直立密穗基因提高氮肥利用效率的新應用的制作方法

專利名稱：直立密穗基因提高氮肥利用效率的新應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及已知基因的新功能和應用。具體地，本發明涉及直立密穗基因cbpl在提高農作物氮肥利用效率、提高農作物光合作用效率、以及控制株高耐倒伏方面的新功能和應用。更具體地，本發明涉及的直立密穗基因d印1來源于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等農作物。
背景技術：
氮是植物生長所必需的大量營養元素之一，占植物干重的1. 5% -2%以及植物總蛋白的16% (Frink et al. 1999)，是氨基酸、蛋白質、核酸、葉綠素、激素等的組成成分。氮肥是農業生產中需要量最大的化肥品種，它對提高作物產量，改善農產品的質量有重要作用。然而，一般來講，只有少量氮肥被植物所利用(Frink et al. 1999 ；Socolow 1999)，大部分的氮肥則被釋放到大氣或流失到水體中，對環境造成了越來越嚴重的影響，如何提高農作物氮肥利用效率，已成為農業生產面臨的一個亟待解決的嚴峻問題。自上世紀50-60年代，隨著人口的不斷增加，人們對農作物產量的需求不斷提高， 全球氮肥的施用量也隨之急劇增加了近10倍(UNEP 1999)。其后果是，過去幾十年所培育的主要農作物高產品種大多數都是氮和其他營養元素高依賴性的。例如，著名的“綠色革命”基因sdl 該基因編碼赤霉素合成途徑中的一個關鍵酶，在60年代到70年代曾創下了亞洲水稻產量的最高記錄。sdl最明顯的特征是植株半矮化，增強了抗倒伏性，同時也表現了對氮肥較高的依賴性。這意味著，應用sdl基因追求水稻高產是以不斷增施氮肥、增加水稻生產投入為條件，同時加重了環境污染。我國高產粳稻品種育種中一直以來沒用應用sdl。 這些品種對外施氮肥不敏感，也表現較高的氮肥利用效率，例如東北高產品種千重浪2號。目前，有關植物中氮的吸收和利用途徑的研究進展較快，例如，氮的轉運蛋白 (Crawford and Glass 1998 ；Forde 2000 ；Howitt and Udvardi 2000 ；Glass et al.2001 ； Williams and Miller 2001)，以及負責將氮轉變為氨基酸和其他化合物的酶類的研究 (Campbell 1988 ；Lam et al. 1996 ；Hirel and Lea2001)。近些年來，隨著植物基因組學和分子遺傳學的迅速發展，利用數量性狀位點(Quantitative trait locus, (QTL)分析這一有力的工具鑒定了多個氮代謝調控相關的遺傳因子。例如，在玉米中檢測到的在低氮脅迫和正常氮條件下的一些QTL位點(Agrama et al. 1999)；在水稻中，檢測到了幾個參與氮同化的酶(Yamaya et al. 2002 ；Obara et al. 2001，2004)、不同氮水平下植物劍葉中蛋白及氮含量、植物株高以及幼苗期耐低氮脅迫等相關的QTL位點(Fang and Wu 2001 ；Lian et al,2005)等。并且，在水稻和玉米中已獲得了幾個氮高效利用相關的候選基因(Gallais and Hirel，2004 ；Martin et al.，2006 ；Obara et al. 2001 ；Tabuchi et al. ,2005)。但是， 在不同的施氮條件下，氮吸收和利用調控的遺傳基礎還不得而知。水稻是重要的糧食作物，為世界上大約一半的人口提供糧食。在農業生產中，大量施用氮肥一直是水稻高產的重要措施之一。由于土壤蓄水系統中的揮發和反硝化作用， 與其他農作物相比，水稻的氮肥利用率比較低。我國的氮肥消費量占世界氮肥總消費量的30%,水稻生產所消耗的氮肥占世界水稻氮肥總消耗量的37%。然而，我國水稻的氮利用效率遠遠低于世界平均水平，大部分的氮分別以隊、N2O等形式排入環境而損失，造成大氣污染及江河湖泊的富營養化。然而，氮肥的使用量逐年增加并未帶來水稻產量的大幅提高，經濟效益和生態效益反而呈下降趨勢。那么，如何提高氮肥的利用效率來提高水稻的產量，實現我國水稻生產“少投入、多產出”可持續的發展模式？ 一個可行的途徑是，利用遺傳學和分子生物學方法從氮高效的水稻資源品種中分離并克隆氮高效相關基因，研究其提高氮利用效率的分子機制，通過改變這些關鍵基因的表達(或功能)進而使農作物在較低養分水平下保持較高的產量，是降低水稻生產投入成本、減少水稻生產對環境造成的污染、穩定提高水稻產量的有效手段。本發明人的研究將為包括水稻在內的主要農作物氮高效利用和高產分子育種提供基因資源。

發明內容
本發明涉及已知基因的新功能和應用。具體地，本發明涉及直立密穗基因d印1在提高農作物(例如，水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等)氮肥利用效率、提高光合作用效率和控制株高耐倒伏方面的新功能和應用。更具體地，本發明涉及的直立密穗基因cbpl來源于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等農作物。所述水稻直立密穗基因cbpl由本發明人最先發現并已申請專利，可以參見本發明人于2008年6月5日提交的發明專利申請No. 200810111529. 5，發明名稱為“直立密穗基因及其應用”，和于2009年6月5日提交的PCT/US09/46465，發明名稱為“Dense and Erect Panicle Gene and Uses Thereof，，。本發明在水稻氮高效利用的研究工作中發現了一個水稻氮高效利用和耐高肥抗倒伏的基因，將其命名為qNGR9，經進一步鑒定其為已知的直立密穗基因d印1 (SEQ ID NO 1，其編碼的d印1蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :2)，位于水稻第9號染色體上，編碼一個包含TNFR/NGFR結構域的未知功能蛋白。換言之，本發明人發現了該水稻直立密穗基因 cbpl基因具有提高氮肥利用效率、增強光合作用效率和控制株高抗倒伏方面的新功能，在此基礎上，本發明人完成了本發明。水稻直立密穗基因Cbpl對應的野生型DEPl基因的CDNA序列參見SEQ ID NO :3， 該基因編碼的野生型DEPl蛋白的氨基酸序列參見SEQ IDNO :4。本發明人在前期研究中發現有些東北高產粳稻品種，如千重浪2號是氮肥高效利用的品種，而且株高對外施氮肥不敏感；秈稻品種南京6號是株高和產量對外施氮肥很敏感的品種。本發明人將千重浪2號與南京6號雜交并自交六代獲得重組自交系(RIL)， 通過QTL分析，在水稻第9號染色體SSR標記RM3700和RM7048之間檢測到了一個氮高效利用相關的主效QTL，將其命名為qNGR9(a QTL for nitrogen growth responses inchromosome9)。利用圖位克隆的方法，將候選NGR9基因精細定位在141Λ的區間內(見圖 4)。通過測序比較分析，確定了 NGR9候選基因。該基因為已知的水稻高產基因cbpl (Dense and Erect Panicle 1)。通過對近等基因系NIL-NGR9和NIL_ngr9的比較分析研究，證明了 ngr9(亦即cbpl)基因在提高水稻氮肥利用效率、增強光合作用、控制株高和提高抗倒伏能力方面發揮了重要作用。
同時，本發明人從小麥、大麥、玉米、高粱中分別克隆到了同源的DEPl基因的cDNA 序列，并通過轉基因研究證明了它們具有與水稻NGR9/DEP1類似的控制株高和穗型的功能。另外，本發明人對NGR9/DEP1蛋白的亞細胞定位進行了研究，發現NGR9-GFP和ngr9_GFP 融合蛋白即能定位在細胞核中也能定位在細胞膜上。本發明人的研究將為包括水稻在內的主要農作物的氮肥高效利用提高、增強光合作用效率、半矮化高產育種提供新基因資源。因此，本發明提供下述第1方面.直立密穗基因的應用，其用于提高農作物的氮肥利用效率，提高光合作用效率，降低農作物的株高并增強抗倒伏性，以及改良農作物的穗型和提高產量。第2方面.根據第1方面所述的應用，其中所述直立密穗基因來源于水稻、小麥、 大麥、玉米或高粱。第3方面.根據第1方面所述的應用，其中所述直立密穗基因的核苷酸序列包括(I)SEQ ID NO :1,5,7,9,11 和 13 ；(2)與(1)中的任一種核苷酸序列具有至少70%、優選至少80%、更優選至少 85 %、更優選至少90 %、尤其是至少95 %或98 %同一性的核苷酸序列；(3)與(1)中的任一種核苷酸序列編碼相同氨基酸序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列；(4)編碼如下氨基酸序列之一的核苷酸序列=SEQ ID NO =2,6,8,10，12和14中任何一個所示的氨基酸序列，或者，由于一或多個(例如1-25個、1-20個，1-15個，1-10個， 1-5個，1-3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14中任何一個所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，與SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14 中任何一個所示的氨基酸序列具有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；(5) (1)-(4)中任何一個的核苷酸序列的活性片段；或(6)與(1)-(4)中任何一個的核苷酸序列互補的核苷酸序列。第4方面.根據第1方面所述的應用，其中所述農作物包括水稻、小麥、大麥、玉米或高粱。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中圖1 圖IA顯示千重浪2號是氮肥高效利用的東北高產粳稻品種，其株高和穗粒數對外施氮肥不敏感；圖IB顯示秈稻品種南京6號其株高和穗粒數對外施氮肥很敏感的品種。圖2 圖2A顯示一個氮利用效率和植物株高控制相關的主效QTL :qNGR9的克隆的技術路線；圖2B顯示氮利用和植物株高相關的主效QTL :qNGR9的QTL分析。圖3 顯示近基因系NIL_ngr9水稻植株表現半矮化。圖4 本發明人利用圖位克隆方法分離了 qNGR9，將qNGR9基因精細定位在141Λ的區間內。圖5 水稻重組自交系(RIL)中RIL22的株高對氮肥比較敏感。圖5A顯示在土壤中施加不同量的氮肥，RIL04的株高對外施氮肥不敏感；圖5B顯示隨著土壤中氮含量的升高，RIL22株高、分蘗數及穗粒數明顯增高。圖6 水稻NIL_ngr9幼苗的生長對氮肥不敏感。圖6A顯示，在不同氮濃度下 NIL-ngr9與NIL-NGR9的幼苗生長情況。圖6B顯示不同氮濃度下NIL_ngr9與NIL-NGR9的幼苗高度的統計結果。圖7 :ngr9能夠增加水稻莖桿細胞壁的厚度，增大莖桿機械強度和耐肥抗倒伏特性。a和c圖，分別是NIL-ngr9和NIL-NGR9的莖桿倒一節橫切掃描電鏡實驗；b和d圖分別為a和c圖的放大，矩形框所示厚壁細胞(sclerenchyma cells), Scale bar,100ym ;e 圖顯示莖桿抗折斷力大小的測定，表明NIL-ngr9比NIL-NGR9的抗折斷力更大；f圖顯示在田間施用不同濃度的氮肥(0,50,100，150，200，250/公頃)后，NIL_ngr9與NIL-NGR9生長情況的比較。圖8 :ngr9能夠抑制水稻莖桿細胞的分裂，促進細胞分化，導致水稻莖桿節間長度縮短，造成植株半矮化。NIL-ngr9與NIL-NGR9莖稈每節長度的比較以及莖桿倒一節伸長區縱切面的組織切片觀察。NIL-ngr9每莖節長度均變短。在縱軸方向上單位面積內NIL-ngr9 細胞數目明顯減少，細胞明顯增大。kale bar，25 μ m。圖9 :NGR9為已知基因DEP1。它編碼一個包含TNFR/NGFR結構域的未知功能蛋白。 NGR9/DEP1-GFP融合蛋白定位在細胞質、細胞膜和細胞核。圖A顯示ngr9/d印1是在NGR9/ DEPlmRNA的ATG下游586處形成了一個終止密碼子TAG，使DEPl蛋白翻譯提前終止。因此， ngr9/d印1缺失了 NGR9/DEPImRNA的ATG下游的625個堿基。圖B顯示NGR9/DEP1的蛋白結構示意圖。圖C顯示農桿菌侵染煙草細胞檢測NGR9/DEP1-GFP融合蛋白的亞細胞定位情況。圖10 過量表達ngr9/d印1轉基因水稻表現半矮化。a圖顯示營養生長時期(生長80天)過量表達ngr9/d印1的轉基因日本晴與非轉基因對照植物株高的比較。b圖顯示生殖生長時期(生長110天)過量表達ngr9/d印1的轉基因日本晴與對照的植物株高的比較。圖11 通過同源克隆分別從小麥和大麥中分離了 NGR9/DEP1的同源基因，TaDEPl 和HvDEPl，將其在水稻中過量表達也能夠降低植株株高，增加穗粒數和產量，表明它們具有與水稻ngr9/d印1相類似的功能。圖A顯示禾本科幾個主要作物中DEPl蛋白的相似性比較。水稻的DEPl和cbp 1，小麥的TaDEP 1，大麥HvDEPl，玉米ZmDEPl及高粱釙DEPl。圖B 將PActiiKTaDEPl轉入日本晴中，轉基因水稻表現半矮化和穗粒數增加的表型。圖12: :ngr9基因能夠提高水稻產量和氮肥利用效率。圖A所示NIL_ngr9水稻種植在不同施氮水平下，植株高度變化不明顯。圖B所示不同施氮處理對水稻葉片生長的影響。高氮處理能促進NIL-SDl水稻葉片的生長，但NIL-sdl水稻葉片生長對高氮處理表現為部分敏感性；高氮處理能促進NIL-NGR9水稻葉片的生長，而氮肥處理對NIL-ngr9水稻葉片生長影響不明顯。圖C所示在不同施氮條件下，ngr9/d印1基因均能提高水稻產量。達到相同的水稻產量，NIL-ngr9所需施氮肥量明顯少于NIL-NGR9，說明ngr9能提高植物的氮利用效率，是氮高效基因。實驗是在2010年海南水稻種植基地自然栽培條件下，對288株植物、三次重復進行數據統計，計算平均值。植物的種植密度為20Cmx20Cm。圖13 :ngr9/depl提高了植物的凈光合效率。近等基因系NIL_d印1和NIL-DEP1在抽穗時期，上午 09 00-11:00，設定不同的光強(250，500，750，1000，1500，2000，2500 μ mol photous m-kec-1)，田間分別測定在相應光強下的CO2的凈吸收量(μ mol m-2sec-l) 0測定結果表明，在不同的光強下，NIL-cbpl的光合效率明顯高于NIL-DEPl。圖 14 (A) depl 與 DEPl 的 cDNA 序列比較，DEPIcDNA 序列長 1281bp,而 depl 只有 5，端的588bp，缺失了 3，端的696bp ；和(B) depl與DEPl蛋白的氨基酸序列比較，DEPl蛋白含有4 個氨基酸，而cbpl蛋白只有N端的195個氨基酸，缺失了 C端的231個氨基酸。圖15 顯示分別轉入pUbi2300空載體對照及pUbi RNAi-TaDEPl的轉基因小麥 (濟麥21，JM21)穗型的比較。轉基因的濟麥21中TaDEPl基因的表達量下降后，穗型發生明顯改變，表現出穗長明顯變長，著粒密度變稀等表型。圖16 顯示轉過量表達cbpl基因的玉米在溫室中的生長表型。轉基因玉米的株高明顯降低、葉片顏色變為深綠色、葉片夾角變小。圖17 顯示不同高粱品種中的SbDEPl蛋白存在的氨基酸序列上的自然變異情況， ①-④示自然變異的位點。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。實施例1 水稻氮高效利用基因的發現和分離本發明人利用兩組不同氮處理(低氮處理和正常氮肥對照組)對2000余份水稻品種資源材料進行大田篩選，每小區種植4行，每行6株。分別在苗期、最高分蘗期、抽穗期等不同時期考察株高、分蘗數、穗數、葉綠素含量、光合速率等形態指標，以及在成熟期考察各農藝性狀和籽粒產量，獲得了一批氮肥高效利用的水稻材料，如千重浪2號。千重浪2號也是東北高產粳稻品種。研究表明，千重浪2號的株高對外施氮肥不敏感，低氮和高氮不同處理后其株高變化不明顯。另外發現，秈稻品種南京6號(NJ6)材料的株高和產量對外施氮肥很敏感。在低氮條件下，南京6號株高較矮、分蘗數偏少和穗粒數減少；而在高氮處理下，南京6號株高明顯增高、分蘗數和穗粒數顯著增多。將千重浪2號和秈稻南京6號分別在不同施氮量(0公斤/公頃，60公斤/公頃， 200公斤/公頃，300公斤/公頃)下，于灌漿期(生長110天)取具代表性的單株進行拍照。二者表現不同的氮敏感性。為了進一步挖掘水稻氮高效利用的遺傳基礎及關鍵調控基因，本發明人利用千重浪2號與南京6號(NJ 6)雜交后再自交6代構建了 208份重組自交系(RIL)。對208份水稻重組自交系材料設置4個不同氮處理，進行苗期和大田鑒定發現，編號為RIL04的重組自交系在不同的施氮量下，植物株高和分蘗數等農藝性狀沒有明顯差異，證明了重組自交系 RIL04是一個氮不敏感的材料。而編號為RIL22重組自交系材料隨著施氮量增加其株高、分蘗數和產量等農藝性狀均明顯提高，表明重組自交系RIL22是一個氮敏感的材料。(海南陵水，正常田間管理，種植密度為18CMX18CM，每個株系種植48株(圖1)。為了進一步認識氮肥利用效率控制的遺傳基礎，本發明利用千重浪2號與南京6 號(NJ 6)雜交后自交6代構建了重組自交系(RIL)和回交3代后構建了近等基因系(圖 2A)，通過QTL分析發現，在第9號染色體上的SSR標記RM3700和RM7048之間檢測一個與氮高效利用和植物株高相關的主效QTL，本發明人將其命名為qNGR9(圖2B)。在此基礎上， 本發明人利用RIL04材料與南京6號雜交所構建的BC2F2和BC3F2群體，通過QTL-圖位克隆方法將ngr9基因精細定位在141Λ的區間內(見圖4)。在下述實施例中，通過測序比較分析，確定了 ngr9候選基因實際上為已知的直立密穗基因cbpl (Dense and Erect Panicle 1)，該基因位于水稻第9號染色體上，編碼一個包含TNFR/NGFR結構域的未知功能蛋白。另外，本發明人經進一步的序列分析發現，氮高效利用基因ngr9的核苷酸序列與直立密穗基因cbpl的核苷酸序列完全相同。cbpl/DEPlcDNA序列比較結果顯示，DEPlcDNA 序列含有U81bp，而d印1只有5，端的58^ρ，缺失了 3，端的6%bp (圖14A) ；depl/DEPl 蛋白的序列比較結果顯示，DEPl蛋白含有似6個氨基酸，而cbpl蛋白只有N端的195個氨基酸，缺失了 C端的231個氨基酸(圖14B)。實施例2 水稻氮高效利用基因的功能驗證本領域技術人員應該理解，除非另外指明，本發明所用的試劑均為市售分析純級別的試劑，可以容易地從各試劑公司購得。參見圖5，將重組自交系(RIL)中含有ngr9/d印1的RIL04和含有NGR9/DEP1的 RIL22分別在不同施氮量(0公斤/公頃，60公斤/公頃，200公斤/公頃，300公斤/公頃) 下，于灌漿期(生長110天)取具代表性的單株進行拍照。二者表現不同的氮響應。RIL04 在不同的施氮量下株高、分蘗數和穗粒數等農藝性狀沒有明顯差別，表現為氮不敏感性。 RIL22在不同的施氮量下株高、分蘗數和穗粒數等農藝性狀存在明顯差別，隨著施氮量的增加植物生長加快、分蘗數和穗粒數增加，表現為氮敏感性。(海南陵水，正常田間管理，種植密度為18CMX 18CM，每個株系種植48株)。參見圖6，將NIL-ngr9和NIL-NGR9于37°C催芽后，放入水中培養4天，再放入 1/2 營養液(Na2SO4 · IOH20,88. 022mg/L ；KH2PO4, 24. 8mg/L ；K2SO4, 31. 859mg/L ；MgSO4. 7H20, 134. 82mg/L ；CaCl2. 2H20,53. 702mg/L ；Fe-EDTA,7. 346mg/L ；Na2Si03H20, 465. 139mg/ L ；NH4NO3, 160mg/L ；H2BO3, 2. 86ug/L ；CuSO4 · 5H20, 0. 08ug/L ；ZnSO4 · 7H20, 0. 22ug/L ； MnCl2 · 4H20,1. 81ug/L ；H2MoO4 · H20,0. 09ug/L ；用 MES 調 pH 至 5. 6)中培養 3 天，再更換營養液繼續培養3天，然后進行不同氮濃度處理(0，l，2，4，6mM)，每個材料每個氮濃度各取長勢一致的幼苗9株，7天更換一次培養液，每兩天調一次pH值(調pH為5. 6)，培養9天后拍照(圖6A)，并測量統計幼苗的苗高(圖6B)。(所用的培養條件為1 光/9h暗，恒溫 22°C，光強 65 μ M HT2S力參見圖7，剝取倒一節莖稈，用鋒利的刀片橫切成2_3mm的薄片。以上材料均放在戊二醛固定液里(濃度2.5%，用0. lmol/L磷酸鹽緩沖液pH 7. 4配制，其中戊二醛購自北京化工廠)抽取真空30分鐘，4°C下固定M小時以上，30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇依次梯度脫水15-30分鐘。100%乙酸異戊酯(購自北京化工廠)，置換30分鐘。可在4°C冰箱過夜。置換好的材料放在HCP-2型臨界點干燥儀(日本Hitachi公司)上通過液態⑶2臨界點干燥法干燥，干燥后的材料用導電膠(日本Hitachi公司)固定在銅臺上， 在日立E-IOlOion sputter上噴金。用日立S-M60型掃描電子顯微鏡對樣品進行電鏡觀察，圖象存儲成數碼文件，供分析用。kale bar，100ym(圖a，b，c, d)。抗折斷力的大小測定用RX數顯推拉計測定NIL-NGR9和NIL-ngr9材料各10個主莖的抗折斷力，取平均值(圖e)。將近等基因系NIL-NGR9和NIL_ngr9材料，種植在田間施用不同濃度的氮肥(0， 50，100，150，200，250/公頃)的小區(長=3. 5M，寬=0. 9M)中，種植密度為 18CMX18CM, 觀察到NIL-ngr9表現明顯的耐倒伏和耐高肥的特性(圖f)。參見圖8，分別測量NIL-ngr9與NIL-NGR9的各莖節長度，表明NIL_ngr9莖桿每節均縮短。倒一節莖中間部位縱切樹脂切片觀察。方法步驟為1、灌漿期取材料于FAA (甲醛乙酸70%乙醇=1:1: 18 (V/V)固定液，購自北京化工廠)中固定；2、樹脂切片材料制作使用試劑盒LEICA Historesin embedding kit (Heidelberg, Germany)，操作步驟參考此試劑盒內的說明；1)梯度脫水40%，60%，80%，95%，95%乙醇，各30111士11 ；2)滲透95%乙醇樹脂(V/V) = 2 1中(所述樹脂由上述試劑盒中提供)，真空抽氣Ihr后，放于4°過夜；然后95%乙醇樹脂(V/V) =1 2中，至少!3hr ；然后放于 100%樹脂中，4°過夜；換新的100%樹脂滲透至少Ihr ；3、包埋用16 1的100 %樹脂(Historesin，試劑盒中提供)和硬化劑 (Hardener,試劑盒中提供)包埋，用 Parafilm 封口 膜(Pechiney PlasticParkaging, Chicago, USA)封蓋；4、待包埋劑充分凝固后(1-2天)，用石蠟切片機(LEICA，RM2265)進行切片， 8-10um 厚。5、TB0(甲苯胺蘭=T0Iuidine Blue 0)染色幾分鐘(具體是多少分鐘？)后，顯微鏡下觀察(LEICA，DM500B)。現在參見圖9，公共的數據庫 KOME(http://cdna01. dna. affrc. go. jp/cDNA/)、 TIGR(http://www. tigr. org/)及 RAP-DB (http://rapdb. dna. affrc. go. jp/)中搜索 DEPl 基因(即水稻的DEPl基因)的注釋，推測該基因是一未知功能的基因，在結構上具有5個外顯子及4個內含子，編碼區長度為1281bp (SEQ ID NO 1)，編碼似6個氨基酸的多肽(SEQ ID NO 2) ,DEPl具有TNFR/NGFR結構域。DEPlmRNA的ATG下游586處形成了一個終止密碼子TAG，使DEPl蛋白翻譯提前終止，突變的cbpl蛋白的氨基酸序列只有196個(圖9A和 9B)。農桿菌侵染煙草細胞瞬時表達后觀察NGR9/DEP1-GFP融合蛋白的亞細胞定位。方法為1)將活化過夜的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (購自 Biovector Science Lab公司，中國)轉接到50ml液體LB (含有50ug/ml卡那霉素和25ug/ ml利福平)中，28 °C，220轉搖菌過夜；2)將菌液于室溫下5000g離心沉淀菌體，并用注射緩沖液(IOmMMgCl2, IOmM MES-K0H, pH 5. 7，150-200 μ M Acetosyringone (乙酰丁香酮，購自Sigma)的注射緩沖液
重懸菌體；3)用注射緩沖液稀釋菌液，使菌液0D600分別為0. 5、1、1. 5 ；4)室溫放置2-4小時；5)將上述菌液混合，用l_2ml的注射器將菌液注射到煙草葉片的下表面，2_5天后取葉片在熒光顯微鏡下觀察。
熒光顯微鏡觀察結果表明，NGR9-GFP融合蛋白既有細胞膜定位，也存在細胞核定位。參見圖10，按常規分子生物學和遺傳學操作方法構建pACtin:ngr9載體，農桿菌介導法轉化日本晴，過量表達ngr9的日本晴植物表現半矮化。對照是日本晴。a圖顯示營養生長時期(生長80天)過量表達ngr9的轉基因日本晴與對照植物株高的比較。b圖顯示生殖生長時期(生長110天)過量表達ngr9的轉基因日本晴與對照植物株高的比較。結果說明，過量表達ngr9能夠明顯降低水稻的株高。參見圖12C，實驗是在2010年海南水稻種植基地自然栽培條件下，對288株植物、 三次重復進行10個不同施氮量(0-300公斤/公頃氮肥)的水稻產量統計，計算平均值。植物的種植密度為20Cmx20Cm。結果表明，達到相同的水稻產量，NIL_ngr9所需氮肥明顯少于 NIL-NGR9，這說明ngr9基因能提高植物的氮利用效率，是一種氮高效基因。參見圖13，插秧70天后，材料處于約二次枝梗期，上午10:00-12:00測量 NIL-ngr9 和 NIL-NGR9 的光合效率。使用光合儀 Ll-6400 (LI-COMnc.，Lincolin，NE. USA)， 每個材料每次測定時同時夾取兩個不同單株的倒二葉中間的部位，兩次重復，設定不同的光強(250, 500, 750,1000,1500,1800, 2000, 2500, 2800 μ mol photous HT2SecT1)，分別測定在相應光強下的(X)2的凈吸收量(μ mol m^sec"1)。結果說明，NIL_ngr9較NIL-NGR9表現更強的光合效率。實施例3 同源基因克隆參見圖11，以水稻cbpl的序列為探針，在NCBI網站(www.ncbi.nih.nlm.gov) 提供的數據庫里，通過 Basic logical alignmengt search tool (BLAST)比對，獲得了小麥、大麥、玉米及高粱的同源的cDNA序列，分別為小麥TaDEPl (SEQ ID N0:5)、大麥 HvDEPl (SEQ ID NO 7)、玉米 ZmDEPl-I (SEQ ID NO :9)、玉米 ZmDEPl-2 (SEQ ID NO :11)和高粱SbDEPl (SEQ ID NO :13)，它們編碼的蛋白的同源性分別為TaDEPl (SEQ ID NO 6) 同水稻DEPl (SEQ ID NO 4)相似性為49. 42%,同水稻d印1 (SEQ ID NO 2)的相似性為 44. 41% ；HvDEPl (SEQID NO 8)同水稻DEPl的相似性為50. 00%，同水稻d印1的相似性為 43. 73% ；SbDEPl (SEQ ID NO 14)同水稻DEPl相似性為51. 99%，同水稻d印1的相似性為 33. 83%, ZmDEPl-I (SEQ ID NO 10)同水稻DEPl的相似性為43. 34%，同水稻depl的相似性為22. 35%, ZmDEPl-2(SEQID NO :12)同水稻DEPl的相似性為36. 07%，同水稻depl的相似性為31. 13% (圖11A)。另外，高粱的SbDEPl還存在多種氨基酸序列的自然變異，參見圖17，四種不同高粱品種中SbDEPl蛋白序列中，共有四個氨基酸存在自然變異。通過同源克隆方法分別從小麥和大麥中分離了 NGR9/DEP1的同源基因TaDEPl和 HvDEPl，構建pActin = TaDEPl和pActin:HvDEPl載體，轉化日本晴，二者均能降低株高并影響穗型(圖IlB示轉TaDEPl基因的日本晴表型)。實施例4 直立密穗基因cbpl的應用通過同源克隆方法從小麥中分離了 NGR9/DEP1的同源基因TaDEPl，與水稻DEPl 基因序列比較發現，TaDEPl基因的C-端與突變的cbpl基因很類似，也有序列缺失。為檢驗是否這種缺失也同樣具有depl基因相類似的功能，本發明人構建了 pActiiKTaDEPl載體，轉化日本晴，轉基因植株表現與轉化水稻cbpl基因(圖10示轉cbpl基因的日本晴表型)類似的表型植物為半矮化、穗型緊湊、穗粒數增加等(圖IlB示轉TaDEPl基因的日本晴表型)。為了進一步分析TaDEPl基因是否能夠調控小麥穗型(產量)，本發明人構建 pUbi :RNAi-TaDEPl載體，通過農感菌介導的方法轉化小麥濟麥21 (JM21)，獲得了轉基因小麥。轉基因小麥中TaDEPl基因表達下降后，小麥的穗型發生改變，表現出穗變長，粒密度變稀等表型(圖15)。同時，構建pW3i:d印1載體，轉化小麥，轉基因植株也表現出半矮化表型。這些實驗證明了小麥TaDEPl基因在調控小麥生長發育和穗型中也起著重要作用。因此，禾谷類DEPl同源基因間序列和功能保守，在調控植株高度和穗型(著粒密度和穗粒數等)方面起著關鍵作用。水稻直立密穗基因cbpl轉化水稻和小麥都能導致植物半矮化表型和提高植株的耐倒伏性。同時，本發明人將構建的pW3i:d印1載體，轉化玉米，獲得了過量表達d印1基因的轉基因玉米。轉基因玉米也同樣表現出半矮化表型、葉片變為深綠色等(圖16)。利用光合儀 Ll-6400(LI-C0RInc.，Lincolin, NE. USA)，在的光強 1500 μ mo 1 photous HT2SecT1 下， 測定CO2的凈吸收量(μπιο n^sec—1)，結果表明，轉d印1基因的玉米葉片的光和效率比對照玉米提高25.6%。而且，本發明人同時發現，轉基因玉米葉片夾角變小。根據本發明人的實驗結果，直立密穗基因的轉基因玉米葉角變小、半矮化表型和高光效的特性說明，直立密穗基因可以用來提高玉米的種植密度和增加群體光合效率，進而提高產量。鑒于水稻直立密穗基因cbpl以及實施例3的同源DEPl基因能夠提高農作物的氮肥利用效率，降低農作物的株高并增強抗倒伏性，改良農作物穗型和提高葉片光合效率等方面的功能，本發明人預測該直立密穗基因可以用于提高作物氮肥利用效率和產量等方面。例如，可以通過轉基因過量表達該直立密穗基因等技術手段，實現提高作物氮肥利用效率、光合效率、半矮化育種等目的。應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述， 但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由后附的權利要求所定義的本發明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。參考文獻Forde BG (2000). Nitrate transporters in plants-structure, function andregulation. Biochim Biophys Acta 1465 :219-23Gallais A and Hirel B. (2004). An approach to the genetics of nitrogen useefficiency in maize. J Exp Bot 55 :295-306Hirel B et al(2001). Towards a better understanding of the genetic andphysiological basis for nitrogen use efficiency in maize. Plant Physioll25 1258-1270Yamaya T et al. (2002)Genetic manipulation and quantitative-trait locimapping for nitrogen recycling in rice. J Exp Bot 53 :917-92權利要求
1.直立密穗基因的應用，其用于提高農作物的氮肥利用效率，提高光合作用效率，降低農作物株高增強抗倒伏性，以及提高農作物的產量。
2.權利要求1所述的應用，其中所述直立密穗基因來源于水稻、小麥、大麥、玉米或高ο
3.權利要求1所述的應用，其中所述直立密穗基因的核苷酸序列包括(1)SEQID NO :1,5,7,9,11 和 13 ；(2)與(1)中的任一種核苷酸序列具有至少70%、優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的核苷酸序列；(3)與(1)中的任一種核苷酸序列編碼相同氨基酸序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列；(4)編碼如下氨基酸序列之一的核苷酸序列=SEQID NO :2,6,8,10，12和14中任何一個所示的氨基酸序列，或者，由于一或多個(例如1-25個、1-20個，1-15個，1-10個，1-5個， 1-3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14中任何一個所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，與SEQ ID N0:2，6，8，10，12和14中任何一個所示的氨基酸序列具有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、尤其是至少95%或 98%同一性的氨基酸序列；(5)(1)-(4)中任何一個的核苷酸序列的活性片段；(6)與(1)-(4)中任何一個的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
4.權利要求1所述的應用，其中所述農作物包括水稻、小麥、大麥、玉米或高粱。
全文摘要
本發明涉及直立密穗基因dep1在提高農作物(例如，水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等)氮肥利用效率、提高光合作用效率和控制株高抗倒伏方面的新功能和應用。更具體地，本發明涉及的直立密穗基因dep1來源于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等農作物。
文檔編號C12N15/29GK102174527SQ201110029759
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者傅向東, 劉學英, 吳昆 , 張成偉, 王栓鎖, 錢前 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所