專利名稱：一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺的制作方法
技術領域：
本發明涉及微流控芯片技術，特別提供了一種基于連續液滴操控的微流控芯片液滴核酸純化平臺。
背景技術：
從生物樣品中提取核酸是分子生物學和遺傳學等生命科學研究領域中的ー項基本技木。核酸純化的傳統方法如酚-氯仿抽提法，存在著有機溶劑毒性大、所需時間長、難以實現微型化、自動化操作等缺點。而近年來發展起來的以玻璃粉、離子交換樹脂、硅膠(含磁性硅膠)等為吸附材料的核酸固相萃取法，不僅可以避免使用毒性強的有機溶剤，而且能大幅度提高提取效率，但仍存在著純化時間長(幾十分鐘)、耗試劑量大(μ L-mL級)等缺
好、ο微流控芯片是ー個新興的技術平臺，是在ー塊幾平方厘米的芯片上，由網絡化的微通道控制流體，完成常規化學或生物實驗室的各種操作。微液滴(droplet)是新近在微流控芯片上發展起來的一種操控微小體積液體的技木，是將微通道中的液滴作為微反應器。 微液滴用于反應具有如下優點降低樣品或試劑消耗；實現快速混合，縮短反應時間；具有高通量分析的潛能等。目前已有很多基于微流控芯片的液滴操作技術單元報導，如液滴生成、液滴分裂、液滴融合/試劑添加、液滴混合，并應用于酶反應動力學研究、蛋白質結晶、 微球合成等方面。而大部分研究工作包含連續的多步的反應步驟，如廢液的去除、反應液的添加等，這就需要將上述操作単元通過有效的方法集成于同一塊微流控芯片以實現連續的多步反應目的。已有的此類研究工作，是將含反應液的液滴滴加芯片的表面，通過移動磁鐵控制液滴中磁珠的移動，磁珠帶動少量的溶液離開原液滴(為液滴分裂過程)并與另一液滴融合 (為液滴融合過程)，如此循環可實現多步反應的目的。它的主要缺點是不能在線高通量的生成液滴、操控液滴，因而不能連續的高通量的處理樣本即一次只能處理ー個樣本。人們迫切希望獲得ー個基于連續液滴操控的微流控芯片平臺來實現在線的多步實驗，如核酸純化過程。而該平臺的搭建并不能簡單的組合現有的液滴操作單元來實現，如現有液滴分裂技術中液滴分裂比例建立在分裂區至出口的通道阻力比例，而在涉及多步液滴操控中，每個液滴操控單元對其壓力比例都造成不穩定的干擾(隨液滴的狀態變化)，從而造成不穩定的液滴分裂；在每次液滴分裂后，油相也被同比例分裂，造成液滴間的間距變小，使得后續的液滴操控比較困難。
發明內容
本發明的目的是提供一種適于高通量研究要求的基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺；具體涉及含反應物和磁珠的液滴的形成、每個純化步驟中試劑的添加及廢液去除以及過程中的控制技木。我們首次將液滴生成単元、不對稱(含體積不對稱和內含物不對稱)液滴分裂単元和溶液添加単元等多個液滴操作単元集成于同一微流控芯片中。其中溶液添加単元用于向液滴中添加下一個反應液(即純化過程中所需的清洗緩沖液和洗脫緩沖液)，液滴分裂単元用于廢液的去除，此步驟(溶液添加-液滴分裂)重復進行，即實現連續的多步液滴操縱過程。將磁鐵放置于液滴分裂単元里，用以操縱液滴分裂時功能化磁珠在子液滴中的分配，而功能化的磁珠能選擇性的吸附或釋放特定的生物分子如DNA、RNA。如此，本發明的基于連續液滴操控的微流控芯片平臺可用以核酸的純化過程。本發明提供了一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 該平臺是由ー個液滴生成區1、ニ個溶液添加區4、三個液滴混合區2、三個液滴分裂區3及相應的進樣入ロ、出口、磁鐵池9組成；
其中進樣入口由四個水相進樣入口 8. 1、8.2、8.3、8.4，三個油相進樣入口 7. 1,7.2, 7. 3組成；出口由三個廢液池5. 1、5. 2、5. 3，收集池6組成；磁鐵池9內放置磁鐵；
液滴生成區1、液滴混合區2與液滴分裂區3依次排列為一次液滴生成-廢液去除單元，每個區之間依靠通道直接連接；
溶液添加區4、液滴混合區2與液滴分裂區3依次排列為一次溶液添加-廢液去除單元，每個區之間依靠通道直接連接；
所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺含一個液滴生成-廢液去除単元、 兩個溶液添加-廢液去除単元，每個單元之間依靠通道直接連接；無其它特殊結構；
該平臺由上下兩層PDMS (聚ニ甲基硅氧烷)通過等離子體封接，并將磁鐵放置在封接好的平臺磁鐵池9內而成，其中上層PDMS含有通道、液池，下層PDMS基板用于封閉通道和液池。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其液滴生成區是由磁珠溶液入口 8. 2、樣本及結合緩沖液入口 8. 1、油相入口 7. 1及相應的通道組成。磁珠溶液和樣本及結合緩沖液平行進入通道后，在油相的剪切力下，產生含磁珠、樣本、結合緩沖液的液滴。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其液滴分裂區 3是由T型分裂通道3. 1、連接分裂通道出ロ的細通道組3. 2、磁鐵池9及磁鐵池9內放置的磁鐵組成。所述的細通道組由1-10根細通道組成，用于平衡T型通道兩個出口的壓力，而不受其它液滴分裂/溶液添加単元的干擾。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其T型分裂通道3. 1的兩個出口到細通道組3. 2之間的長度不等，造成T型通道的兩端壓力不等，因而實現體積不對稱的液滴分裂，即液滴分裂產生的兩個子液滴的體積不一祥。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其磁鐵用于吸引液滴中的磁珠，讓其聚集在有磁鐵的一側，并在液滴分裂時分配到有磁鐵的一側的子液滴中從而實現內含物不對稱的液滴分裂。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其溶液添加區 4由連接油相入口 7. 2或7. 3的油相添加通道4. 1和連接水相入口 8. 3或8. 4的水相添加通道4. 2組成。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其油相添加通道4. 1為雙T型，分別向分裂通道3. 1的兩個出口端通道同時添加油相以增大液滴間的距離利于后續液滴的操控，于液滴內的純化過程無關。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其水相添加通道4. 2為T型，水相進入通道后，直接和液滴融合，實現溶液添加的過程。本發明提供的一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其液滴混合區 2由逶迤型的通道組成。本發明的優點
1、本發明首次將多個液滴生成単元、液滴分裂単元、溶液添加単元及液滴混合単元集成于同一微流控芯片平臺，用以實現多步的液滴操縱過程；
2、本發明首次實現了體積不對稱和內含物不對稱的液滴分裂，使基于磁珠的在線高通量的液滴固相萃取(SP^成為可能；
3、液滴可高通量的產生、操縱，該平臺具有高通量處理樣本的潛力；
4、本發明具有純化時間短(對每個液滴的核酸純化過程約lmin)、耗試劑量少(液滴為 pL-nL級)的優點。
圖1為基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺的俯視圖，含液滴生成區1， 液滴混合區2，液滴分裂區3，溶液添加區4，廢液池5. 1,5. 2,5. 3，收集池6，水相進樣入口 8. 1、8. 2、8. 3、8. 4，油相進樣入口 7. 1、7. 2、7. 3，裝有磁鐵的磁鐵池9 ；
圖2為基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺的剖面圖； 圖3為基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺DNA純化原理圖； 為清楚說明其純化過程，省略油相的添加等與純化過程無關的部分。純化過程包括以下三個步驟(1)結合步驟，樣本及結合緩沖液(水相入口 8. 1)和磁珠(水相入口 8. 2)并行進入通道，并在油相(油相入口 7. 1)的流體剪切力作用下，生成液滴，液滴在經過逶迤型通道時得到混合，其中樣本中的DNA結合在磁珠上，而其它的雜質如蛋白質、細胞碎片則保存自由狀態。在第一次分裂吋，大部分的廢液被去除至廢液池5. 1，結合了 DNA磁珠被保留并進行下一歩操作；( 清洗步驟，清洗緩沖液(水相入口 8. 3)進入，并添加入上個步驟的液滴，經過液滴混合、液滴分裂繼續去除樣本中的雜質至廢液池5. 2，結合了 DNA的磁珠被保留并進行下一歩操作；C3)洗脫步驟，洗脫緩沖液(水相入口 8. 4)加入液滴中，使DNA從磁珠上解脫下來，經過液滴分裂后在收集池6中收集，而磁珠則流向廢液池5. 3 ；
圖4在此平臺上DNA純化過程中涉及的連續液滴操控圖；(a)含磁珠、樣本和結合緩沖液的液滴生成和混合；(b)廢液的去除(第一次液滴分裂)；(c)清洗緩沖液的添加(第一次溶液添加)；(d)廢液的去除(第二次液滴分裂)；(e)洗脫緩沖液的添加(第二次溶液添加); (f)廢液的去除(第三次液滴分裂)；
圖5乙肝病毒血清樣本DNA純化的收集液進行PCR擴增的產物電泳圖。
具體實施例方式下面的實施例將對本發明予以進ー步的說明，但并不因此而限制本發明。
實施例1 λ -DNA標準品的提取本實施例所用基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺俯視圖如圖1所示，由一個液滴生成區1、ニ個溶液添加區4、三個液滴混合區2、三個液滴分裂區3及相應的進樣入 ロ、出口、磁鐵池9組成。其液滴生成區1是由磁珠溶液入口 8. 2、樣本及結合緩沖液入口 8. 1、油相入口 7. 1 及相應的通道組成。液滴分裂區3是由T型分裂通道3. 1、連接分裂通道出口的細通道組 3. 2、磁鐵池9及磁鐵池9內放置的磁鐵組成，其中T型分裂通道3. 1的兩個出口到細通道組 3. 2之間的長度不等。溶液添加區4由連接油相入口 7. 2或7. 3的油相添加通道4. 1和連接水相入口 8. 3或8. 4的水相添加通道4. 2組成，其中油相添加通道4. 1為雙T型，分別向分裂通道3. 1的兩個出口端通道同時添加油相以增大液滴間的距離利于后續液滴的操控， 水相添加通道4. 2為T型，水相進入通道后，直接和液滴融合，實現溶液添加的過程。液滴混合區2由逶迤型的通道組成。出口由三個廢液池5. 1、5.2、5.3，收集池6組成。液滴生成區1、液滴混合區2與液滴分裂區3依次排列為一次液滴生成-廢液去除単元，每個區之間依靠通道直接連接；溶液添加區4、液滴混合區2與液滴分裂區3依次排列為一次溶液添加-廢液去除単元，每個區之間依靠通道直接連接；
該平臺由上下兩層PDMS通過等離子體封接(如圖2所示)，并將磁鐵放置在封接好的平臺磁鐵池9內而成，其中上層PDMS含有通道、液池，下層PDMS基板用于封閉通道和液池。將裝有相應樣本/試劑/油相的注射器通過塑料管分別連接圖1所示芯片的各油相和水相入口進樣(油相從油相入口 7. 1、7.2、7.3進樣，磁珠從水相入口 8. 2進樣，含樣本的結合緩沖液從水相入口 8. 1進樣，清洗緩沖液從水相入口 8. 3進樣，洗脫緩沖液從水相入 ロ 8. 4進樣)，使用注射泵推動進樣。λ-DNA標準品加入結合緩沖液中，使其終濃度為Ing/ μし使用的各油相和水相如下油相為添加l%span80的礦物油；磁珠溶液為25mg/mL ニ氧化硅包被的超順磁磁珠(直徑ISOnm大小);結合緩沖液為硫氰酸胍溶液(5M硫氰酸胍，20 mM EDTA, 1% Triton X-100,0. 1 M Tris, pH 6. 4);清洗緩沖液為80%乙醇；洗脫緩沖液為TE 緩沖液(PH7. 5)。設定流速如下液滴生成取的油相和溶液添加區的油相分別為0. 42 L/ min,0. 17 L/min,0. 17 L/min ；磁珠溶液，樣本及結合緩沖液，清洗緩沖液，洗脫緩沖液分別為 0. 08 L/min，0. 17 L/min，0. 20 L/min 和 0. 10 L/min。液滴穩定生成、分裂和溶液添加，在此平臺上DNA純化過程中涉及的連續液滴操控圖見圖4，(a)含磁珠、樣本和結合緩沖液的液滴生成和混合；(b)廢液的去除(第一次液滴分裂)；(c)清洗緩沖液的添加(第一次溶液添加)；(d)廢液的去除(第二次液滴分裂)； (e)洗脫緩沖液的添加(第二次溶液添加)；(f)廢液的去除(第三次液滴分裂)。單個液滴完成DNA純化過程耗時約lmin。為計算平均提取效率，收集一段時間內提取物進行定量分折。測定提取效率為46%。實例2乙肝患者血清樣本中乙肝病毒DNA的提取
所用基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺及DNA純化方法同實施例1，HBV 血清(含陰性和陽性血清樣本)預先進行蛋白酶K消化處理后從結合緩沖液入口處進樣(血清蛋白酶K:結合緩沖液為1:1:20,37° C孵育30min)。PCR擴增的引物由大連寶生物公司合成，擴增HBV S蛋白區基因組序列(全長1170bp)，其M9bp-HBV引物序列是上游引物(位置586-607) 5，- GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3，和下游引物(位置793-814) 5，-GAGGACAAACGGGCAACATACC-3，，擴增的產物為 229bp(序列為 GACTC GTGGTGGACT TCTCTCAATTTTCTAGGGGG AACTACCGTG TGTCTTGGCC AAAATTCGCA GTCCCCAACC TCCAATCACT CACCAACCTC TTGTCCTCCA ACTTGTCCTG GTTATCGCTG GATGTGTCTG CGGCGTTTTA TCATCTTCCT CTTCATCCTG CTGCTATGCC TCATCTTCTT GTTGGTTCTT CTGGACTATC AGGGTATGTT GCCCGTTTGT CCTC)。PCR擴增的條件為95 C 5min預變性，30個溫度循環(95 C變性30s，56 C退火30 s, 72 C 延伸30 s)，最后72 C延伸10 min。PCR產物進行PMMA芯片電泳鑒定，電泳緩沖液為 0. 5% HPMC-4000,0. 1% PVP, 6% mannitol 的 IX TBE 緩沖液，預先添加 ImM GeneFinder 做DNA染色。在200V/cm場強下分離，3. 5cm處檢測。如圖5所示，陽性血清樣本提取物PCR 結果可見229bp的產物，陰性樣本則無產物。提示該基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺可提取足夠適用于后續分析的DNA量，而去除樣本中其它影響PCR反應的雜質。
權利要求
1.一種基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于該平臺是由ー個液滴生成區(1)、ニ個溶液添加區(4)、三個液滴混合區(2)、三個液滴分裂區(3)及相應的進樣入口、出口、磁鐵池(9 )組成；其中進樣入口由四個水相進樣入口(8. 1)、(8. 2)、(8. 3)、(8. 4)，三個油相進樣入口 (7. 1)、(7. 2)、(7. 3)組成；出口由三個廢液池(5. 1)、(5. 2)、(5. 3)，收集池(6)組成；磁鐵池(9)內放置磁鐵；液滴生成區(1)、液滴混合區(2)與液滴分裂區(3)依次排列為一次液滴生成-廢液去除単元，每個區之間依靠通道直接連接；溶液添加區(4)、液滴混合區(2)與液滴分裂區(3)依次排列為一次溶液添加-廢液去除単元，每個區之間依靠通道直接連接；所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺含一個液滴生成-廢液去除単元、 兩個溶液添加-廢液去除単元，每個單元之間依靠通道直接連接；該平臺由上下兩層PDMS通過等離子體封接，并將磁鐵放置在封接好的平臺磁鐵池(9) 內而成，其中上層PDMS含有通道、液池，下層PDMS基板用于封閉通道和液池。
2.按照權利要求1所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述液滴生成區(1)是由磁珠溶液入口(8.2)、樣本及結合緩沖液入口(8. 1)、油相入口 (7. 1)及相應的通道組成。
3.按照權利要求1所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述液滴分裂區(3)是由T型分裂通道(3. 1)、連接分裂通道出口的細通道組(3. 2)、磁鐵池 (9)及磁鐵池(9)內放置的磁鐵組成，其中細通道組由1-10根細通道組成。
4.按照權利要求3所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述T型分裂通道(3.1)的兩個出ロ到細通道組(3. 2)之間的長度不等。
5.按照權利要求1所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述溶液添加區(4)由連接油相進樣入口(7. 2)或(7. 3)的油相添加通道(4. 1)和連接水相入口(8. 3)或(8. 4)的水相添加通道(4. 2)組成。
6.按照權利要求5所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述油相添加通道(4. 1)為雙T型，分別向分裂通道(3. 1)的兩個出口端通道同時添加油相。
7.按照權利要求5所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述水相添加通道(4. 2)為T型。
8.按照權利要求1所述基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺，其特征在于 所述液滴混合區(2)由逶迤型的通道組成。
全文摘要
本發明的目的是提供一種適于高通量研究要求的基于連續液滴操控的微流控芯片核酸純化平臺；其特征在于該平臺是由一個液滴生成區1、二個溶液添加區4、三個液滴混合區2、三個液滴分裂區3及相應的進樣入口、出口6、磁鐵池9組成；其中進樣入口由四個水相進樣入口8.1、8.2、8.3、8.4，三個油相進樣入口7.1、7.2、7.3組成；出口由三個廢液池5.1、5.2、5.3，收集池6組成；磁鐵池9內放置磁鐵；該平臺由上下兩層(聚二甲基硅氧烷)PDMS通過等離子體封接，并將磁鐵放置在封接好的平臺磁鐵池9內而成，其中上層PDMS含有通道、液池，下層PDMS基板用于封閉通道和液池。
文檔編號C12N15/10GK102586226SQ20111000878
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者曾紹江, 林炳承, 潘小艷, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所