DHFR基因多態性檢測體系及其試劑盒的制作方法

本發明涉及一種基因多態性的檢測產品以及該產品所用到的引物、探針、檢測體系，屬于生物
技術領域：
。
背景技術：
：基因組dna在某一特定的核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失，并且其在群體中出現的頻率≥1％，稱為單核苷酸多態性(snp)，基因多態性與某些基因組dna的修復功能有關，多態性可以顯著影響個體對藥物的敏感性，分子水平的疾病診斷可對腫瘤個體化治療和預后判斷提供指導。氫葉酸還原酶(dhfr)是甲氨蝶呤(mtx)靶標酶，dhfr是細胞內葉酸代謝的關鍵酶，mtx抗腫瘤作用的基本原理是競爭性結合dhfr，使二氫葉酸不能被還原成四氫葉酸。研究發現dhfr基因多態性829位點發生c>t突變，而后兩者導致了dhfr蛋白質結構的改變，進而影響dhfr與mtx結合的空間結構，最終引起dhfr和mtx親和力的下降，提高了細胞的抗藥性，dhfr的c829t單核苷酸多態性檢測，有助于臨床醫生制定更具針對性的個體治療方案，獲得較佳效果的同時也減輕患者的經濟與身體負擔。目前主要測采用一代測序、flp、等位基因特異的寡核苷酸雜交、等位基因特異的pcr和基因芯片等技術，但是操作過程繁瑣，需要更換反應管而易發生污染，多需要電泳和多步后處理，影響檢測結果的準確性。或儀器設備昂貴，難以大規模推廣應用。傳統的巢式pcr反應由于有2次pcr擴增，不但耗時、開管操作極易造成交叉污染導致假陽性及結果的不準確性，而檢測結果需要電泳及凝膠成像系統才能看到結果，從而降低了擴增多個靶點的可能性，從pcr到檢測結果出來大約需要5h，主要應用于分子生物學領域和醫學檢測研究中。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種能在樣本初始模板量低的條件下準確檢測出樣本基因dhfr的c829t多態位點的基因型的dhfr基因多態性檢測試劑盒，以及該試劑盒所用的檢測體系。本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：1、一種dhfr基因多態性檢測體系，包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸，所述檢測引物對包括檢測dhfr基因c829t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側上游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側下游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.3所示的內側上游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.4所示的內側下游引物；所述外側上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測dhfr基因c829t多態性位點為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測dhfr基因c829t多態性位點為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配堿基；所述肽核酸包括與檢測dhfr基因c829t多態性位點的內側上游引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測dhfr基因c829t多態性位點的內側下游引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸。上述dhfr基因多態性檢測體系還包括內參引物對、內參探針、質控引物對和質控探針；所述內參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示。上述各個探針的5’端設有熒光報告基團，所述各個探針的3’端設有熒光淬滅基團；所述熒光報告基團是fam、hex、rox或cy5，所述熒光淬滅基團是bhq1、bhq2或tamra。上述外側上下游引物在反應體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內側上下游引物在反應體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質控引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質控探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述dhfr基因多態性檢測體系還包括甲酰胺，反應體系中加入甲酰胺的體積是反應體系總體積的12％。本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種采用上述檢測體系的dhfr基因多態性檢測產品。本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種dhfr基因多態性檢測試劑盒，包括pcr檢測液、質控檢測液、陽性對照和陰性對照；所述pcr檢測液包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸；所述檢測引物對包括檢測dhfr基因c829t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側上游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側下游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.3所示的內側上游引物、檢測dhfr基因c829t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.4所示的內側下游引物；所述外側上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測dhfr基因c829t多態性位點為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測dhfr基因c829t多態性位點為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配堿基；所述肽核酸包括與檢測dhfr基因c829t多態性位點的內側上游引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測dhfr基因c829t多態性位點的內側下游引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸；所述質控檢測液包括內參引物對、內參探針、質控引物對和質控探針；所述內參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示；所述陽性對照液是濃度為野生型質粒和純合子質粒的混合溶液；所述陰性對照液是濃度為不含dhfr基因野生型、雜合子和純合子的質粒溶液。上述pcr檢測液和質控檢測液中還包括pcr緩沖液、2.5mm的dntps和5u/μl的taqdna聚合酶；所述pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、15mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置所述pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3；所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp。上述外側上下游引物在反應體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內側上下游引物在反應體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質控引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參探針在反應體系中的最終濃度為0.190μm/l，所述質控探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述dhfr基因多態性檢測試劑盒，還包括甲酰胺，反應體系中加入甲酰胺的體積是反應體系總體積的12％。本發明具有積極的效果：(1)本發明的dhfr基因多態性檢測體系及其試劑盒，采用特異引物探針組合，采用改進后的巢氏pcr，增加了檢測的敏感性和可靠性，閉管操作降低污染，具有高的靈敏度，靈敏度可達到0.5％～1％，與常規pcr的濃度相比，辦發明容易地檢測出非常低濃度樣本的dhfr(c829t)位點的基因型，可以為甲氨蝶呤藥物的臨床用藥提供指導。(2)本發明的保留了原有的熒光定量的高敏感性和特異性的基礎上，極大地縮短了實驗時間，提高檢測效率，節約樣本，并且本發明的基因多態性檢測試劑盒，采用金標準進行對照實驗，基因型符合率≥99％，分子分型準確度高。(3)本發明設計了內參和質控對檢測的整個檢測過程監控，確保樣本可檢測結果的準確性與可靠性。附圖說明圖1采用實施例的試劑盒檢測陽性對照擴增曲線。圖2采用實施例的試劑盒檢測野生樣本擴增曲線。圖3采用實施例的試劑盒檢測純合樣本擴增曲線。圖4采用實施例的試劑盒檢測雜合樣本擴增曲線。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本
發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。實施例一、試劑盒的組成。本實施例的dhfr(c829t)基因多態性檢測試劑盒包括：pcr檢測液、質控檢測液、陽性對照、陰性對照，具體成分如表1所示。表1試劑盒組成表上述表1中試劑盒各組分的說明如下：pcr檢測液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動酶、引物對、探針和肽核酸混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針肽核酸混合液包括檢測dhfr(c829t)的外側上游引物、檢測dhfr(c829t)的外側下游引物、檢測dhfr(c829t)的內側上游引物、檢測dhfr(c829t)的內側下游引物、針對dhfr(c829t)的內側上游引物的肽核酸、針對dhfr(c829t)的內側下游引物的肽核酸、檢測dhfr(c829t)的野生型探針、檢測dhfr(c829t)的純合子探針，序列見表2，均由上海百力格生物技術有限公司合成。外側引物在反應體系中的最終濃度為0.05μm/l，內側引物在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，肽核酸在反應體系最終的濃度為1nm/l，檢測dhfr(c829t)野生型探針和檢測dhfr(c829t)純合子探針在最終反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發明的檢測反應體系中加入12％甲酰胺試劑。質控液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動酶、引物對和探針混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針混合液包括檢測內參上游引物、檢測內參的下游引物、檢測內參的探針、檢測質控上游引物、檢測質控下游引物、檢測質控的探針，序列見表2，引物、探針及肽核酸均由上海生工生物工程有限公司合成。內參引物和探針在反應體系的最終濃度為0.19μm/l，質控引物和探針在反應體系的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發明的質控反應體系中加入12％甲酰胺試劑。陽性對照液是濃度為10ng/μl的野生型質粒和10ng/μl的純合子質粒的混合溶液。陰性對照液是濃度為10ng/μl不含dhfr基因野生型、雜合子和純合子的質粒溶液。野生型質粒的獲取為野生型質粒常規構建步驟：設計位于突變位點兩側的引物，擴增含對應位點的野生型產物，構建入質粒，挑選并測序驗證。純合子質粒的獲取為純合子質粒常規構建步驟：設計一條覆蓋相應多態性位點并將等位堿基引入到引物序列中的特異引物，與相對應的上游或下游野生型引物配對，擴增含相應位點的目的片段產物，構建入質粒，挑選并測序驗證。上游引物、下游引物、探針和肽核酸的核苷酸序列如表2所示。表2引物、探針、肽核酸序列表引物探針名稱seqno.核苷酸序列(5’-3’)dhfr外側上游引物1tgatgtccaggaggagaaaggdhfr外側下游引物2ctggatatacacgtaggaagcdhfr內側上游引物3actaagtgcttctccaagacdhfr內側下游引物4acaatgtcaaggactggcdhfr內側上游肽核酸5tgcttctccaagacdhfr內側下游肽核酸6caatgtcaaggactdhfr野生型探針7actgagtccccagcacctactacdhfr純合子探針8ctgagtccccagcacctcctat內參上游引物9tgtaggagggacttagagaag內參下游引物10accctttagggagaaaacgct內參探針11cctgccctttgagtttgatgat質控上游引物12ctttgtcacccaggctagtg質控下游引物13cacgatggtgtgtgcctataa質控探針14cactgtctcactgtagcctcdhfr外側引物是針對dhfr(c829t)多態性位點兩側產物長度約300-500bp的引物，dhfr內側引物是針對dhfr(c829t)多態性位點兩側產物長度約90-150bp的引物，為了使外側引物先于內側引物與dna模板結合，外側引物引入脫氧次黃嘌呤，dhfr內側肽核酸是針對dhfr(c829t)多態性位點內側的上游引物和內側下游引物設計的dna類似物，肽核酸部分序列與內側引物重合，能夠先于內側上游引物與dna模板結合，從而在反應初始階段抑制了內側引物的擴增，dhfr野生型探針和dhfr純合子探針是針對dhfr(c829t)多態性位點設計的特異性探針，探針的5’端標記有熒光信號基團，熒光信號基團有fam、hex、rox、cy5等，探針的3’端標記有熒光淬滅基團，熒光淬滅基團包括bhq1、bhq2、tamra等，由于野生型探針和純合子探針序列只相差一個堿基，特異性較低，本發明將脫氧次黃嘌呤引入到檢測多態性檢測特異性探針中，并在探針的3’端引入1個錯配堿基，在一定程度上提高探針的特異性。本實施例的野生型探針的熒光信號基團是fam，純合子探針的熒光信號基團是hex。內參引物探針是區別于dhfr的gapdh基因，通過檢測內參基因的擴增，可分析實驗結果有效性。質控基因的引物設計是排除dhfr基因外側引物以外的dhfr基因其他位置保守區域，質控引物探針不享受突變檢測位點引物和引物結合位點，在保守區域不同區段設計引物探針，質控序列擴增在本發明中作用除了可校正諸如dna含量、標本內pcr聚合酶抑制物，不同反應管間擴增效率的差異，還用于通過比較基因型和質控的擴增情況確定樣本基因型。二、試劑盒的使用方法。本實施例的dhfr(c829t)基因多態性檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：1、樣本dna提取。采用試劑盒(axygenmultisourcegenomicdnaminiprepkit)提取樣本血液樣本dna，或者采用康為世紀生物科技有限公司的口腔拭子基因組dna提取試劑盒(貨號：cw0530s)抽提口腔黏膜樣本dna，具體的操作參見試劑盒產品說明書。2、樣本dna質量檢測。獲得樣本dna后，通過thermo-fisher核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)測定濃度和純度，控制樣本質量，最終加入反應體系中的樣本。od260/od280的比值在1.8～2.0之間的可獲得最優反應結果，濃度稀釋為5～20ng/μl。3、pcr反應。采用本實施例的dhfr(c829t)基因多態性檢測試劑盒試進行檢測，反應體系的體積為10μl，試劑盒各組分的使用濃度及在反應體系中的終濃度詳見表1。(反應體系的體積還可以是20μl，在配制時將10μl反應體系中的組分翻倍即可)。1)配制10μl的質控pcr反應體系和10μl的檢測pcr反應體系：質控pcr反應體系：取9μl的質控檢測液和1μl樣本dna。檢測pcr反應體系：別取9μl的檢測試劑和1μl模板(如果是dna樣本，濃度5～20ng/μl)，并設置重復。反應體系中的模板分別指對應的樣本dna，陽性對照，陰性對照，空白對照，空白對照液為超純水。2)pcr反應程序。各反應體系在abi實時熒光定量pcr擴增儀(stepone)上進行實時熒光pcr反應，最優反應程序如表3所示。表3pcr反應程序表優選地，pcr擴增的條件為：預變性階段的條件95℃，10min；循環1，10個循環，條件為95℃15s，退火溫度55℃，時間為10秒，延伸溫度72℃，時間30秒；循環2，30個循環，條件為94℃15s，退火溫度60℃，時間為10秒；循環3條件為4℃保溫。本發明為了防止循環段2較長的片段的非特異性擴增，不設置延伸程序。4、pcr結果判定。1)試劑盒有效性的判定。陽性對照：陽性對照fam和hex信號通道所有的擴增曲線有明顯的指數增長期，且ct值均陽性≤25。陰性對照：陰性對照fam、hex信號通道所有的擴增曲線無明顯的指數增長期，或ct值均陰性≥40。空白對照：空白對照陰性對照fam、hex信號通道所有的擴增曲線無明顯的指數增長期。2)檢測樣本有效性的判定。根據內參fam通道和質控hex通道的ct值進行判定：內參gapdh的fam信號通道擴增曲線呈s型，但ct<18，或者ct>32，檢測結果無效；內參gapdh的fam信號通道擴增曲線不呈s型，但且18≤ct≤32之間，樣本檢測結果無效；內參gapdh的fam信號通道擴增曲線呈s型，并且18≤ct≤32之間，樣本有效。質控dhfr的hex信號通道擴增曲線呈s型，且ct＜20，則樣本基因組加入過量，建議稀釋后重新檢測；質控dhfr的hex信號通道擴增曲線呈s型，20≤ct≤30，樣本加入量適中，適合進行結果判定；質控dhfr的hex信號通道擴增曲線呈s型，ct＞30,則樣本基因組加入量低，不能穩定的進行突變結果判定。3)多態性結果的判定。通過以上步驟，確定檢測樣本和實驗結果均有效的前提下，再對樣本的結果進行判定。野生基因型檢測是檢測反應液中fam信號通道的擴增情況，純合基因型檢測是檢測反應液中hex信號通道的擴增情況。按照以下步驟對樣本檢測結果進行判讀，確定樣本基因型。a.若檢測液中有fam信號通道的擴增曲線有明顯的指數增長期，hex信號通道的擴增曲線無明顯的指數增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為野生型。b.若檢測液中有hex信號通道的擴增曲線有明顯的指數增長期，fam信號通道的擴增曲線無明顯的指數增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為純合型。c.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴增曲線均有明顯的指數增長期，且|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|≤5，則檢測樣本為雜合型。d.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴增曲線均有明顯的指數增長期，|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|>5，則將檢測的較小的ct值與質控ct比較，兩者之間的差記做△△ct，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質控hex)|≤8，則為ct值較小檢測結果基因型，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質控hex)|>8,重新檢測。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之中。sequencelisting<110>上海賽安生物醫藥科技股份有限公司<120>dhfr基因多態性檢測體系及其試劑盒<130>無<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1tgatgtccaggaggagaaagg21<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2ctggatatacacgta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