專利名稱：高血壓易感基因Mfn2單核苷酸多態性位點rs3820189的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，涉及人線粒體融合基因2 (Mfn2)的(single nucleotide polymorphism, SNP)位點rs3820189及其與原發性高血壓相關性的檢測。本發明還涉及檢測這個SNP位點的方法和試劑盒。
背景技術：
原發性高血壓(essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環境與遺傳因素共同致病的常見而多發的心血管病癥，對人類健康造成了極大的影響。隨著分子醫學的發展，目前已經發現的高血壓相關基因已經有150余種，但是EH的發病機制仍然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環境共同作用的結果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環境因素是可以控制和確認的，而對高血壓遺傳學因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險因素的預防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發病，但是對固定不變的遺傳因素的認識不足卻在一定程度上嚴重影響著對高血壓發病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學的研究十分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態性[J].高血壓雜志，2001,9 :259-264)。近二十余年來，有關高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的保護，并已取得突飛猛進的發展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內源性抗高血壓機制是今后高血壓防治研究的主要方向之一，具有重要的研究價值和應用前景，如果通過調節內源性抗高血壓機制治療高血壓病，將會促進我國生物醫療技術的發展，并為我國每年節省巨大的醫療費用。目前所發現的高血壓相關基因，歸結起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學者陳光慧等[Chen GH，Zhang CH, Zhu YQ, et al.Expression of a novel gene related to hypertension[J]. Natl Med J China, 1997,77: 823-8 .]于1997年對培養的自發性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大鼠的血管平滑肌細胞進行差異顯示，克隆出一個新基因——增殖抑制基因(hyperplasiasuppressor gene, HSG)0它包含有4160bp的堿基對，共編碼661個氨基酸(NM_014874,GeneBank Access U41803)。后經一系列體內、體外實驗發現[Chen KH, Guo ΧΜ, DalongMa, et al. Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell Biol, 2004，6，872-883. ]，HSG 可以明顯地抑制 Ras-Raf■蛋白-絲裂素活化蛋白激酶基因表達，并且可以激活抗癌基因的表達，有效地阻遏細胞周期和抑制多種細胞的增殖，且這種抑制作用是通過細胞凋亡的方式實現的。因此HSG基因是原發性高血壓的候選基因之一，后經基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因2(mitofusin 2，Mfn2)。但是目前對Mfn2對EH作用尚不確定。綜上所述，為了最終實現治療高血壓，本領域迫切需要尋求原發性高血壓易感基因，并開發檢測原發性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測(包括早期診斷)高血壓易感基因的方法及檢測試劑盒。本發明提供了一種高血壓易感性基因的檢測方法，即檢測Mfn2基因rs3820189位點的基因型，rs3820189帶有T基因型的個體高血壓的發病風險顯著高于普通人群。所述的rs3820189位于Mfn2的5，引導序列中(片段重疊群contig :NT_021937. 19位置8043722 C/T)。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs3820189位置基于SEQ ID NO:1/6;引物 1 基于 SEQ ID NO :2/6 ；引物 2 基于 SEQ ID NO :3/6 ；探針 1 基于 SEQ ID NO :4/6 ；探針2基于SEQ ID NO 5/6 ；擴增產物基于SEQ ID NO :6/6。具體而言，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得Mfn2基因5，引導序列；(b)檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs3820189的基因型。所述的擴增Mfn2基因5，引導序列的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所不。所述的檢測rs3820189的基因型的探針序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所不。上述方法中涉及的測序、擴增、抽提基因組DNA等技術均可采用本領域的常規操作方法。例如，所述的擴增可以采用聚合酶鏈反應；其中，變性和退火延伸的溫度分別是95和60攝氏度。循環數為30-45
本發明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有與位點rs3820189結合的探針。在本發明的一個實施例中，與位點rs3820189結合的探針的序列如SEQ ID NO 4和 SEQ ID NO 5 所示。上述試劑盒還可以包括特異性擴增Mfn2基因5’引導序列中包含rs3820189位點的區域的引物。在本發明的一個實施例中，與特異性擴增Mfn2基因5’引導序列中包含rs3820189位點的區域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。本發明經過多年研究，首次發現和證明了 Mfn2基因單核苷酸多態性位點rs3820189(位于Mfn2的5，引導序列中，片段重疊群contig :NT_021937. 19位置8043722 C/T)與高血壓密切相關，而且發現了它的新功能Mfn2基因單核苷酸多態性位點rs3820189位于Mfn2，5，引導序列中(片段重疊群contig :ΝΤ_021937· 19位置8043722 C/T)基因型的改變將導致高血壓的發病風險升高，其中關聯研究結果顯示，在Mfn2基因rs3820189C — T在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P<0. 05)，該SNP多態性可改變轉錄因子結合位點。在此基礎上完成了本發明。本發明提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的Mfn2基因rs3820189位點的基因型，以此判斷該個體患高血壓的發病風險是否高于普通人群。在一優選例中，所述的差異是選自rs3820189的單核苷酸多態性。rs3820189位于
4Mfn2，5，引導序列中(片段重疊群COntig:NT_021937. 19位置8043722 C/T)。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號:rs3820189位置基于SEQ ID NO :1/6。本發明提供了一種檢測樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態性的方法，包括步驟
(a)用Mfn2基因5’引導序列特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產物；和
(b)檢測擴增產物中單核苷酸多態性位點rs3820189的基因型。Mfn2 基因 rs3820189 位點的詳細序列可參見網址 http//www. ncbi. nlm. nih.gov/中登錄號為rs3820189的核苷酸序列，也可參見SEQ ID NO 1。本發明對Mfn2基因中的5’引導序列中(片段重疊群contig :NT_021937. 19位置8043722 C/T)區域進行了測序。Mfn2基因rs3820189位點的多態性可應用于高血壓的個性化治療。在使用本發明Mfn2基因rs3820189位點的多態性時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的Mfn2蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的Mfn2或其拮抗劑、激動劑施用于普哺乳動物，其中該安全有效劑量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內。檢測Mfn2基因的rs3820189的基因型也可用于輔助診斷高血壓。檢測可以針對基因組DNA，也可針對Mfn2基因的擴增片段。Mfn2基因的rs3820189的基因型分析可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變，等等。本發明提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測人血管緊張素II-I型受體基因(Mfn2)的rs3820189位點的基因型，rs3820189帶有T基因型的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增rs3820189位點的引物，還可以包括擴增Mfn2基因5’引導序列區域的引物。利用本發明檢測rs3820189位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。
圖1是一份樣本基因組DNA質量的檢測結果示意。圖2是測序結果截圖。顯示了 rs3820189的一種SNP基因型的測序結果。rs3820189位于Mfn2的5，引導序列中(片段重疊群contig :ΝΤ_021937· 19位置8043722C/T)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆；實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1熒光PCR檢測一、實驗材料
7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，聚合酶鏈反應液(TaqMan EXPress MasterMix)由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設計與合成
以MFn2基因5’引導序列的部分序列為模板，使用I^rimer ExpressTM 2. O軟件分析TaqMan引物和探針位點，并由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。檢測用引物
MFn2 基因 rs3820189 上游引物序列5 ‘ - CCACAGTCCACAGTCAGACC-3 ‘MFn2 基因 rs3820189 下游引物序列5 ‘ - TCAAGTAATCCTCCCACCTC -3 ‘熒光探針
MFn2 基因 rs3820189 熒光探針 1 :5 ‘ -VIC- atgctgacCacatgttgaag -TAMRA-3 ‘MFn2 基因 rs3820189 熒光探針 2 5 ‘ -FAM- atgctgacTacatgttgaagt -TAMRA-3 ‘三、樣本檢測
實驗共檢測擬3例高血壓病例和495例正常對照人群，每例收集血樣標本約2ml，用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結果用微量紫外/可見光分光光度計(INFINIGEN公司)檢測。按如下體系進行熒光PCR擴增，最后用SDS 2. 3掃描并聚類分析。表 權利要求
1.一種高血壓易感性基因多態性位點的檢測方法，其特征在于，檢測Mfn2基因rs3820189位點的基因型，rs3820189帶有T基因型的個體高血壓的發病風險顯著高于普通人群。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，rs3820189位點位于Mfn2基因5’引導序列內。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，該方法包括步驟抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得Mfn2基因5，引導序列中包含rs3820189位點的區域；檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs3820189的基因型。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，擴增Mfn2基因5’引導序列中包含rs3820189位點的區域的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，檢測rs3820189的基因型的探針序列如SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
6.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的擴增采用的是聚合酶鏈反應；其中，變性和退火延伸的溫度分別是95和60攝氏度。
7.—種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它含有與位點rs3820189結合的探針。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，與位點rs3820189結合的探針的序列如SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
9.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，它還包括特異性擴增Mfn2基因5’引導序列中包含rs3820189位點的區域的引物。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，特異性擴增Mfn2基因5’引導序列中包含rs3820189位點的區域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。
全文摘要
本發明屬于分子生物學和醫學領域，涉及一種檢測高血壓易感性基因多態性位點的方法及其檢測試劑盒。本發明提供了一種檢測高血壓易感性基因多態性位點的方法，它包括檢測人線粒體融合基因2(Mfn2)rs3820189位點的基因型，rs3820189帶有T基因型的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增rs3820189位點的引物，還可以包括擴增Mfn2基因5’引導序列包含rs3820189位點的區域的引物。利用本發明檢測rs3820189位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102586408SQ20111000569
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月12日 優先權日2011年1月12日
發明者劉潔琳, 劉闊, 劉雅, 吳海, 曾清, 李瑤, 樓煜清, 溫紹君, 牛秋麗, 王佐廣, 顧偉 申請人:復旦大學, 首都醫科大學附屬北京安貞醫院