中，所述來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自枯草桿菌或枯草桿菌突變菌株的啟動子。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子是來自芽孢桿菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中堿性纖維素酶基因的啟動子；來自芽孢桿菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中堿性纖維素酶基因的啟動子；或含有相對于任意所述啟動子的核苷酸序列具有70%或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有ere類似序列的啟動子。
10.根據權利要求6 9中任一項所述的方法，其中，所述核苷酸序列的修飾是所述核苷酸序列中堿基的缺失、取代或添加。
11.根據權利要求1 5中任一項所述的經過修飾的啟動子、或通過權利要求6 10 中任一項所述的方法而制備的經過修飾的啟動子，其中，所述經過修飾的啟動子中的一個或多個堿基被進一步取代、缺失、添加或插入。
12.—種表達載體，其包含權利要求1 5和11中任一項所述的經過修飾的啟動子、或通過權利要求6 10中任一項所述的方法而制備的經過修飾的啟動子。
13.根據權利要求12所述的表達載體，其中，所述經過修飾的啟動子被可操作性地連接到編碼目標基因產物的基因的上游。
14.一種轉化體，其包含權利要求1 5和11中任一項所述的經過修飾的啟動子或通過權利要求6 10中任一項所述的方法而制備的經過修飾的啟動子，其中，所述經過修飾的啟動子被可操作性地連接到編碼目標基因產物的基因的上游。
15.一種用于制備目標基因產物的方法，所述方法包括采用權利要求14所述的轉化體。
全文摘要
本發明提供經過修飾的啟動子、各自含有該啟動子的表達載體和轉化體、以及使用該轉化體制備目標基因產物的方法。本發明提供一種經過修飾的啟動子，其包含來源于屬于芽孢桿菌屬細菌的啟動子的核苷酸序列，其中至少一個選自如下的核苷酸序列被修飾SEQ IDNO1所表示的核苷酸序列；與SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列相當的核苷酸序列，只是其中一個或多個堿基被取代、缺失、添加或插入；以及相對于SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
文檔編號C12N15/113GK102575253SQ20108004656
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月18日 優先權日2009年10月21日
發明者兒玉裕司, 川原彰人, 荒勝俊 申請人:花王株式會社