專利名稱：產生葡萄糖氧化酶的霉菌的快速檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法和用于檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的試劑盒。
背景技術：
在多種行業中，例如奶制品、果汁、酒和啤酒行業，需要分析細菌和霉菌。當討論用于微生物分析的裝置時，本領域通常并不將霉菌分析與細菌分析區分開，但是本領域技術人員已知霉菌分析常常比細菌分析慢。用于檢測低濃度霉菌菌種的方法通常依賴于生長培養基，例如3M PETRIFILM 酵母菌和霉菌計數板或酸化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂。也使用用抗生素(例如，氯霉素)處理過的瓊脂。取決于生物體的生長速率，這些方法需要3至7天才能得出確定的答案。食品制造商尤其需要更快響應的測試，因為其他生長相關測試結果(例如總需氧(活)細菌計數)可在兩天內得出，并且要等待額外一天或更多天才能獲得酵母菌和霉菌測試結果，代價很大。熒光顯微鏡法或流式細胞術可提供更直接的測試結果，但是這些技術花費過高。霉菌菌種黑曲霉(Aspergillus niger)是常見的真菌食品污染物。雖然一般是非病原性的，但它確實會造成各種水果和蔬菜的黑腐病或黑穗病。黑曲霉也通常發現于室內環境，該菌落在室內環境中可被誤認為產毒葡萄穗霉屬霉菌。在葡萄栽培行業中，需要提高對黑曲霉和炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)的辨別能力。后者是葡萄中赭曲霉毒素A的主要來源，赭曲霉毒素A是腎毒性、致畸、致癌并且抑制免疫系統的霉菌毒素。黑曲霉和炭黑曲霉通過肉眼難以區別，并且主要由有經驗的真菌學家使用顯微鏡法基于形態學而區分。目前直接檢測赭曲霉毒素A的技術建立在液相色譜或免疫測定基礎上，但是這些方法也很昂貴并且需要專門技術。
已經探索了用于檢測產生赭曲霉毒素的真菌的其他技術。例如，美國專利No. 7, 560, 234 (Dobson等人)推定地描述了可用于檢測和/或鑒定產赭曲霉毒素真菌的聚合酶鏈式反應(PCR)分析技術。需要能夠以簡單、高性價比的方式快速檢測和辨別黑曲霉和炭黑曲霉以及相關菌種的方法。
發明內容
本發明包括簡單的制品和方法以檢測和/或鑒定產生葡萄糖氧化酶的微生物，包括曲霉屬霉菌的某些菌種。在一些實施例中，本發明的方法提供某些曲霉屬菌種的區分。除此以外或作為另外一種選擇，一些實施例提供產生葡萄糖氧化酶的微生物的計數。在一些實施例中，本發明的方法提供產生葡萄糖氧化酶的微生物的自動檢測和/或計數。在一個方面，本發明提供檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法。該方法可包括提供包含冷水可溶性膠凝劑的薄膜培養裝置、支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑以及懷疑含有微生物的樣品。該方法還可包括在所述培養裝置中將預定體積的樣品、培養基和過氧化氫指示劑合并。該方法還可包括溫育所述培養裝置，然后檢測生色底物的反應。在一些實施例中，在開始溫育所述培養裝置的48小時內，生色底物的反應是可檢測的。在一些實施例中，該培養裝置包含培養基。在另一方面，本發明提供檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法 。該方法可包括提供包含冷水可溶性膠凝劑的薄膜培養裝置、支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑以及懷疑含有微生物的樣品。該方法還可包括將預定體積的樣品和培養基合并形成第一混合物，然后在培養裝置中將第一混合物和過氧化氫指示劑合并。該方法還可包括溫育所述培養裝置，然后檢測生色底物的反應。在一些實施例中，在開始溫育所述培養裝置的48小時內，生色底物的反應是可檢測的。在上述實施例的任何一個中，溫育所述培養裝置可包括有氧溫育所述裝置。在上述實施例的任何一個中，在開始溫育所述培養裝置的24小時內，生色底物的反應可以是可檢測的。在上述實施例的任何一個中，微生物可選自例如黑曲霉、炭黑曲霉、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)、和繩狀青霉(Penicillium funiculosum)。在上述實施例的任何一個中，生色底物可選自例如4-氨基安替比林(4-AAP)、
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)、或它們的組合。在一些實施例中，生色底物還可包括3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羥基丙磺酸鈉鹽(TOOS)。在一些實施例中，該方法還可包括通過檢測與P-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反應來區別微生物。在一些實施例中，P-D-吡喃木糖苷酶生色底物可選自例如鄰硝基苯基-0 -D-吡喃木糖苷和對硝基苯基-P -D-吡喃木糖苷(NXP)。在另一方面，本發明提供一種試劑盒。所述試劑盒可包含薄膜培養裝置，其包含冷水可溶性膠凝劑、支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、以及包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑。在一些實施例中，生色底物可選自例如4-氨基安替比林(4-AAP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)、或它們的組合。在所述試劑盒的一些實施例中，所述試劑盒還可包含3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羥基丙磺酸鈉鹽(TOOS)。在所述試劑盒的一些實施例中，所述試劑盒還可包含用于檢測產生P-D-吡喃木糖苷酶的微生物的P -D-吡喃木糖苷酶生色底物。P -D-吡喃木糖苷酶生色底物可選自例如鄰硝基苯基-0 -D-吡喃木糖苷和對硝基苯基-P -D-吡喃木糖苷(NXP)。在所述試劑盒的上述實施例的任何一個中，培養基可包含過氧化氫指示劑。在所述試劑盒的一些實施例中，培養裝置可包含培養基、過氧化氫指示劑或二者。在所述試劑盒的上述實施例的任何一個中，所述試劑盒還可包括樣品制備附屬物，其選自例如樣品稀釋齊U、緩沖液、樣品采集裝置和吸管。
通過以下詳細描述，本發明這些和其他方面將顯而易見。詞語“優選的”和“優選地”是指在某些情況下可提供某些益處的本發明的實施例。然而，在相同的情況或其他情況下，其他實施例也可以是優選的。此外，一個或更多個優選實施例的詳述并不意味著其他實施例不適用，并且并非意圖將其他實施例排除在本發明的范圍之外。在任何情況下都不應將上述總結理解為對要求保護的主題的限制，所述主題僅由所附權利要求限定，權利要求可在審查期間進行修改。
圖I是薄膜培養裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖2是具有網格圖案的自支撐基材的一個實施例的頂視圖。圖3是薄膜培養裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖4是包括隔片和捕集元件的薄膜培養裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖5是根據本發明的檢測系統的一個實施例的框圖。
具體實施例方式在詳細說明本發明的任何實施例之前，應當理解，本發明并不將其應用局限于以下描述所提及的或附圖所示出的具體構造和組件布置方式。本發明能有其他的實施例，并且能夠以多種方式進行操作或實施。而且，應當理解，本文中所用的措詞和術語是用于描述，而不應認為是限制。本文使用“包括”、“包含”或“具有”以及它們的變體旨在涵蓋之后所列出的項目和它們的等同物以及另外的項目。除非另外規定或限制，術語“支撐”和“結合”以及它們的變型形式以廣義使用并且涵蓋直接和間接的支撐物和結合物。應當理解可使用其他實施例，并且在不脫離本發明的范圍的情況下可進行結構或邏輯改變。另外，例如“前部”、“后部”、“頂部”和“底部”等術語僅用于描述元件，因為它們彼此相關，而絕非意在述及設備的特定方位、指示或暗示必需或必要的設備的方位或者指定在使用中將要如何使用、安裝、顯示或設置本文描述的本發明。本發明整體涉及用于檢測和區別樣品中黑曲霉和/或炭黑曲霉微生物和相關菌種的方法和制品。本發明的方法提供這些微生物的生長、檢測和區別，所用方式是檢測某些酶的存在，當使用本發明的生色底物時，這些酶以在24至48小時內或更少時間可檢測出的級別產生。雖然不受任何特定理論的束縛，但認為產生葡萄糖氧化酶的微生物的菌種會在存在合適的底物和反應條件的情況下產生過氧化氫，繼而可對過氧化氫進行檢測。本發明提供一種過氧化氫指示劑，其能夠在培養裝置中溫育48小時內、或在培養裝置中溫育42小時內、或在培養裝置中溫育26小時內、或甚至在培養裝置中溫育24小時內檢測出產生葡萄糖氧化酶的微生物。過氧化氡指示劑本說明書的過氧化氫指示劑包括過氧化物酶和生色底物。優選地，過氧化物酶是辣根過氧化物酶。本領域已知在存在至少一種生色底物的情況下辣根過氧化物酶和過氧化氫反應為產生生色底物的反應。然而，據信，此前未描述過選擇至少一種生色底物以使得能夠使用過氧化氫指示劑在培養裝置中溫育的48小時內、或42小時內、或26小時內、或甚至24小時內檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物。本說明書的生色底物的例子包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP，SigmaAldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI))。在本說明書的一些示例性的情況中，培養裝置是市售的薄膜裝置(例如，3M PETRIFILM 酵母菌和霉菌計數板)，其包含BCIP作為磷酸酶檢測劑。本文發現通過加入辣根過氧化物酶和另外的BCIP，可實現產生葡萄糖氧化酶的生物的早期檢測。
權利要求
1.一種檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法，所述方法包括 提供 包含冷水可溶性膠凝劑的薄膜培養裝置、 支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、 包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑、以及 懷疑含有所述微生物的樣品； 在所述培養裝置中將預定體積的所述樣品、所述培養基和所述過氧化氫指示劑合并； 溫育所述培養裝置；以及 檢測所述至少一種生色底物的反應。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述薄膜培養裝置包含所述培養基。
3.—種檢測微生物的方法，所述方法包括 提供 包含冷水可溶性膠凝劑的薄膜培養裝置、 支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、 包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑、以及 懷疑含有所述微生物的樣品； 將預定體積的樣品和所述培養基合并以形成第一混合物； 在所述培養裝置中將所述第一混合物和所述過氧化氫指示劑合并； 溫育所述培養裝置；以及 檢測所述至少一種生色底物的反應。
4.根據權利要求3所述的方法，其中在與所述過氧化氫指示劑合并之前溫育所述第一混合物。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中溫育所述培養裝置包括有氧地溫育所述培養裝置。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在開始溫育所述培養裝置的48小時內所述至少一種生色底物的所述反應是可檢測的。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在開始溫育所述培養裝置的24小時內所述至少一種生色底物的所述反應是可檢測的。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物選自黑曲霉(Aspergillusniger)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)和繩狀青霉(Penicillium funiculosum)。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述至少一種生色底物選自5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、4-氨基安替比林以及它們的組合。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述至少一種生色底物還包括3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2_羥基丙磺酸鈉鹽。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，該方法還包括提供與所述過氧化氫指示劑組合的P-D-吡喃木糖苷酶生色底物，以及檢測所述P-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反應。
12.根據權利要求11所述的方法，該方法還包括通過檢測3-D-吡喃木糖苷酶與所述& -D-吡喃木糖苷酶生色底物的反應來區分所述微生物。
13.—種檢測微生物的方法，所述方法包括 提供 包含冷水可溶性膠凝劑和辣根過氧化物酶的薄膜培養裝置、 支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基、 至少一種生色底物、以及 懷疑含有所述微生物的樣品； 在所述培養裝置中將預定體積的所述樣品、所述培養基和所述至少一種生色底物合并； 溫育所述培養裝置；以及 檢測所述至少一種生色底物的反應。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過在環境光下直接目測來進行所述檢測。
15.根據權利要求I至13中任一項所述的方法，其中使用板讀取器裝置進行所述檢測。
16.—種試劑盒,所述試劑盒包括 包含冷水可溶性膠凝劑的薄膜培養裝置； 支持產生葡萄糖氧化酶的微生物的生長的培養基；以及 包含辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑。
17.根據權利要求16所述的試劑盒，其中所述至少一種生色底物選自5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、4-氨基安替比林以及它們的組合。
18.根據權利要求17所述的試劑盒，其還包含3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羥基丙磺酸鈉鹽。
19.根據權利要求16所述的試劑盒，其還包含P-D-吡喃木糖苷酶生色底物。
20.根據權利要求16至19中任一項所述的試劑盒，其中所述培養基包含所述過氧化氫指示劑。
21.根據權利要求16所述的試劑盒，其中所述培養裝置包含所述培養基、所述過氧化氫指示劑或兩者。
22.根據權利要求16-21中任一項所述的試劑盒，其還包括樣品制備附屬物，其選自樣品稀釋劑、緩沖液、樣品采集裝置和吸管。
23.—種檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法，所述方法包括 (a)給培養基接種樣品，其中所述培養基包含含有辣根過氧化物酶和至少一種生色底物的過氧化氫指示劑，并且其中所述樣品被懷疑含有產生葡萄糖氧化酶的微生物； (b)在允許產生葡萄糖氧化酶的微生物生長的條件下溫育所述培養基；以及 (c)檢查所述培養基以確定是否存在產生葡萄糖氧化酶的微生物。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述培養基包括液體培養基、半固體培養基、固體培養基或重構干培養基。
25.根據權利要求23所述的方法，其中在約30°C溫度下溫育所述接種的培養基約24小時。
26.根據權利要求23所述的方法，其中所述至少一種生色底物在存在辣根過氧化物酶和產生葡萄糖氧化酶的生長中的微生物的情況下產生可檢測的信號。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述可檢測的信號包括化學發光信號、熒光信號、顏色變化、電導率變化或任何上述的任何組合。
28.根據權利要求26所述的方法，其中所述至少一種生色底物選自5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、4-氨基安替比林以及它們的組合。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述至少一種生色底物還包括3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羥基丙磺酸鈉鹽(TOOS)。
30.根據權利要求28所述的方法，其中檢查所述培養基以確定是否存在產生葡萄糖氧化酶的微生物包括檢測紅色菌落。
31.根據權利要求23所述的方法，該方法還包括對產生葡萄糖氧化酶的微生物的菌落進行計數。
32.根據權利要求23至31中任一項所述的方法，該方法還包括提供與所述過氧化氫指示劑組合的P -D-吡喃木糖苷酶生色底物，以及檢測所述P -D-吡喃木糖苷酶生色底物的反應。
33.根據權利要求32所述的方法，該方法還包括通過檢測3-D-吡喃木糖苷酶與所述& -D-吡喃木糖苷酶生色底物的反應來區分所述微生物。
34.根據權利要求23所述的方法，其中所述培養基包含瓊脂。
全文摘要
本發明公開了用于檢測產生葡萄糖氧化酶的微生物的方法和試劑盒。所述方法包括提供培養基和包含生色底物的過氧化氫指示劑，所述生色底物可提供指示產生葡萄糖氧化酶的微生物的存在的可檢測的生色反應，并且公開了用于通過檢測另外的生色反應來區分微生物的另外的方法。
文檔編號C12Q1/54GK102713617SQ201080060353
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月21日 優先權日2009年12月30日
發明者史蒂芬·B·羅斯科, 斯特凡妮·J·莫勒, 邁克爾·J·斯瓦羅夫斯基 申請人:3M創新有限公司