專利名稱：：鄰菲羅啉衍生物的新用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種鄰菲羅啉衍生物的新用途。
背景技術：
：眾所周知，DNA是儲存和傳遞遺傳信息的載體，基因組中許多具有重要生物學功能的區域均富含鳥嘌呤核苷酸(G)，如端粒、免疫球蛋白重鏈開關區以及一些重要基因的啟動子區域。自1978年發現染色體末端的DNA重復序列以來，端粒DNA的分子結構及其功能的研究日益受到廣泛的關注。由于與腫瘤細胞的永生性密切相關，使得端粒和端粒酶的研究成為目前抗月中瘤研究的熱點問題(ShawnE.H.，etal.，Journalofcellularphysiology1999，180:10)。端粒長度對于細胞的生長、衰老和凋亡控制非常重要，每經過一次復制周期，端粒的長度都會縮短一些，每次大概丟失50200個核苷酸，經過2040代重復后，端粒長度達到極限，最后細胞正常凋亡。在多數的惡性腫瘤細胞(85%以上)中，端粒酶的活性被激活，而端粒酶的主要功能是催化端粒末端重度序列的延伸，可以用以補償正常端粒DNA的縮短，由此使得端粒無法達到臨界凋亡長度，從而細胞不能進入老化和衰亡，成為一種"永生性"細胞(SteenelB.V.，etal.，Naturel997，38:740)。G-四鏈體是一種特殊的DNA二級結構，是通過Hoogsteen和Watson-Crick氫鍵在一個共面環狀陣列上結合在一起的一系列堆積的鳥嘌呤四分體(見圖1)。G-四鏈體在端粒末端形成，可以抑制端粒酶延長端粒末端的作用，使得端粒能夠隨著復制的進行而縮短，從而破壞腫瘤細胞的永生性，促進腫瘤細胞死亡。以G-四鏈體為靶點，以達到抑制惡性腫瘤端粒酶活性的目的有望成為最有效的治療腫瘤的理想途徑。DNAG-四鏈體結構具有多樣性，其根據鏈條的取向可以分為平行和反平行結構。其也可以由一條單鏈形成分子內結構，也可能是兩條或多條鏈形成分子間結構(WenhuD.，etal.，MolecularCancerTherapeutics2001:1103)。目前，G-四鏈體已經成為一個世界公認的抗腫瘤藥物的設計靶點。現已經發展了一系列分子可以穩定這種特殊的G-四鏈體結構，從而達到通過抑制端粒酶活性達到抑制月中瘤細胞的目的(WheelhouseR.T.，etal.，J.Am.Chem.Soc.1998，120:3261;MoorhouseA.D.，etal.，J.Am.Chem.Soc.2006，128:15972;GavathiotisE.，etal.，J.Mol.Biol.2003，334:25;KernJ.T.，Biochemistry2002，41:12568;DavisJ.T.，Angew.Chen.Int.Ed.2004,43:668.)。由上可以看出，化合物對G-四鏈體的高選擇性識別和穩定能力是非常重要的。只有高效的區分開正常的雙鏈DNA和G-四鏈體結構，才有可能最大限度的降低化合物對正常細胞的毒性。至今為止的報道中，與G-四鏈體選擇能力最強的是一種含有金屬Mn的卟啉衍生物，其與G-四鏈體和雙鏈DNA的結合常數之比為104(DixonI.M.，etal.，J.Am.Chem.Soc.2007，129:1502)。目前，以G_四鏈體的結構為基礎，設計合成高選擇性識別的G_四鏈體配體已經成為該領域的熱點。鄰菲羅啉類化合物由于其具有良好的配位特性，又是重要的有機合成反應中間體，因而在許多領域都有得到了廣泛的應用。據報道，鄰菲羅啉具有殺菌和熒光性質，現已被廣泛應用于制備大分子生物探針、發光材料及抗菌等領域(SenthilK.R，etal.，Polyhedron2008,27:1111)。
發明內容本發明的目的是提供鄰菲羅啉衍生物的新用途。本發明提供的鄰菲羅啉衍生物的新用途為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(I);Me02CC02MeMe為甲基，i-Bu為異丁基。所述真核生物為哺乳動物。所述腫瘤細胞為癌細胞，如肝癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、頭頸癌細胞、結腸癌細胞、視網膜癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞和直腸癌細胞等。本發明還提供了一種抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物，它的有效成分為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽。所述真核生物為哺乳動物。所述腫瘤細胞為癌細胞，如肝癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、頭頸癌細胞、結腸癌細胞、視網膜癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞和直腸癌細胞等。本發明提供的鄰菲羅啉衍生物的另一種新用途為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。所述腫瘤為癌，如肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、白血病、頭頸癌、結腸癌、視網膜癌、膀胱癌、肛門癌和直腸癌等。本發明還提供了一種預防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽。所述腫瘤為癌，如肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、白血病、頭頸癌、結腸癌、視網膜癌、膀胱癌、肛門癌和直腸癌等。PD分子可以高選擇性結合平行結果G-四鏈體結構DNA，對腫瘤細胞較高的毒性，可以抑制癌細胞增殖，有希望成為一種新型的高效、低毒抗腫瘤藥物。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。圖1為G-四鏈體DNA的結構示意圖。圖2為不同結構的DNA在PBS-K+緩沖液或PBS-Na+緩沖液中的結構示意圖；其中，2-A為Hu22在PBS-K+溶液中的結構示意圖；2_B為Hu22在PBS_Na+溶液中的結構示意圖；2-C為Hu24A在PBS-K+溶液中的結構示意圖。圖3為Hu22與PD分子混合后的熒光光譜(K+環境中)；其中，3-A為Hu22G-四鏈體對PD分子的熒光滴定光譜圖；3-B為F。/F對Hu22G-四鏈體濃度直線圖；3_C為PD與Hu22G-四鏈體結合常數測定圖。圖4為Hu22與PD分子混合后的熒光光譜(Na+環境中)；其中，4-A為Hu22G-四鏈體對PD分子的熒光滴定光譜圖；4-B為F。/F對Hu22G-四鏈體濃度直線圖；4_C為PD與Hu22G-四鏈體結合常數測定圖。圖5為Hu24與PD分子混合后的熒光光譜(K+環境中)；其中，5-A為Hu24G-四鏈體對PD分子的熒光滴定光譜圖；5-B為F。/F對Hu24G-四鏈體濃度直線圖；5_C為PD與Hu24G-四鏈體結合常數測定圖。圖6為Hu24A與PD分子混合后的熒光光譜(K+環境中)；其中，6_A為Hu24AG-四鏈體對PD分子的熒光滴定光譜圖；6-B為F。/F對Hu24AG_四鏈體濃度直線圖；6_C為PD與Hu24AG-四鏈體結合常數測定圖。圖7為雙鏈DNA與PD分子混合后的熒光光譜(K+環境中)；其中，7_A為雙鏈DNA對PD分子的熒光滴定光譜圖；7-B為F。/F對雙鏈DNA濃度直線圖；7_C為PD與雙鏈DNA結合常數測定圖。圖8為PD對平行結構G-四鏈體Hu22的CD穩定實驗(K+環境中)；其中，8_A:Hu22(對照);8-B:PD與Hu22的摩爾比為1;8_C:PD與Hu22的摩爾比為2。圖9為PD對反平行結構G-四鏈體Hu22的CD穩定實驗(Na+環境中)；其中，9-A:Hu22(對照);9-B:PD與Hu22的摩爾比為1;9;C:PD與Hu22的摩爾比為2。圖10為PD對混合結構G-四鏈體Hu4的CD穩定實驗(K+環境中)；其中，10_A:Hu24(對照);10-B:PD與Hu24的摩爾比為1;10-C:PD與Hu24的摩爾比為2。圖11為PD對混合結構G-四鏈體Hu24A的CD穩定實驗(K+環境中)；其中11_A:Hu24A(對照);11-B:PD與Hu24A的摩爾比為1;11-C:PD與Hu24A的摩爾比為2。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中的PD分子的制備方法(Hu，Z.，etal.，J.Org.Chem.2006，71:1131.)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(a)將lmmol8_氨基_4_異丁氧基_2_喹啉_2甲酸甲酯溶于25mL甲醇中，室溫下向其中加入1.lmmol丁炔二酸二甲酯。攪拌8小時后，過濾，得到黃色固體。熔點149-150°C;1！1NMR(CDC13):S11.16(s，1H)，7.83(d，J=8.4Hz，1H)，7.56(s，1H)，7.43(t，J=8.OHz，1H)，6.93(d，J=7.6Hz，1H)，5.57(s，1H)，4.08(s，3H)，4.04(d，J=6.3Hz，2H)，3.77(s，3H)，3.75(s，3H)，2.35—2.22(m，1H)，1.13(d，J=6.7Hz，6H);13CNMR(CDC13):S169.0，166.1，165.1，162.9，147.4，145.4，139.8，137.4，127.4，122.9，115.0，114.6，101.3，96.6，75.2，53.1，52.8，51.4，28.2，19.2;EI-MS:m/z416[M]+;elementanalysisforC21H24N207(%):C60.57，H5.81，N6.73;found:C60.66，H5.82，N6.67.(b)將lmmol(a)所得產物加入到已預熱到200°C的25mL二苯醚中后回流30分鐘。冷卻至室溫，加入50mL石油醚攪拌，過濾，所得淡黃色固體用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇=20/1)純化后用于下一步反應。熔點:182-183°C,HNMR(CDC13):S10.91(broad，1H)，8.25(d，J=9.lHz，lH)，7.93(d，J=9.lHz，1H)，7.63(s，1H)，7.15(s，lH)，4.11(s，3H)，4.09(s，3H)，4.05(d，J=6.5Hz，2H)，2.39-2.26(m，1H)，1.17(d，J=6.7Hz，6H);13CNMR(CDC13):S178.8，165.5，163.0，162.8，148.3，139.4，136.9，135.7，125.6，123.5，123.7，116.9，114.8，104.2，75.6，53.8，53.2，28.2，19.2;EI-MS:m/z384[M]+;elementanalysisforC20H20N206(%):C62.49，H5.24，N7.29;found:C62.12，H5.25，N7.15.(c)將lmmol(b)所得產物，6mmo1碳酸鉀以及3mmo1溴代異丁烷加入到30mLN，N-二甲基甲酰胺中，然后在8(TC反應10小時。過濾，減壓除去二甲基甲酰胺(DMF)后，加入二氯甲烷。水洗兩次后，將有機相用無水硫酸鈉干燥，旋去溶劑，將所得粘稠液體溶于少量甲醇后放入冰箱中，析出白色固體，過濾得0.36g。熔點179-181°C;1！1NMR(CDC13):S9.34(s，2H)，7.86(s，2H)，4.10(s，10H)，2.33(m，2H)，1.17(d，J=6.7Hz，12H);13C畫R(CDC13):S166.6，162.8，149.3，146.2，122.8，120.9，104.1，75.4，53.0，28.2，19.2;EI-MS:m/z440[M]+;elementanalysisforC24H28N2061/2H20(%):C64.78，H6.46，N6.30;found:C64.81，H6.58，N6.24。該白色固體即為化合物PD。以下實施例中所用試劑均為分析純，所用水為超純水，所用的DNA序列均購自于北京擎科生物技術有限公司。實施例1、式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物(PD)對癌細胞增殖能力的影響將化合物PA進行抑制腫瘤的細胞實驗(MTT法)，操作如下(1)將處于對數期生長的H印G-2肝癌細胞，用0.25%胰酶消化細胞，使其成為單細胞，用含10X胎牛血清的DMEM培養液制成濃度為1*108個/1的單細胞懸液，將細胞接種于96孔培養板中，每孔200ul(每孔2X104個細胞)。將96孔細胞培養板置于C02培養箱中，在37"，5%C02條件下，培養48h。(2)當孔內細胞長滿(90X滿時即可)，按實驗分組加入不同劑量的PD分子溶液(200u1/孔)，使PD分子的終濃度分別為5uM、10uM、30uM、50uM、100uM，每組設3個復孔。培養96h。(3)各個孔中加入20ul濃度為5g/L的MTT，繼續培養4h，使MTT還原為甲瓚(Formazan)。吸出全部上清液后，每孔入200ul的DMSO，震搖15min，使甲臜充分溶解后，運用酶聯免疫檢測儀測定490nm處的吸光度(OD值)。按下式進行計算，結果列于表1。(對照組OD值-實驗組OD值)1Q()細胞抑制率％=對照組OD值X表1PD分子對肝癌細胞株的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>所以，PD分子對肝癌細胞株H印G-2的IC5。(藥物的半數抑制濃度)為25yM。結果表明PD分子對癌細胞具有很好的抑制效果，抑制率隨劑量的遞增而提高，IC5。值為25i！M。綜合考慮到PD分子的高選擇性和對腫瘤細胞較高的毒性，我們相信PD分子非常有希望成為一種新型的高效、低毒抗腫瘤藥物。實施例2、式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物(PD)抑制癌細胞增殖的機理G-四鏈體DNA的制備將Hu22溶解于17.20mMPBS-K+緩沖液(K2HP04/KH2P04)中，4。C冰箱保存。將Hu22溶解于17.20mMPBS_Na+緩沖液(Na2HP04/NaH2P04)中，4。C冰箱保存。將Hu24溶解于17.20mMPBS-K+緩沖液(K2HP04/KH2P04)中，4。C冰箱保存。將Hu24A溶解于17.20mMPBS-K+緩沖液(K2HP04/KH2P04)中，4"C冰箱保存。Hu22(序列表的序列1):5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3';Hu24(序列表的序列2):5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3';Hu24A(序列表的序列3):5'-TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA-3'。雙鏈DNA(24bp)的制備將兩條完全互補的d[(TTAGGG)4]和d[(AATCCC)4]按照摩爾比l:l，溶解于17.20mMPBS-K+緩沖液(K2HP04/KH2P04)中。混合均勻后，加熱至85°C，保持15分鐘后，逐步冷卻至室溫。使用前，4t:下靜置24小時。圖2為不同結構的DNA在PBS-K+緩沖液或PBS_Na+緩沖液中的結構示意圖。圖2中，A為Hu22在PBS-K+溶液中的結構示意圖；B為Hu22在PBS_Na+溶液中的結構示意圖；C為Hu24A在PBS-K+溶液中的結構示意圖。Hu22在PBS-K+溶液中為平行四鏈體結構。Hu22在PBS_Na+溶液中為反平行四鏈體結構。Hu24A在PBS-K+溶液中為混合四鏈體結構。—、PD分子與G-四鏈體的結合能力鄰菲羅啉類衍生物均具有很強的熒光，加入DNA后發生熒光猝滅現象。利用熒光猝滅滴定實驗可以計算出PD分子與不同結構G-四鏈體之間的結合常數(Bi，S.，etal.，JournalofMolecularstructure.2004,703:37)。檢測PD分子(Hu，Z.，etal.，J.Org.Chem.2006,71:1131.)與不同結構DNA(Hu22、Hu24、Hu24A、雙鏈DNA)的結合能力，試驗中的參數如下儀器型號HitachiF-4500;激發波長330nm;狹峰寬度5nm;PD分子濃度為3iiM。進行三次重復試驗，結果取平均值。結合常數(ka)測定原理如下將PD分子加入到DNA的溶液中，該體系主要存在下列平衡P+W"^^尸—Z)(1)上式中，n為兩者的結合比，P為溶液中游離的PD分子，P-D為結合態的PD分子，ka為結合常數。貝U，結合常數ka可以通過下式進行計算=ka[P][D]n(2)令未加入G-四鏈體時溶液中PD的濃度為[P]。，則上式可以寫為[p](3)在靜態猝滅中，熒光體系的熒光強度F與其游離的濃度成正比，即丄=豆(4)將(4)式代入(3)中，可得作圖，可以求得PD與DNA之間的結合常數kaHu22與PD分子混合后(PBS-K+溶液)的熒光光譜見圖3。Hu22與PD分子混合后(PBS-Na+溶液)的熒光光譜見圖4。Hu24與PD分子混合后(PBS-K+溶液)的熒光光譜見圖5。Hu24A與PD分子混合后(PBS-K+溶液)的熒光光譜見圖6。雙鏈DNA與PD分子混合后(PBS-K+溶液)的熒光光譜見圖7。PD分子與不同結構DNA的結合常數結果見表2。結果表明，PD可以選擇性識別平行結構的G-四鏈體，并增加其穩定性。PD與平行G-四鏈體的結合常數和PD與雙鏈結合常數之比高達105，是目前最強的G-四鏈體選擇劑。機理分析如下分子的結構決定了分子的性質。對于鄰菲羅啉類化合物，因其均具有較好的平面性結構，所以很容易嵌插入DNA的堿基層之間。在PD分子結構中的取代基，例如4，7位上的異丁基，因均具有較大的結構位阻，所以使得PD分子無法嵌插進入雙鏈DNA的堿基層之間，使得其與雙鏈的結合能力減弱。PD分子與G-四鏈體采取端部堆積的方式進行結合，取代基的存在不會影響其結合能力的大小。而恰是由于該種結合模式，相對于平行結構G-四鏈體端部較小的loop結構，反平行結構中較大的loop結構阻礙了PD與其結合，由此使得PD分子可以高效的選擇性識別平行結構的G-四鏈體結構。二、PD分子與G-四鏈體結合后G-四鏈體的熱穩定性。目前，CD光譜已被廣泛的用于研究G-四鏈體的熱力學行為。可以通過檢測G-四鏈體特征CD吸收峰的摩爾橢圓率的變化來判斷G-四鏈體結構變化，如平行結構G-四鏈體檢測262nm，反平行結構G_四鏈體檢測295nm。溫度的升高可使得DNAG_四鏈體結構發生變化，且變化是在很窄的溫度范圍內發生，導致CD摩爾橢圓率降低，以溫度對CD吸收峰的摩爾橢圓率的變化作圖，摩爾橢圓率達到一半時的溫度就成為G-四鏈體的熔點，以L表示(Rachwal，P.A.，etal.'Methods.2007，43:291;Fu，B.，etal.，Chem.Commun.2007:3264)。分別檢測不同G-四鏈體(Hu22、Hu24、Hu24A)與PD分子結合后的熔點變化。試驗采用的參數如下儀器型號Jasco-815;掃描范圍200-400nm;溫度范圍20-90。C，升溫速率2°C/min。G-四鏈體濃度為3yM。進行三次重復試驗，結果取平均值。圖8為Hu22與PD分子混合后的CD譜(K+環境中)。圖9為Hu22與PD分子混合后的CD譜(Na+環境中)。圖10為Hu24與PD分子混合后的CD譜(K+環境中)。圖11為Hu24A與PD分子混合后的CD譜(K+環境中)。PD分子與不同G-四鏈體結合后的熔點變化(ATm)見表2。表2PD分子與不同結構DNA的結合常數和穩定性實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明，PD分子與G-四鏈體結合后，可以使G-四鏈體的熔點顯著增加。序列表〈110〉中國科學院化學研究所<120>鄰菲羅啉衍生物的新用途〈130〉CGGNARY81773〈160>3〈210〉1〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1agggttegggttEigggtteggg〈210>2〈211>24〈212>DNA[o川]〈213〉人工序列〈400>2ttagggttagggttagggttaggg〈210>3〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3ttgggttagggttagggttaggga權利要求式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用；式(I)；Me為甲基，i-Bu為異丁基。F2008102253184C0000011.tif2.—種抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物，它的有效成分為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽。3.如權利要求1所述的應用，如權利要求2所述的藥物，其特征在于所述真核生物為哺乳動物。4.如權利要求1至3中任一所述的應用和藥物，其特征在于所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞為肝癌細胞。5.式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述腫瘤為癌。7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述癌為肝癌。8.—種預防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽。9.如權利要求8所述的藥物，其特征在于所述腫瘤為癌。10.如權利要求9所述的藥物，其特征在于所述癌為肝癌。全文摘要本發明公開了鄰菲羅啉衍生物的新用途。本發明提供了式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用；式(I)所示的鄰菲羅啉衍生物或其藥物學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。式(I)所示的化合物中，Me為甲基，i-Bu為異丁基。PD分子可以高選擇性結合平行G-四鏈體結構DNA，對腫瘤細胞較高的毒性，可以抑制癌細胞增殖，有希望成為一種新型的高效、低毒抗腫瘤藥物。本發明具有深遠的社會意義和經濟意義。式(I)。文檔編號A61K31/4375GK101721411SQ200810225318公開日2010年6月9日申請日期2008年10月29日優先權日2008年10月29日發明者向俊鋒,唐亞林,張虹,胡海宇,陳傳峰,鮑紅娟申請人:中國科學院化學研究所