專利名稱：油菜呼吸代謝相關基因BnAOX1及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，更具體涉及一種油菜呼吸代謝相關酶基因BnAOXl,同時還涉及一種油菜呼吸代謝相關酶基因BnAOXl在提高油料作物的產量和含油量中的應用。
背景技術：
油菜籽是世界上食用植物油和飼用蛋白質的最主要來源之一，也是歐洲生物柴油最重要的原料。油菜是我國種植面積最大的油料作物，也是繼水稻、小麥、玉米和大豆之后我國的第五大農作物。菜籽油是我國居民的主要食用油，占國產植物油消費總量的40%以上。我國作為世界第一植物油消費大國，植物油的自給率不足40%。為解決這些需求矛盾，除擴大種植面積外，提高油菜含油量和產量是提高其單位面積產油量的最有效途徑。高產油量能夠顯著提高油菜生產效益，提高油菜籽的總體利潤。植物線粒體電子傳遞鏈有多條途徑存在，其中主要有細胞色素主路和抗氰交替途徑支路兩條途徑。抗氰呼吸(交替途徑)指的是對氰化物不敏感的一條呼吸途徑。交替氧化酶(alter native oxidase, A0X)是植物線粒體呼吸鏈中抗氰呼吸途徑(cyanide-resistant respiration pathway)的末端氧化酶，它廣泛存在于高等植物及部分真菌和藻類中。交替氧化酶作為交替途徑的末端氧化酶，其內源底物包括還原泛醌和02。交替途徑的呼吸電子流從主路(細胞色素途徑)泛醌處分支出來，繞過復合物III和IV兩個ATP形成位點，直接由AOX催化分子氧的4個電子還原成水，而未用來合成ATP的能量則以熱的形式被散失掉。交替氧化酶是一種雙鐵羧基蛋白(di-iron carboxylate protein),它不僅具有其它雙鐵羧基蛋白共有的結構特點以及去除分子氧的功能，更重要的是它還可以通過改變自身結構等方式來主動調節抗氰呼吸途徑的運行程度，進而調節細胞多方面的代謝和功能，以適應環境條件的改變，增強植物適應各種逆境的能力，調節植物生長速率，并與細胞凋亡和光合作用相關。AOX活性調控受多種因素影響，環境脅迫、植物受傷、凍害、干旱、滲透壓及病菌等都可誘導AOX表達。水楊酸(SA)、過氧化氫、乙烯和主呼吸鏈抑制劑也同樣能誘導AOX在植物中的表達。抗氰呼吸活性和AOX表達在產熱植物的佛焰花序中較高。在非產熱植物中，AOX表達水平與發育狀態有關，如在衰老和果實成熟過程中都有AOX的表達。AOX調節能量代謝，當能量代謝飽和時，AOX途徑以散熱方式釋放能量，維持電子傳遞和TCA。LamberS(1982)提出的能量溢滿理論認為當主呼吸鏈活性受到抑制時，或細胞還原力偏高時，電子通過AOX傳遞可使TCA循環和糖酵解繼續進行。AOX活性能為TCA循環底物丙酮酸激活，說明TCA循環的底物過高時可誘導AOX途徑轉移部分電子。環境變化導致AOX表達差異，不僅改變線粒體功能，也影響線粒體外細胞功能。氧脅迫誘導AOX表達并抗氧化，當細胞色素途徑受抑時，主呼吸鏈產生活性氧(ROS)，AOX氧化可使ROS下降。在 轉基因煙草中AOX的超量表達時ROS水平下降，反之ROS水平則提高。Hansen等(2002)測量熱呼吸發現環境變化能改變植物生長率，AOX對植物生長動態起平衡作用。產熱植物通過AOX釋放的熱量可使花粉散發芳香氣味吸引蟲媒(Meeuse等，1975)。非產熱植物組織中AOX的表達與此同產熱無關(Borecky and Vercesi，2005)。AOX可有效調控呼吸率保持細胞能量恒定以保證植物在環境變化時正常生長(Hansen等，2002)。AOX不僅使擬南芥在低溫下發芽，而且AOX能防止植物組織在逆境中產生過氧化物而廣泛影響細胞功能(Fiorani等，2005)。AOX在細胞質和一些碳代謝途徑中發揮重要作用(Umbach等，2005)。各種環境脅迫都能改變植物抗氰途徑的運行，但這些研究還很膚淺，其運行的信號調節機制和生理意義還不清楚
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl，本發明提供了這個基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，也包括與SEQID NO 1所示的DNA序列至少有70%同源性的本物種及其它物種中的基因序列。該基因屬于植物交替氧化酶家族中的一員，它通過調節抗氰呼吸途徑的運行程度，來調節細胞多方面的代謝和功能，以適應環境條件的改變，調節植物生長速率，并與細胞凋亡和光合作用相關。在擬南芥中該基因被抑制可導致部分基因表達量發生改變，但未見對其表型的影響報道。本發明的另一個目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl在提高油料植物含油量中的應用。將此基因應用于油料作物育種，可以提高油料作物種子的含油量，最大限度的提高油料作物的產油量。本發明的再一個目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl在提高擬南芥植物種子千粒重中的應用。通過模式植物擬南芥證實BnAOXl基因不但可調控種子含油量的變化，同時還增加了千粒重。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術措施本發明申請人通過分析油菜含油量差異顯著的兩親本及F2代分離群體混合樣本的基因表達差異，篩選出一類在親本及F2代極端分離材料中同時存在表達差異的基因，其中包括BnAOXl基因。為了驗證該基因是否影響種子含油量或種子其它性狀，申請人通過基因全長的克隆，表達載體的構建以及模式植物擬南芥的轉化。該油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl在提高油料植物含油量和千粒重中應用。一、基因的來源一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl的制備方法，其步驟是以高低含油量品系zy036與y817(含油量分別為51%和35% )雜交構建F2代群體共得到169個后代單株為材料；分別收集各F2單株開花后25天左右的角果(帶角果皮和胚珠);各單株成熟種子進行含油量檢測，將含油量檢測大于47%和小于38. 5%的單株的角果分別取等量200mg混合組成兩極端含油量混合樣本分別編號H(含油量大于47%的有11株)和L(含油量小于38. 5%的有11株)，兩個混樣平均含油量相差11. 1%。分析兩親本及兩混樣表達基因，找出親本與F2代混樣表達量同時表現差異的基因，BnAOXl基因即源于此。本研究中所用的親本材料zy036和Y817，均由中國農科院油料所生物技術育種課題組技術人員在王漢中研究員帶領下育成。zy036品系是由中雙4號、中雙7號、中雙9號、華雙3號、油研9號(中雙4號、中雙7號、中雙9號、華雙3號、油研9號)構建輪回選擇群體，輪回選擇兩代后選優良單株進行小孢子培養輪回選擇第三代，最終經高油定向選擇得到。Y817是雜交品種中油雜I號的保持系(中油雜一號制種技術研究與應用，農村經濟與科技，2001年第10期)。二、基因的全長克隆通過篩選基因表達差異，發現BnAOXl基因在油菜高油親本及高油F2混合群體中表達量高于低油親本及低油F2混合群體。因此申請人根據arabidopsis網站擬南芥AOXl基因的序列和申請人自己的測序數據庫，尋找與之同源的油菜基因組序列拼接，并設計基因編碼區序列的兩側引物。以親本zy036cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得BnAOXl基因的編碼區序列，還包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體等位基因或衍生物。一種分離的蛋白質，其堿基序列為SEQ IDNO :I所不的核昔酸序列。一種分尚的蛋白質，其蛋白質序列為SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。同時，利用arabidopsis網站上的基因序列設計引物擴增擬南芥中同源基因AtAOXl序列。利用擬南芥作為受體的轉基因結果證實，此類基因的過量表達可以提高擬南芥種子的含油量，同時也增加了種子的粒重。因此，此類基因在油菜及其他油料作物的產油量育種中具有很好的應用前景。三、轉基因載體的構建、轉化及驗證通過上述方法獲得了油菜BnAOXl基因，采用一種提高油菜基因表達活性的轉基因擬南芥，其特征在于與受體對照(非轉基因植株)相比，轉基因植物表現為基因表達量增力口，其具體措施是一種PCR8/GW/T0P0質粒(invitrogen公司購買)，可以與表達載體質粒重組構建基因表達質粒的實驗方法(invitrogen公司購買)。一種質粒表達載體PearleygatelOO (invitrogen公司購買),它含有35S啟動子和翻譯控制件。一種可在植物中表達的宿主菌(如GV3101，LBA4404等)，本發明優選的是農桿菌(GV3101, invitrogen 公司購買)。一種能夠過量表達某基因的轉基因擬南芥，其特征在于擬南芥中所轉基因表達量增加。其應用過程包括下列步驟I)將克隆得到的油菜基因與PCR8/GW/T0P0質粒連接，利用PCR8/GW/T0P0質粒與質粒表達載體PearleygatelOO可以體外重組的特性將油菜基因轉移至表達載體；2)將步驟I)中制備的表達載體轉入根癌農桿菌GV3101，再導入擬南芥植株中。3)轉基因陽性植株PCR鑒定，除草劑(Bar，草苷膦)篩選后正常條件生長并收獲種子測定含油量。結果表明，轉基因擬南芥種子的含油量與對照擬南芥相比有較大幅度的提聞。本發明中所用的術語“轉基因植物”是指含有導入的基因并能夠穩定地增強或抑制所導入的基因表達并產生具有特定的生物學性狀的植物。克隆本發明中所述的油菜基因的方法是本領域中所常采用的方法如利用CTAB法提取植物葉片DNA，提取mRNA的方法也有多種成熟的技術，如米用 T RIzol Reagent, Invetrogen 公司或 Total RNA extraction,qiagen公司，可從商業途徑獲得。構建cDNA文庫也是常用的分子生物學技術。構建本發明中所述的載體和將載體轉染入植株也是本領域中所常采用的方法。其中所涉及的質粒(入門載體PCR8/GW/T0P0，質粒表達載體PearleygatelOO)，轉染用媒體(如根癌農桿菌GV3101和所用試劑(蔗糖等)可從商業途徑獲得。聚丙烯酰胺凝膠電泳是分子標記的多態性分析的最常用手段，所有試劑如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等均可從商業途徑獲得。轉基因擬南芥分析通過在野生擬南芥中過量表達BnAOXl、AtAOXl基因，轉基因擬南芥整 體植株表型與野生型沒有明顯區別。收獲種子后發現，轉AOXl基因的植株種子明顯大于野生型對照。通過脈沖式核磁共振儀測定含油量，結果表明轉基因植株與對照相比，含油量均有不同程度的提高，轉基因擬南芥種子含油量與野生型擬南芥相比有明顯提高，最聞幅度可達20%以上。而千粒重也有所增加，增加幅度最聞達25% (見表I)。上述結果表明，不僅油菜AOXl基因可以提高種子含油量，同時還可以增加粒重，而且與此類油菜基因序列有70%同源性的其它物種基因同樣可以提高含油量。本發明的優點是本發明中油菜BnAOXl基因為首次報導與種子含油量、粒重相關。交替氧化酶(AOXl)具有其它雙鐵羧基蛋白共有的結構特點以及去除分子氧的功能，屬于植物交替氧化酶家族中的一員。它通過調節抗氰呼吸途徑的運行程度，來調節細胞多方面的代謝和功能，以適應環境條件的改變，增強植物適應各種逆境的能力，調節植物生長速率，并與細胞凋亡和光合作用相關。在擬南芥中該基因被抑制可導致部分基因表達量發生改變，但未見對其表型的影響報道。通過在擬南芥中的轉基因研究證實，此類基因確實可以提高種子含油量，同時還可以增加種子粒重。此類基因可以應用于油菜高含油量育種，通過使用組成型啟動子35S在油菜品種中超量表達此類基因，得到含油量提高且千粒重增加的油菜新品種，加快油菜含油量育種的步伐。同時，將其擴展到其他油料作物如大豆、花生、芝麻等的育種應用中，最大限度的提高油料作物的產油量。
圖I為一種油采呼吸代謝相關基因BnAOXl的擬南介表達載體不意2為一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl的擬南芥Tl代的轉基因鑒定結果。圖3為一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl的野生型對照種子的大小比較示意圖。其中圖3A為野生對照，圖3B為轉基因株系的種子。
具體實施例方式實施例I :BnA0Xl、AtAOXlcDNA 編碼區序列一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl的制備方法，其步驟是在NCBI數據庫中檢索已發表的擬南芥基因序列，BLAST NCBI網站的油菜EST序列，并結合擬南芥序列設計基因編碼序列的兩側引物(BnAOXlF :正向引物[5，-atgatgatgagtcgctacgg_3，],反向引物:[5，_tcaatgatccaattggag_3，]用來從油菜 15天角果cDNA中擴增對應序列。擬南芥中的擴增引物分別為AtA0Xl (arabidopsis網站)正向引物[5，-atgatgatgagtcgtcgcta-3，],反向引物[5，-tcaatgatatccaatgggagc-3，],直接在擬南芥10天角果cDNA中擴增。I、提取油菜、擬南芥mRNA。RNA的提取(TRIZ0L TM Kit提取RNA)，液氮研磨IOOmg材料。A.加 lmlTRIZOL，室溫(20_25°C，以下相同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。
C. 12000g，15min，4 °C，取上清至新管中，加入500uI異丙醇，混勻后室溫放置15min。D. 12000g, 15min, 4°C,去上清,加入 lml70*% (體積比)乙醇。E. 7500g，7min，4°C，去上清，空氣干燥。F. DEPC-H2O 溶解。2、cDNA 第一鏈的反轉錄米用 RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesisKit (Fermentas),操作參照所用試劑盒說明進行。3、以cDNA為模板進行PCR擴增，得到了 BnAOXl及AtAOXl基因序列如一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOXl，一種分離的蛋白質，其堿基序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。一種分尚的蛋白質，其蛋白質序列為SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列所不以及NCBI網站數據庫中已發表的擬南芥基因序列。實施例2 :轉基因表達載體的構建及擬南芥的轉化將PCR擴增得到的基因序列與TOPO A門載體(invitrogen公司)連接后，轉化到感受態細胞DH5 a (invitrogen公司)中，壯觀酶素篩選，載體引物(T7引物，TAATACGACTCACTATAGGG)與基因引物(基因上游引物，引物序列見實施例I)擴增鑒定正向插入克隆，質粒經小量制備后與PearleygatelOO (invitrogen公司)進行重組,并轉化到感受態細胞DH5ci中，卡那霉素篩選，其插入片段經載體引物(35S啟動子序列引物，CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA)與基因引物(基因下游引物，引物序列見實施例1)PCR鑒定，示意圖見圖I。擬南芥的轉化過程試劑配制滲透培養基(IL)l/2xMurashige-Skoog ；5% (質量比)蔗糖；0. 5 克 MES ;用 KOH調至pH5. 7 ;再加10ul lmg/ml的6_BA(6_芐氨基嘌呤)母液；200微升Silwet L-77。轉化步驟(I)制備好已轉化了相應質粒的農桿菌(GV3101，市場可購買)菌液10ml，在轉化前一天晚上，轉入大瓶培養過夜，第二天取出使用時農桿菌液0. D600當在I. 2到I. 6之間。(2)室溫 5OOOrpm 離心 15 分鐘。(3)棄上清，將農桿菌沉淀懸浮于相應體積的滲透培養基里，使0. D600在0. 8左右。(4)將整個植株直接浸泡至農桿菌懸浮液30s。(5)避光培養過夜，然后正常培養至結子，收獲種子作下一步篩選鑒定。實施例3 :轉基因擬南芥的篩選和驗證轉化子的篩選將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和花寶二號(商業購買)營養液的人工土中，并用保鮮膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。人工培養室條件相對濕度80%，恒溫20-240C，光照強度80_200umol/M2/S，光照周期為8h黑暗、16h光照培養。一周左右，噴除草劑(草苷膦)篩選陽性植株。PCR 鑒定 (I)用于PCR的轉化植株總DNA的提取
A. 70% (體積比)乙醇擦洗葉片，稱取大約IOOmgB.加入 600ul 抽提緩沖液(0. 2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA，0. 5% (質量比)SDS，pH 7. 5)，室溫快速研磨。C. I. 5ml Ependorff 管中潤旋混勻 5_10s。D. 12000rpm, 25min,室溫。取上清,加等體積異丙醇，-20攝氏度沉淀過夜。E. 12000rpm, 15min,室溫。加入70% (體積比)乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F. 12000rpm, 15min,室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發干凈。G.加無菌水IOOul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計測定或電泳估測其濃度。H.以總DNA為模板，進行PCR。(2) PCR 程序PCR反應混合液的配比同質粒PCR鑒定，依據植物表達載體中35S啟動子序列和 BnAOXKAtAOXl 基因下游引物 5’ -tcaatgatccaattggag-3’，5’ -tcaatgatatccaatgggagc-3’，反應的時間和溫度如下94°C 3min, 94°C 45s, 59°C 45s,72°C 2min 30s, 30cycles, 72°C 5min。檢測結果顯示，大多數轉化植株均能夠擴增出預期大小的電泳條帶，而陰性對照則沒有，表明已經獲得多株轉基因擬南芥株系。實施例4.:轉基因擬南芥種子含油量及千粒重檢測轉基因純合株系生長于21_23°C溫室中，收獲種子后測其含油量及千粒重的變化(圖3)。結果顯示，轉基因擬南芥種子含油量與野生型擬南芥相比有明顯提高，最高幅度可達20%以上。而千粒重也有所增加，增加幅度最高達25%。表I過量表達BnAOXl、AtAOXl基因的擬南芥含油量及千粒重測定結果
權利要求
1.一種分離的基因序列，其堿基序列為SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質序列，其序列為SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
3.權利要求I或2所述的ー種分離的蛋白質在提高擬南芥植物種子千粒重中的應用。
4.權利要求I或2所述的ー種分離的蛋白質 在提高擬南芥植物種子含油量中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜呼吸代謝相關基因BnAOX1及應用，通過篩選基因表達差異，發現BnAOX1基因在油菜高油親本及高油F2混合群體中表達量高于低油親本及低油F2混合群體。通過arabidopsis網站擬南芥AOX1基因的序列和測序數據庫，尋找與之同源的油菜基因組序列拼接，并設計基因編碼區序列的兩側引物。以親本zy036cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得BnAOX1基因的編碼區序列，還包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體等位基因或衍生物。利用擬南芥作為受體的轉基因結果證實，此類基因的過量表達可以提高擬南芥種子的含油量，同時也增加了種子的粒重。因此，此類基因在油菜及其他油料作物的產油量育種中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N9/02GK102618560SQ201110031200
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者劉貴華, 劉靜, 華瑋, 王新發, 王漢中, 胡志勇, 詹高淼 申請人:中國農業科學院油料作物研究所