用于轉染原生質體的改進技術的制作方法

專利名稱：用于轉染原生質體的改進技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于向植物細胞原生質體中引入感興趣的外來分子的方法。本發明還涉及轉染的植物細胞原生質體和用于實施所述方法的試劑盒。
背景技術：
遺傳改造是刻意創造活細胞遺傳物質變化的方法，所述方法目的在于改造那種細胞或者由細胞構成其一部分的器官或由細胞再生的器官的一種或多種遺傳編碼的生物學屬性。這些變化可以采取刪除部分遺傳物質、加入外源性遺傳物質或者像遺傳物質中現有 核苷酸序列的替換的變化的形式。用于真核生物遺傳改造的方法為人們所知已超過20年，并且已發現其廣泛應用于植物和動物細胞和微生物以改善農業、人類健康、食品質量和環境保護領域。遺傳改造的常見方法由向細胞基因組中加入外源性DNA片段組成，然后這將賦予那種細胞或其有機體除了通過已經現有的基因編碼的屬性以外的新的屬性(包括其中現有基因的表達將因此被抑制的應用)。盡管很多這樣的實例可以有效地獲得所需的屬性，但是這些方法不是非常準確，因為無法控制外源性DNA片段插入其中的基因組位置(并因此無法控制最終的表達水平)，并且因為所需的效果將其自身體現在由原始的且均衡的基因組編碼的自然屬性之上。遇到的一個常見問題是，由于外源性DNA片段在宿主基因組DNA中的隨機整合，必要或有利的基因被失活或修飾，造成宿主所需特征的不必要的損失。相反，將導致預定義的基因組基因座中核苷酸的加入、刪除或轉化的遺傳改造的方法將允許現有基因的精確改造。隨著過去十年里基因組學的出現，現在有可能迅速且成本有效地地破譯動物、植物和細菌的基因組。這已經導致大量的能夠與如動物的疾病易感性或植物的產量特征的表型有關的基因和調節序列。這將允許迅速建立序列的假定功能，但是一個基因對一種觀察到的表型負責的最終證明必須通過創建顯示預期的改變的表型的突變系來獲得。不同于動物細胞，植物細胞由多糖和蛋白質的混合物組成的厚厚的細胞壁包圍，而動物細胞可以輕易地服從外來分子的引入，植物細胞更加頑固并且需要稍微更加侵略性的方法。為了向植物細胞中引入外來分子的現有技術程序可以分為2種類別。第一類重組了采用通過刺穿植物細胞壁向植物細胞中機械引入感興趣的分子的所有方法。這能夠通過生物彈道遞送(biolistics delivery)來完成,其中將感興趣的分子包被在金屬珠(金或鎢)上，使用氣體加壓裝置將其推進到細胞中。然而，這種方法的效率相當低并且因為不是所有的細胞都被轉化，選擇是必須的，其限制了目標的數目。另一種方法使用了連接到一個微型操縱器上的微-或納-針將化合物穿過細胞壁直接注射到植物細胞中。然而，微注射需要特殊設備和大量技巧。該方法同樣是單調的和費時的并且相較于生物彈道遞送幾乎沒有提供優勢。但另一種方法使用了碳納米管，其含有感興趣的分子并且其末端包被有細胞壁消化酶。據說，納米管將局部地降解細胞壁并刺穿質膜允許其內容物遞送進入宿主細胞。雖然與微注射或生物彈道轟擊(biolistics bombardment)相比侵略性較低，上述限制也適用于此。第二類重組了其中在引入感興趣的分子之前用酶將整個植物細胞壁移除的所有方法。細胞壁的完全移除破壞了細胞之間的聯系，產生了個體化細胞的均勻混懸物，其允許更均勻和更大規模的轉染實驗。這包括，但不僅限于，原生質體融合、電穿孔、脂質體介導的轉染和聚乙二醇介導的轉染。因此，原生質體的制備是一種產生數百萬細胞的非常可靠和廉價的方法，并且由于其靈活性、效率和產量，通常比其它方法優選。幾乎能夠從每一種植物組織中分離原生質體。原生質體的主要來源是葉肉組織，其每克鮮重產生大量的原生質體。其它組織類型的使用主要取決于現有程序對于所考慮的系統和實驗最終目標的可用性。許多生物學過程，若非全部，是空間上和時間上調節的。一個細胞都有其自己的生物鐘，細胞周期是其最明顯的表現。每一個細胞將經歷一系列發展階段如生長(G0、G2)、
DNA復制(S)、分裂(M)和靜止(G0)。因此，當設計意圖與特異性通路相互作用的實驗時，其與處理所考慮的系統狀態有關。感興趣的分子的引入必須要仔細地定時以便匹配研究的方法。感興趣的分子或者必須在很長一段時間里在細胞環境中保持穩定直至它可以執行其活性或者必須在所研究的方法開始之前不久被遞送。例如，在通過向細胞中引入標記的微管蛋白早前期帶(pre-prophase band)形成期間的微管動力學研究中，必須確定的一點是微管蛋白在早前期帶的形成之前不久被遞送，除非標記的微管蛋白足夠穩定以抵擋酶降解直至早前期帶形成開始。對于特定的實例，另一個考慮是向結構中而非早前期帶中并入熒光微管蛋白，并因此需要在所需的時間遞送探針。不幸的是，除了細胞混懸培養物的極少數情況以外，原生質體能夠從中衍生出來的葉肉細胞處于靜止狀態(GO)，并且只有當采用一個適當的激素平衡觸發原生質體時，它們將重新進入細胞周期并積極地開始流動。一個靜止原生質體經過一輪細胞周期所需的時間在系統之間有很大不同，并且能夠從幾個小時到幾天。此外，一旦用于生成原生質體的酶混合物被清洗掉，原生質體就開始再形成其細胞壁，如果不采取預防措施來減緩或阻止細胞壁再形成，這將降低甚至完全阻止外來分子的引入。因此，當要遞送感興趣的分子時原生質體不能置之不理直至它們達到適當的階段，必須積極地預防細胞壁的再形成同時應該保留原生質體的流動能力。

發明內容
本發明已經著手克服本領域的這些缺點并且已經發明一種方法，在所述方法中能夠更加有效地并且以更加可控的方式控制和轉染原生質體和細胞周期。本發明人目前已經發現，兩個轉染步驟的組合允許原生質體中幾個生物學過程的詳細控制。兩個轉染步驟的組合可以與細胞壁抑制劑的使用，和/或細胞時相(phase)同步步驟組合。發明人已經發現，在第一轉染步驟中與某些通路相互作用和/或導致雙鏈DNA斷裂并且在第二轉染步驟中采用外來分子進行轉染的各種組合物的引入允許轉染過程改進的效率和控制。本發明人進一步發現，通過向原生質體中加入一種或多種非酶化學化合物，所述化學化合物干擾細胞壁的形成如通過抑制纖維素合成酶、纖維素沉積或捕捉新興的纖維素微纖絲，通過外來分子的遞送在時間上更加接近細胞周期中所需時相的可能性，外來分子引入的時機和效率能夠被增強和優化。本發明人還發現，通過在特定的細胞時相同步細胞，可以實現增加的轉染。從更廣泛的方面講，錯配修復系統和/或NHEJ通路和/或DNA雙鏈斷裂的引入的(瞬時)抑制以及(ii)采用感興趣的外來分子如致突變的寡核苷酸的原生質體的轉染，任選地與原生質體系統中細胞壁再形成的瞬時抑制和/或細胞周期時相的同步結合是非常有價值的，當細胞系統必須在細胞周期的特殊階段被轉染時，當細胞在特定生物/生化過程中變得熟練時，所述過程在時間上遠離原生質體分離的時間點。此外，原生質體系統中細胞壁再形成的瞬時抑制允許瞬時表達的質粒的順序引入，其組合作用導致所需的結果。例如，如果某時引入ZFN構建體，例如，在引入供體構建體之前的4、6、12、18或24小時，基因靶向是更有效的。這允許ZFNs被表達并且誘導對于適當的基因靶向事件所必需的DSBs的發生。發明詳述在第一個方面中，本發明涉及用于向植物細胞原生質體中引入一種或多種感興趣 的分子的方法，所述方法包含下列步驟-通過酶降解和/或從植物細胞中移除細胞壁來提供植物細胞原生質體；-進行植物細胞原生質體的第一轉染，所述轉染采用i.能夠改變選自錯配修復系統、非同源性末端連接(non-homologous endjoining)的一種或多種通路的調節的第一組合物；和/或ii能夠誘導DNA雙鏈斷裂的第二組合物-采用一種或多種感興趣的分子進行植物細胞原生質體的第二轉染；-允許細胞壁形成；其中第二轉染在第一轉染之后進行。本領域技術人員將會理解的是，術語“和/或”在本發明的范圍中意味著可以進行采用第一組合物的轉染、或者采用第二組合物的轉染、或者采用二者的轉染。所以根據本發明的第一轉染，及其實施方案可以包含第一組合物或第二組合物或二者。在方法的第一步中，從植物細胞中提供原生質體。使用用于產生植物細胞原生質體的常用程序(例如，使用軟化霉素)能夠提供原生質體。迄今為止，植物細胞原生質體系統已被描述用于番爺(番爺(Solanum Lycopersicon))、煙草(煙草(Nicotianatabaccum))和許多其他(油菜(Brassica napus)、胡蘿卜(Daucus carota)、生菜(Lactucca sativa)、玉米(Zea mays)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)、矮牽牛(Petunia hybrida)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、亞洲水稻(Oryza sativa))。本發明通常適用于任何原生質體系統，包括但不限于文中所列的那些。原生質體可以源自(不活躍分裂的)葉肉細胞、從(活躍分裂的)分生組織培養物中和從(活躍分裂的)細胞混懸物。采用能夠改變一種或多種通路的調節的第一組合物能夠轉染原生質體，所述通路選自錯配修復系統、非同源性末端連接通路。優選地，轉染是瞬時的。優選地，錯配修復系統、非同源性末端連接通路是下調的。優選地，通過能夠調節這些通路的dsRNAs來完成通路的調節。用于適當組合物的選擇和設計的實例和指導在下文中提供。在一個實施方案中，第一組合物能夠改變MutS、MutL, MutH, MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLHl、MLH2、MLH3、PMSl、DNA-PK 復合物 Ku70、Ku80、Ku86、Mrell、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbsl 中一種或多種的調節。錯配修復系統許多損傷通過所謂的錯配修復系統(MMR)得到修復。在大腸桿菌中，MMR由3種主要復合物組成，MutS、MutL和MutH。MutS參與錯配的識別和向第二復合物MutL (其募集MutH)發送信號。MutH具有切口(nick)活性，所述切口活性將在包含錯配的新合成的DNA鏈中引入切口。在新合成的鏈中的切口的存在給外切核酸酶發送信號，待降解的DNA延伸片段，包括錯配核苷酸。然后DNA聚合物將填充子鏈中的缺口。除了其功能通過MutL實現的MutH以外，在所有真核細胞中能夠發現大腸桿菌MMR基因的直系同源(為了回顧，參見Ko I ο dner&Mar s i shky 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9 :89-96)。在植物中，存在有四種 MutS直系同源(MSH2、MSH3、MSH6 和 MSH7)和四種 MutL 直系同源(MLH1、MLH2、MLH3 和 PMSI)。由MutS a (MSH2: :MSH6異二聚體)完成堿基_堿基錯配對或單一超螺旋核苷酸的錯配識另O，然而由MutSP (MSH2::MSH3異二聚體)識別更大的超螺旋環出。MSH7基因已經在植物
中得到鑒定，但是迄今為止未在動物中得到鑒定。MSH7與MSH6最相似并且同樣與MSH2形成異二聚體(MutS Y ) (Culligan&Hays,2000, Plant Cell :991-1002)。MMR 通路在圖 I中闡明，來自于 Li，2008Cell Research 18:85-98。目前，已經提出用于植物原生質體中特異性mRNA的瞬時抑制的方法(An等人2003Biosci. Biotechnol. Biochem. . 67 =2674-2677)并且現在已經發現，對于植物中(內源性)MMR基因的瞬時抑制而言，這是一種有價值的工具。可用于用來改變通路(比如dsRNA的產生)的調節的組合物的來自于與MMR通路有關的基因的序列(如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3和PMS1)從公共數據庫中可得到，如對于AtMSH2GenBank登錄號AF002706. I以及文中其它部分所描述的。通過設計基于例如可得到的擬南芥序列并隨后鑒定所需的直系同源的引物能夠鑒定所需植物的特異性序列。毒性最強的損傷是DNA雙鏈斷裂(DSB) oDSB能夠來自于內源性或外源性基因毒性藥物的作用，如活性氧種類-尤其是羥自由基-電離輻射或化學品(包括用于治療癌癥的化療藥物)。細胞過程如其它DNA損傷類型的修復，或DNA復制也引起DSB。例如，通過核苷酸-或堿基-切補修復的DNA修復涉及內切核酸酶，其引入單鏈切口。兩條DNA鏈上單鏈切口或缺口的同時出現導致DSB的形成。在一個類似的方式中，復制叉上游的單鏈切口或缺口能夠通過DNA雙螺旋的解旋加工成DSB (Bleuyard等人，2006，DNA repair 5 :1-12)。存在兩個競爭性通路(圖2，來自于Branzei和Foiani，2008-8 (9) =1038-46)來修復DSBs，即非同源性末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)。優選通過在Gl時相過程中的非同源性末端連接(NHEJ)修復雙鏈斷裂(DSBs)并且通過在細胞周期的S和G2時相過程中的同源重組(HR)修復雙鏈斷裂(DSBs)。將Ku異二聚體結合到DSBs上觸發了 DNA-PK催化亞基的募集和通過NHEJ的DSBs的封閉。相比之下，在S和G2時相過程中發生的DSBs優選通過MRE111-RAD50-NBS1復合物激活ATM。特異于細胞周期S和G2時相的較高周期素依賴性激酶(CDK)活性促進DSB切除，暴露出的單鏈DNA(ssDNA)的3'突出。當ssDNA的3'突出包被有復制蛋白A(RPA)時，它激活ATR ;在介導蛋白如RAD52的幫助下RPA能夠被RAD51移除并替換。這導致RAD51突觸前絲的形成，其通過入侵雙鏈體中同源區域以形成稱作D環的DNA連接(joint)來引發HR,所述D環能夠通過DNA合成進一步延伸。通過DNA解旋酶的這種中間體的鏈置換將反應引向合成依賴性鏈退火(SDSA)。或者，第二 DSB末端能夠被捕獲，引起雙Holliday交叉中間體，其能夠通過內切核酸酶來解決或者通過解旋酶(BLM)和拓撲異構酶(T0P3)的聯合作用來溶解。非同源性末端連接通路NHEJ是DSB修復的主要通路，并且涉及重新結合平末端或具有短突出的末端，并且以斷裂末端的識別和并置(juxtaposition)作為開始。這是通過由KU異二聚體(Ku70和Ku80 [或Ku86])和DNA-PK催化亞基(DNA-PKcs)組成的DNA-PK復合物促進的。DSB末端的成熟由Artemis實現的(圖3,來自于Goodarzi等人,2006)并由Xrcc4/DNA連接酶IV復合物重新封閉。NHEJ是一個相對不精確的過程并且經常伴隨著DNA序列的插入和刪除(Bleuyard等人，2006，Goodarzi 等人，2006The EMBOjournal 25 :3880-3889)。幾個基因已知在NHEJ中發揮作用，所述基因包括KU70、KU80和PARP-I。 可用于用來改變通路(比如dsRNA的產生)的調節的組合物的來自于與NHEJ通路有關的基因的序列從公共數據庫中可得到，如對于AtKU70的GenBank登錄號AF283759. I以及文中其它部分所描述的。通過設計基于例如可得到的擬南芥序列并隨后鑒定所需的直系同源的引物能夠鑒定所需植物的特異性序列。同源重纟目誦路HR是一種準確的修復過程，其使用姐妹染色單體作為模板并因此保證了修復的保真度。通向HR修復的第一步是DSBs的切除以形成單鏈3'突出。通過由Mrell、Rad50和Nbsl蛋白質組成的MRN復合物來實現末端加工。在輔助蛋白質的幫助下，Rad51在單鏈末端上被募集并且促進了同源雙鏈體的入侵(圖4，來自于Sugiyama等人，2006The EMBOjournal,1-10)。然后通過DNA合成和捕獲的第二 DSB末端來延伸捕獲的鏈，導致由內切核酸酶來消除的雙-Holliday的形成，導致可通過解旋酶和拓撲異構酶的組合作用來消除的交叉的形成(Bleuyard 等人，2006 ；Branzei 和 Foiani，2008)。在一個實施方案中，可以采用能夠誘導雙鏈DNA斷裂的第二組合物進行第一轉染。實例是鋅指核酸酶和大范圍核酸酶(Cellectis，法國)，和TAL效應子核酸酶(Bosch等人(2009) Science 326 :1509-1512 ;Moscou 等人(2009) Science Vol326 :1501)。使用已知的技術將鋅指核酸酶如此設計以便它們優選在所需的位置誘導雙鏈斷裂，其中第二轉染在與靶向突變有關的某些實施方案中旨在從致突變的寡核苷酸中引入突變。鋅指核酸酶是通常設計成用于切斷特定DNA序列的蛋白質。鋅指結構域包括當通過鋅離子穩定時折疊成特征性結構的大約30個氨基酸。鋅指結構域通過插入到DNA螺旋的大溝中能夠結合到DNA上。每一個鋅指結構域通過鋅指α螺旋區域上的關鍵的氨基酸殘基能夠結合到具體的DNA三聯體(3bps)上。因此，通過改變這些關鍵的氨基酸，有可能改變鋅指對特定三聯體的識別特異性并從而創造鋅指構建體，專門針對感興趣的序列。系統的靈活性來自于鋅指結構域可以串聯到一起以結合到長的DNA序列上的事實。例如，串聯的6個鋅指結構域識別了特異的18bps序列，序列在復雜的真核細胞基因組中足夠長以至于是獨特的。鋅指核酸酶(ZFN)由一系列融合至核酸酶Fokl的鋅指組成。ZFN被引入到細胞中，并且將識別并結合到特異的基因組序列上。因為Fokl核酸酶以二聚體的形式切割，所以需要第二 ZFN，其在切割位點對面的DNA鏈上識別特異的序列。然后在兩條靶向DNA序列之間進行DNA切割或雙鏈斷裂(DSB) (Miller 等人，2007Nature Biotech 25(7) :778-785 ;Cathomen 和 Joung，2008Mol Therl6(7) :1200-1207 ;Foley 等人，2009PLoS ONE 4(2) :e4348)。在同源序列(其可以是姐妹染色單體或者是供體DNA構建體)存在的情況下，DSB能夠通過HR來修復。不是姐妹染色單體被用于修復，而是信息從引入細胞的供體構建體中被拷貝，借此這是基因靶向過程的基礎。供體構建體包含與原來染色體基因座相比的改變，因此HR的過程中將這些改變并入基因組。第一轉染可能包含同時地或相繼地(一個接著一個)采用第一和第二組合物二者的轉染。在根據本發明的方法中，進行第二轉染以引入一種或多種感興趣的分子。感興趣的分子能夠選自化學品、DNA、RNA、蛋白質、寡核苷酸和肽。在某些實施方案
中，感興趣的分子選自dsRNA、miRNA、siRNA、質粒、致突變的寡核苷酸，更優選致突變的寡核苷酸。在某些實施方案中，可以使用編碼ZFN構建體的質粒作為感興趣的分子。然后，第二轉染步驟引入ZFN構建體,其通過表達能夠誘導可用于足跡法(footprinting)的DSBs。在某些實施方案中，致突變的寡核苷酸能夠被用作感興趣的分子。一旦轉染到原生質體中，致突變的寡核苷酸能夠提供原生質體DNA的改變。優選地，針對致突變的寡核苷酸的靶DNA來自于核DNA。或者，能夠使用葉綠體或線粒體DNA。原則上，能夠使用迄今為止本領域中描述的任何致突變的寡核苷酸，如RNA/DNA嵌合寡核苷酸、包括那些含有LNAs、硫代磷酸酯/鹽、丙炔替代物等的寡核苷酸。因此，致突變寡核苷酸作為感興趣的分子的使用提供了寡核苷酸介導的靶向核苷酸交換(ODTNE)。寡核苷酸介導的靶向核苷酸交換(ODTNE)寡核苷酸介導的靶向核苷酸交換(ODTNE)是指通過引入突變(如單點突變或刪除/插入)利用單鏈寡核苷酸來改正或改變基因組基因座，從而恢復原有的基因功能。這個概念是基因治療和個性化用藥的基礎并且在全球得到廣泛研究(Parekh-Olmedo等人，2002，Neuron 33:495-498；Madsen 等人，2008PNAS 105 :10，3909-3914 ；Leclerc 等人，2009BMC Biotechnology 9 :35，1_16)。影響ODTNE的有效性和效率的幾個參數已被鑒定，然而一些仍然需要驗證，目前十分確定的是，功能MMR系統抵消了 0DTNE(Igoucheva等人，200801igonucIeotides 18 :111-122 ;Kennedy Maguire 和 Kmiec,2007Gene 386:107-114;Papaioannou等人，2009J. Gene Med. 11 :267-274)。在該技術中起作用的ODTNE的使用以及寡核苷酸的結構和設計得到很好地描述，尤其在W098/54330、W099/25853、W001/24615、W001/25460、W02007/084294,W02007073149, W02007073166,W02007073170, W02009002150中。基于文中所公開的致突變的寡核苷酸的結構特征和來自于靶序列(待改變的基因)的序列信息，本領域技術人員能夠設計出在第二轉染步驟中使用的所需的致突變的寡核苷酸。在本發明中使用的致突變的寡核苷酸具有與本領域中使用的其它致突變的寡核苷酸一致的長度，即典型地介于10-60個核苷酸之間，優選20-55個核苷酸，更優選25-50個核苷酸。使用致突變的寡核苷酸的本發明能夠用于例如改變細胞、通過恢復到野生型來改正突變、誘導突變、通過破壞編碼區使酶失活、通過改變編碼區來改造酶的生物活性、通過破壞編碼區來改造蛋白質、改造miRNA靶、改造前體基因和很多更多的目的。在某些實施方案中，感興趣的分子是DNA構建體。DNA構建體是含有期望要被引入到細胞中(基因靶向)的序列信息的DNA序列。DNA構建體可以是ZFN構建體。轉染(第一和第二轉染二者)能夠使用本領域中描述的方法如電穿孔、生物彈道技術、PEG-介導的轉染等來完成。優選PEG介導的轉染。使用當前水平的本領域方法可以實現常規的轉染如PEG-介導的轉染(優選的)或生物彈道技術(Sporlein等人(1991) Theor. Appl. Genet. 82,712-722 ;Mathur 和Koncz. Methods in Molecular Biology.Vol. 82 Arabidopsis protocols. J. Marinez-Zapater 和 J. Salinas 編輯 Humana PressInc. TotowaNJ. ;Golds 等人(1993) Bio/Technology 11,95-100)。基因靶向是一個非常強大的技術，其在醫藥和農業中有許多應用。它允許基因組的精確操縱，使生物學家能夠研究并開發基因功能。然而，HR在幾乎所有細胞類型中的效 率都是低的，因為它依賴于染色體基因座上DSB的存在。因此，ZFN的有用性是其在任何染色體基因座誘導DSB的能力，并且已被用于改善基因靶向效率100倍。一旦產生DSB，它可以通過NHEJ或者HR通路來修復。可以通過抑制NHEJ通路來增強HR的效率，并從而增強基因靶向的效率，從而DSB可以通過HR來修復。確實，這已被證明是在人類和真菌細胞的情況(Fattah 等人 2008Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :8703-8708 ;Meyer 等人 2007J.Biotechnologyl28 :770-775 ；Bertolini 等人，2009Mol. Biotechnol. 41 :106-114)。NHEJ和HR之間的選擇也可能依賴于細胞周期時相，在Gl中，由于同源模板的缺失，NHEJ占主導地位，而HR在G2/M中更加活躍，在G2/M中存在有同源姐妹染色單體(Branzei和Foiani，2008, Nature綜述了分子生物學)。植物育種中的ODTNE和ZFN植物育種通過常規雜交采用自然遺傳變異來改善植物性能。然而，自然的變異是有限的并且對于育種計劃而言需要很多年才能產生一個有價值的新品種。可以人工地和傳統地創造遺傳變異，這通過向宿主植物的基因組中引入許多突變的化學突變完成。少數突變將最終提供感興趣的表型并且能夠用于育種計劃。然而，這些方法具有缺點如需要許多回交以消除殘余的突變和由此類化學品引入的突變的有限的范圍。因此，如ODTNE和ZFN的技術代表了以定向且清晰的方式向植物中引入遺傳變異的有吸引力的解決方案。然而，將動物系統轉化為植物系統代表了相當大的挑戰，尤其是復制已知用于促進靶向基因改變的生理條件。功能MMR系統抵消了 ODTNE并且在使用siRNA敲除MSH2之后已經觀察到基因修復的大量增加。然而，這些方法使用穩定整合的siRNA構建體，并且因此MSH2從本質上被抑制，這是不利的，因為從長遠來看，所得的突變表型將會導致植物死亡。ODTNE也已被顯示在細胞周期S時相中的細胞積累中被促進。用于植物原生質體中特異性mRNA的瞬間抑制的方法已被描述(An等人2003Biosci. Biotechnol. Biochem. . 67 :2674-2677)并且已經發現對于植物中(內源性)MMR基因的瞬時抑制而言這可能是有價值的工具。使用化學品如羥基脲或艾菲地可寧很容易實現S時相中的細胞積累。發明人已經發現，這些各種參數與寡核苷酸遞送的協調可能掌控每個單獨參數的作用。為了實現這一目標，本發明提供了 MMR抑制，而細胞在細胞周期的S時相中積累，隨后是寡核苷酸的引入以推動感興趣的基因的改正。
在引入供體構建體之前，對于基因靶向采用相同的控制，在細胞周期的S/G2/M時相中增加的細胞比例是值得想望的，NHEJ被抑制、ZFN被表達且DSB被產生。在植物細胞中，外來分子在細胞中的引入并不像是在動物細胞中那么直接，因為存在有一個非常厚的細胞，為了感興趣的分子到達原生質體需要將其移除。這通過采用纖維素酶和果膠酶的細胞壁酶消化來完成，但是一旦酶混合物被清洗掉，細胞將開始再形成細胞壁。因此，如果想要長時間保留原生質體的轉換性，例如至少10、30、60分鐘，或1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，或以上；例如從10分鐘到24小時，關鍵在于避免細胞壁的再形成。方便地，存在有化學品，其影響細胞壁的合成并且能夠用于保持原生質體裸露直至采用各種感興趣的分子轉染。在本申請中，我們提供的證據表明，使用這樣的細胞壁抑制劑允許向植物原生質體中相繼引入外來分子，導致寡核苷酸介導的靶向基因改變和使用ZFN的基因靶向的效率改善。因此，在本發明的某些實施方案中，為了避免細胞壁的再形成，將非酶組合物加入到原生質體培養物中。通過破壞、阻止、降低和/或延遲細胞壁的再形成直至細胞達到細胞周期的適當階段；更多的外來分子可以被遞送至細胞中，并且能夠實現轉染效率的提高。非 酶組合物的移除，例如通過清洗或采用不含抑制細胞壁再形成的化合物的培養基替換培養基來允許細胞壁形成并使細胞繼續細胞周期。取決于所需轉染的具體情況，可以向植物細胞原生質體中加入非酶組合物。可以-在第一轉染之前或與其同時；-介于第一和第二轉染之間，-在第二轉染之前或與其同時，或-在第二轉染之后加入組合物。可以-在第一轉染之前或與其同時，-介于第一和第二轉染之間，-在第二轉染之前或與其同時，或-在第二轉染之后并且在允許細胞壁形成之前移除抑制或避免細胞壁形成的非酶組合物。以這種方式，考慮到所需的轉染，可以抑制細胞壁的再形成。例如，對于如圖5所示的在番茄ALS基因座的足跡形成而言，在第一轉染步驟之前加入組合物。在另一個實施例中(參見圖6和圖7)，(幾乎)與第一轉染同時加入組合物。同樣可能的是，允許在短暫的時間段(1-24小時)內再形成細胞壁，然后在第一轉染之前停止細胞壁的進一步形成。介于第一轉染和第二轉染之間的時間段能夠從至少10、30、60分鐘，或1、2、4、6、
8、10、12、16、24小時，至數天，例如至96小時，或者甚至更多來變化。典型地，時間段是從I小時到72小時，優選從2到48小時，更優選從4至42小時，甚至更優選介于12和36小時之間。通過向原生質體培養基中加入一種或多種化學(即非酶的)化合物來完成干擾細胞壁的(再)形成(通過抑制、破壞、延遲和/或降低)，例如，化學化合物抑制纖維素沉積或捕捉新生的纖維素微絲從而阻止其并入到有組織的細胞壁中(Parekh-Olmedo等人(2003)Ann. NY Acad. Sci. 1002,43-56 ；Anderson 等人(2002) J. Plant Physiol. 159,61-67 ；Meyer和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wall formation and cytokinesis,but notof nuclear division,in protoplasts of Nicotiana tabacum L. cultivated in vitro.Plant 142(3),253-262)。在本發明中使用化學化合物在本申請中是指“細胞壁形成抑制劑”。這些化學化合物能夠阻止、破壞、抑制和/或延遲纖維素細胞壁的形成，在文中表示“抑制細胞壁的形成”。只有在不存在細胞壁形成或者至少存在細胞壁形成降低的情況下，可以允許原生質體培養物經歷其正常的發展周期。由于原生質體已經經歷其發展周期并且已經到達這樣一種時相，在該時相時期望的是DNA的合成開始，細胞壁形成抑制劑基本上能夠從原生質
體培養物中移除，例如通過清洗或者通過培養基的替換。因此，從抑制劑被加入的時刻開始，采用細胞壁形成抑制劑處理原生質體禁止了細胞壁的形成，例如，至少12-60小時，或24-48小時。因此，在足夠的時間里抑制細胞壁的形成允許在細胞周期的某一時間使用常規轉染技術，當處于這一時間時細胞通常是不接受轉染的。典型地，抑制劑的使用不會影響細胞周期的進程。優選地，在考慮之中的化學品應該避免細胞壁的再形成而不顯著地干擾細胞周期的進程或者在所使用的濃度下對原生質體有害。在本文中，“不顯著地干擾”意味著化學品允許以至少50%、至少75%、優選85%、更優選95%的其正常速度(即在不存在化學品的情況下)繼續細胞周期的進程。在本文中，“有害”意味著至少50%、至少75%、優選85%、更優選95%的原生質體沒有受到化學品以不同于尤其是此處所描述的抑制細胞壁再形成的任何其它方式產生的影響。各種化學品干擾細胞壁的形成。那些化學品中有許多通常用作除草劑。例如，2,6-二氯苯臆(DCB) (DeBolt 等人(2007)Plant Physiology 145, 334-338 ;Anderson 等人(2002)J.Plant Physiol. 159，61-67)是一種眾所周知的除草劑，其通過抑制纖維素合成酶因此破壞細胞板的形成(Vaughn等人(1996)Protoplasma 194,117-132)。DCB已被證明抑制纖維素合成酶復合物的運動性而不影響其遞送到質膜(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)。此外,優選的細胞壁形成抑制劑不影響細胞周期的進程(Galbraith 和 Shields(1982)The effect ofinhibitors of cell wall synthesison tobacco protoplast development. Physiologia Plantarum 55(I), 25-30 ;Meyer 和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wall formation and cytokinesis, but notof nuclear division,in protoplasts of Nicotiana tabacum L. cultivated in vitro.Plant 142 (3)，253-262)，或者僅在有限程度內，因為細胞周期的進程對于本技術而言當然是重要的。DCB不限制細胞周期的進程，因此是優選的細胞壁形成抑制劑。其它的化學品包括除草劑異卩惡草胺(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)，其抑制質膜中纖維素合成酶復合物的整合并且破壞現有的那些。因此，在一個優選的實施方案中，纖維素合成抑制劑是一種纖維素合成酶抑制劑。在另一個實施方案中，化學品干擾了負責纖維素合成的基因，如CESA基因。卡爾科弗盧爾白(也稱為熒光增白齊Li)與纖維素微絲競爭以阻止其整合到配位網絡(coordinated network)中(Roncero和Duran (1985) Journal of Bacteriology 163 (3), 1180-1185, Haigler 等人(1980) Science210(4472) ,903-906)。其它的細胞壁形成抑制劑是例如纖維素生物合成酶抑制劑，如腈、苯甲酰胺和/或三唑羧基酰胺除草劑、微管裝配抑制劑如二硝基苯胺、氨基磷酸鹽/酯、吡啶、苯甲酰胺和/或苯基二甲酸除草劑和/或纖維素沉積抑制劑。在某些實施方案中，纖維素生物合成抑制劑選自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺(triazofenamide)、多沙唑啉A (phtoxazolin A)、多拉霉素(Phtoramycin)、沙司多素A(thaxtominA)、布雷菲德菌素A。在某些實施方案中,微管裝配抑制劑選自柯多素(cobtorin)、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)。在某些實施方案中，纖維素沉積抑制劑是二氯喹啉酸。在某些實施方案中，細胞壁形成抑制劑選自莫林(morlin) (7_乙氧基_4_甲
基色滿-2-酮)、異噁草胺(CAS 82558-50-7，N-[3-(I-乙基-I-甲基丙基)-I，
2-噁唑-5-基]-2，6- 二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944 (N2-(l-乙基-3-苯丙
基)-6-(1-氟-I-甲基乙基)-1,3,5, - 二嗪-2,4- 二胺)、二氯苯臆(二氯節臆)、卡爾科
弗盧爾和/或卡爾科弗盧爾白(4，4'-雙((4-苯胺基-6-雙(2-羥乙基)氨基-S-三
嗪-2-基)氨基)-，2，2'-芪二磺酸及其鹽)、安磺靈(CASRN-19044-88-3，4-( 二丙氨
基)-3，5- 二硝基苯磺酰胺)、5_叔丁基-氨基甲酰氧基-3- (3-三氟甲基)苯基-4-噻唑烷
酮、香豆素、3，4脫氫脯氨酸權利要求
1.用于向植物細胞原生質體中引入一種或多種感興趣的分子的方法，其包含如下步驟 -通過酶降解和/或從植物細胞中移除細胞壁來提供植物細胞原生質體； -進行植物細胞原生質體的第一轉染，所述轉染采用 i.能夠改變選自錯配修復系統、非同源性末端連接的一種或多種通路的調節的第一組合物；和/或 ii能夠誘導DNA雙鏈斷裂的第二組合物， -采用一種或多種感興趣的分子進行植物細胞原生質體的第二轉染； -允許細胞壁形成； 其中第二轉染在第一轉染之后進行。
2.根據權利要求I所述的方法，其中能夠誘導DNA雙鏈斷裂的第二組合物選自鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或TAL效應子核酸酶、編碼鋅指核酸酶的DNA構建體、編碼大范圍核酸酶的DNA構建體、編碼TAL效應子核酸酶的DNA構建體。
3.根據權利要求1-2所述的方法，其中第一組合物和第二組合物基本上同時提供給植物細胞原生質體。
4.根據權利要求1-2所述的方法，其中第一組合物在第二組合物之前加入。
5.根據權利要求1-2所述的方法，其中第二組合物在第一組合物之前加入。
6.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中調節的改變是一種或多種通路的下調，優選通路的瞬時下調。
7.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中所述方法進一步包含采用抑制或阻止細胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細胞原生質體 -在第一轉染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉染之間，或 -在第二轉染之前或與其同時；或 -在第二轉染之后， 并且所述方法進一步包含移除抑制或阻止細胞壁形成的非酶組合物的步驟 -在第一轉染之前或與其同時，或 -介于第一和第二轉染之間，或 -在第二轉染之前或與其同時，或 -在第二轉染之后， 并且在允許細胞壁形成之前。
8.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其進一步包含同步植物細胞或植物細胞原生質體的細胞周期時相的步驟。
9.根據權利要求8所述的方法，其中同步通過采用同步化劑接觸植物細胞或植物細胞原生質體來完成，優選 -在由植物細胞形成植物細胞原生質體之前或與其同時；或 -在第一轉染之前或與其同時；或 -在第二轉染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉染之間。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述方法進一步包含移除同步化劑的步驟-在由植物細胞形成植物細胞原生質體之前；或 -在第一轉染之前或與其同時；或 -在第二轉染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉染之間；或 -在第二轉染之后或與其同時。
11.根據權利要求8-10中任意項所述的方法，其中同步步驟與采用抑制或阻止細胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細胞原生質體的步驟獨立地(如在其之前、在其之后或與其同時)進行。
12.根據權利要求7所述的方法，其中抑制細胞壁形成的非酶組合物含有一種或多種細胞壁形成抑制劑，所述細胞壁形成抑制劑選自 a.纖維素生物合成抑制劑； b.微管裝配抑制劑； c.纖維素沉積抑制劑； d.其它細胞壁形成抑制劑。
13.根據權利要求12所述的方法，其中纖維素生物合成抑制劑選自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺、多沙唑啉A、多拉霉素、沙司多素A、布雷菲德菌素A。
14.根據權利要求12所述的方法，其中微管裝配抑制劑選自柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)。
15.根據權利要求12所述的方法，其中纖維素沉積抑制劑是二氯喹啉酸。
16.根據權利要求12所述的方法，其中其它細胞壁形成抑制劑選自莫林(7-乙氧基-4-甲基色滿-2-酮)、異噁草胺(CAS 82558-50-7, N-[3-(I-乙基-I-甲基丙基)-1，2-噁唑-5-基]-2，6- 二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944(N2-(l-乙基-3-苯丙基)-6-(1-氟-I-甲基乙基)-1，3, 5, - 二嗪-2，4- 二胺)、二氯苯臆(二氯節臆)、卡爾科弗盧爾和/或卡爾科弗盧爾白(4，4'-雙((4-苯胺基-6-雙(2-羥乙基)氨基-S-三嗪-2-基)氨基)-，2，2'-芪二磺酸及其鹽)、安磺靈(CASRN —19044-88-3，4-( 二丙氨基)-3，5- 二硝基苯磺酰胺)、5_叔丁基-氨基甲酰氧基-3-(3-三氟甲基)苯基-4-噻唑燒酮、香豆素、3，4脫氫脯氨酸、
17.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中第一組合物能夠改變MutS、MutL,MutH, MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLHl、MLH2、MLH3、PMSI、DNA-PK 復合物 Ku70、Ku80、Ku86、MrelI、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbsl、PARP-l 中一種或多種的調節。
18.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中第一組合物包含dsRNA。
19.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中第二轉染中的一種或多種分子選自化學品、0嫩、! 嫩、蛋白質、寡核苷酸、1111 ^、^1 ^、1^1 ^、肽、質粒、脂質體、致突變的寡核苷酸。
20.根據權利要求8-11所述的方法，其中細胞周期時相的同步在細胞周期的S時相、M時相、Gl和/或G2時相中同步原生質體。
21.根據權利要求8-11或20所述的方法，其中細胞周期時相的同步通過營養剝奪如磷酸鹽饑餓、硝酸鹽饑餓、離子饑餓、血清饑餓、蔗糖饑餓、植物生長素饑餓來完成。
22.根據權利要求9所述的方法，其中同步化劑選自艾菲地可寧、羥基脲、胸苷、秋水仙堿、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)、含羞草堿、茴香霉素、α鵝膏蕈堿、洛伐他汀、茉莉酸、脫落酸、甲萘醌、隱地蛋白、熱、過氧化氫、高錳酸鈉、吲哚美辛、環氧霉素、乳胞素、icrfl93、奧羅莫星、洛克韋汀、波荷明、星孢菌素、K252a、R田酸、草藻滅、咖啡因、MG132、周期素依賴性激酶和周期素依賴性激酶抑制劑中的一種或多種。
23.根據權利要求1-22中任意項所述的方法，其中介于第一轉染和第二轉染之間的時間段是至少10、30、60分鐘、1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，但優選96小時以下，優選所述時間段是從I小時至72小時，更優選從2至48小時，甚至更優選從4至42小時，仍然甚至更優選介于12和36小時之間。
24.根據上述權利要求中任意項所述的方法，其中介于第一轉染和第二轉染之間的時間段是至少10、30、60分鐘、1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，但優選96小時以下，優選所述周期是從I小時至72小時，更優選從2至48小時，甚至更優選從4至42小時，仍然甚至更優選介于12和36小時之間并且其中所述方法進一步包含采用抑制或阻止細胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細胞原生質體 -在第一轉染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉染之間，或 -在第二轉染之前或與其同時；或 -在第二轉染之后， 并且所述方法進一步包含移除抑制或阻止細胞壁形成的非酶組合物的步驟 -在第一轉染之前或與其同時，或 -介于第一和第二轉染之間，或 -在第二轉染之前或與其同時，或 -在第二轉染之后， 并且在允許細胞壁形成之前。
25.植物細胞原生質體，其采用如權利要求19所定義的外來分子轉染。
26.用于轉染植物細胞原生質體的試劑盒，其包含選自第一組合物、第二組合物、抑制或阻止細胞壁形成的非酶組合物、同步化劑中的兩種或多種以及感興趣的外來分子中的一種或多種。
全文摘要
本發明涉及用于向植物細胞原生質體中引入一種或多種感興趣的分子的方法，所述方法通過提供植物細胞原生質體，采用能夠改變選自錯配修復系統和非同源性末端連接的一種或多種通路的調節的組合物和/或能夠引入DSBs的組合物進行植物細胞原生質體的第一轉染，采用一種或多種感興趣的分子如致突變的寡核苷酸進行植物細胞原生質體的第二轉染和允許細胞壁形成來實現。
文檔編號C12N15/10GK102791865SQ201080057861
公開日2012年11月21日 申請日期2010年12月20日 優先權日2009年12月21日
發明者B·G·J·菲倫斯-翁斯滕克, F·呂西耶, P·本多克 申請人:凱津公司