專利名稱：油菜BnRabGDI3基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和生物技術領域。具體涉及一種控制油菜和擬南芥花粉育性的RabGDI3基因，同時還涉及一種控制植物花粉育性的RabGDI3基因的制備方法，還涉及一種控制植物花粉育性的RabGDI3基因的用途。本發明還涉及含有該基因或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該基因在油菜基因工程中的應用。
背景技術：
Rab蛋白是小分子GTP(鳥苷三磷酸)結合蛋白家族中最大的亞家族，作為囊泡運輸的分子開關起重要調控作用(吳文林，吳穗潔.Rab蛋白的結構、功能與研究展望.臺灣海峽，2006，25 (4) :599-605)。Rab蛋白作用循環是Rab-GDP與Rab-GTP兩種不同結合狀態的轉化過程。其中存在于細胞質中的Rab-GDP為無活性狀態，而與膜結合的Rab-GTP為有活性的狀態并參與調控囊泡的運輸(Vanessa Vernoud, Amy C. Horton, Zhenbiao Yang, et al. Analysis of the Small GTPase Gene Superfamily of Arabidopsis. PlantPhysiology, 2003, 131:1191-1208)。對于大多數Rab蛋白，與特定膜的連接是通過其蛋白C端保守的半胱氨酸異戍二烯化修飾實現的，這一過程需要GGTase (Rab geranylgeranyltransferase,猶牛兒猶牛兒基轉移酶)和REP (Rab escort protein, Rab護送蛋白)的共同參與來完成(樊俊蝶，王偉，梁愛華.Rab蛋白的結構、功能及進化.《生命的化學》，2004，24(1) :31-33)。而經過修飾的Rab蛋白的穩定狀態則受到Rab⑶I的控制。RabGDI (Rab GDP dissociation inhibitor proteins)是一種 GDP 解離抑制齊IJ，是Rab⑶P/RabGTP轉化過程所需的調控因子之一。該因子在Rab蛋白調控囊泡轉運過程中起著重要作用。它能夠抑制Rab蛋白釋放GDP (鳥苷二磷酸)，從而使Rab蛋白不能與GTP (鳥苷三磷酸)結合，使其維持在無活性狀態。膜結合的有活性的Rab-GTP，參與囊泡運輸的調節，最后轉變成Rab-GDP，在Rab⑶I的作用下與膜分離。Rab⑶I分離Rab-GDP的過程可能是自發的，但此過程還需要其它因子的調節，例如GTPase激活蛋白(GTPaseactivating protein, GAP)和鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotideexchange factor, GEF, Yao-ffen Wu, Ku1-Thong Tan, Herbert ffaldmann, et al. Alexandrovinteraction analysis ofprenylated Rab GTPase with Rab escort protein and GDPdissociation inhibitor explains the needfor both regulators. PNAS, 2007, 104(30):12294-12299)。RabGDI，最早是從牛腦細胞質中分離得到的，起初的研究發現GDI是一種抑制⑶P從Rab3A解離的蛋白。隨后的研究發現發現⑶I可以使失去活性的Rab⑶P從膜上分離，回到胞液中從而進入下個循環。GDI有廣泛作用的特性，例如對Rab3A起作用的GDI對已檢測得到的哺乳動物中的其它Rab蛋白都起作用，因此將其統一命名為“ RabGD I ”(Takashi Ueda, Noriyuki Matsuda, Toyoaki Anai, et al. An Arabidopsis gene Isolatedby a novel method for detecting genetic interaction in Yeast encodes the GDPdissociation inhibitor of Ara4 GTPase. ThePlant Cell, 1996，8:2079-2091 )。隨后的研究發現在酵母中只有I個GDI基因，是由GDI1/SEC19編碼的，該基因的突變體表現出多種表型，并對囊泡運輸途徑造成影響。而在老鼠的基因組中至少存在5個GDI基因(Janoueix-Lerosey1.,Jollivet F. ,Camonis J. , et al.Two-hybrid systemscreenwith the small GTP-binding protein Rab6.Biol Chem, 1995，270:14801-14808)。Uedal996年發現了一個編碼擬南芥Rab⑶I的基因，即AtRab⑶II，這是第一個在高等植物里定位的GDI。后續的研究又在擬南芥中又發現了 AtRabGDI2。目前發現在擬南芥中存在三個編碼Rab⑶I的基因4七1^1^0114七1^1^013。其中通過酵母突變體 secl9 功能互補實驗證實 AtRab⑶Il (At2g44100)和 AtRab⑶ 12 (At3g59920)在酵母和植物中具有保守的功能活性。研究表明AtRabGDIl在各組織中均有表達，而AtRab⑶12在根中表達量較高，在花中少量表達，而在其它組織中表達量極低(UedaT. , MatsudaN. , Anai T.,et al. An Arabidopsis geneisolated by a novel method fordetecting genetic interaction in yeast encodes the GDP dissociationinhibitor of Ara4 GTPase. Plant Cell, 1996, 8:2079-2091;Ueda T. , Yoshizumi T. , Anai T. , etal. AtGDI2, a novel Arabidopsis gene encoding a Rab GDP dissociation inhibitor.Gene, 1998, 206:137-143;Zarsky V. , Cvrckova F. , Bischoff F.,et al. At-GDIl fromArabidopsis thaliana encodes arab-specific GDP dissociation inhibitorthat complements the sec 19 mutation of Saccharomycescerevisiae.FEBSLett, 1997,403:303-308。Kim等在通過真菌侵染水稻的實驗研究中發現侵染早期，水稻中的兩個Rab⑶I (Os⑶Il和Os⑶12)表達出現上調。雖然具體的分子機制還不清楚，但推測OsGDI在植物對病原侵害早期的抵御信號擴散具有重要作用。同時發現它們與煙草GDI的蛋白同源性為86%-87%，與擬南芥蛋白同源性為82%-84%，說明該基因可能在植物抗性方面也具有一定的研究價值(Kim W. Y. , Kim C. Y. , Cheong N. E. , et al. Characterizationof two fungal-eIicitor induced rice cDNAs encoding functional homologuesofthe rab-specific GDP-dissociation inhibitor. Planta 1999,210:143-149)。關于AtRab⑶13及BnRab⑶13的表達分析以及其它相關研究未見報道。近年來，基于微RNA (microRNA, miRNA)作用原理而發展的人工微RNA(artificialmiRNA, amiRNA)技術是一種新型的RNA干擾技術。它利用目標基因的特定序列置換植物miRNA的莖序列(一般為21-22nt)，構建amiRNA表達載體來干擾目標基因的表達。該技術不僅能夠像傳統RNAi技術一樣同時干擾沉默所有目標序列或基因，同時也可以精確的干擾基因家族或者等位基因中的單個特殊目標基因，具有聞度的特異性和聞效性，克服了基因代謝補償作用，而且能夠克服傳統RNAi技術(效應分子為小干擾RNA，smallinterfering RNA, siRNA)在實驗操作過程中出現的“脫革巴”等問題(Ossowski S, SchwabR, Weigel D. Genesilencing in plants using artificial microRNAs and other smallRNAs. Plant J. 53:674-690.，2008)，有效的提高了基因干擾的效率。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。油菜雜種優勢明顯，利用細胞核雄性不育配制雜種優勢組合是雜種優勢利用的重要途徑。目前國內外已發現了多種類型的細胞核雄性不育材料，并在理論和應用方面取得了重要進展，而新型不育源的發現和研究一直是雜種優勢研究的基礎，并以此創造出更多的天然和人工不育材料，為育種和生產所應用。
因此，本發明開發了一個和油菜花粉發育和育性調控相關的基因BnRab⑶13。通過熒光定量PCR檢測該基因在可育植株的雄蕊中高量表達。通過轉基因實驗證實，抑制AtRabGDI3的表達會造成擬南芥花藥發育異常，導致雄性不育；而通過在擬南芥中過表達BnRabGD13基因，和雄性不育轉基因植株雜交可以使雜交后代中RabGdDI3基因的表達水平得到恢復，同時花藥和花粉粒的育性也恢復到正常水平。申請人的結果預示著RabGDI3在控制油菜和擬南芥花粉育性，創造雄性不育轉基因新材料中具有相當的應用前景。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因，該基因在油菜的花蕾及雄蕊中高效表達，通過抑制該基因的表達可以降低植物花藥的育性，從而獲得雄性不育植株，應用于雜交育種。而且該基因在其它大部分植物組織中不表達，因此在植物基因工程中沉默該基因的表達不會引起植物營養生長階段的變化。本發明的另一個目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因的制備方法，通過BLAST比對擬南芥及油菜、白菜、甘藍、甘藍型油菜序基因組測序列數據庫，在包含基因全長的序列兩端設計同源引物，應用簡單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。本發明還有一個目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因在控制油菜和擬南芥花粉育性中的應用。通過沉默該基因的表達，發明人可以人工創造雄性不育系材料；而利用基因工程技術過表達該基因得到的恢復系材料，可以使雄性不育材料花粉的育性得到恢復。這一對材料可以在油菜雜交育種生產中應用。為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案為了獲得本發明，發明人對花粉發育過程中的相關基因進行了深入和全面的研究，結果發現了一個新基因BnRabGDI3，在可育植株的花藥中高效表達，而在不育植株中幾乎不表達，因此該基因和植物花粉的育性調控有關。轉基因實驗也證實了這一點抑制該基因的表達會造成擬南芥花藥發育異常，導致雄性不育。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供油菜花藥高效表達基因BnRab⑶13來實現，所述基因含有SEQ ID No.1所述核苷酸序列或與它們實質上同源的核苷酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供植物油菜花藥高效表達多肽BnRab⑶13來實現，所述多肽含有SEQ ID No. 2氨基酸序列或與它們實質上同源的氨基酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的通過提供含有BnRab⑶13基因靶標(AATUTUTATATUUTGTUGAG)序列的人工微RNA干擾重組載體(pamiRNA1-Rab⑶13)來實現對擬南芥中RabGDI3基因表達量的抑制。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體(pamiRNA1-BnRab⑶13)轉化的微生物(根癌農桿菌EHA105，購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)來實現對擬南芥的轉化，從而抑制擬南芥中RabGDI3基因的表達量。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有pamiRNA1- Rab⑶13重組載體的根癌農桿菌EHA105轉化的轉基因植物來實現對花藥育性的調控，獲得雄性不育轉基因植株。
一種油菜BnRab⑶13基因的制備方法，其步驟是1、油菜花藥高效表達基因的克隆1.1油菜BnRab⑶13基因的引物序列根據本實驗室正在進行甘藍型油菜(Brassica napus)基因組測序資源，通過ORFFinder和BLAST軟件對所有已測資源序列進行分析，確定BnRab⑶13序列。所以通過比對分析后，在已知的油菜序列中包含ORF的同源區域設計引物，從而確保擴增產物為全長序列。引物為BnRab⑶I3S :5' -GTAAGATAGGAGGTGGTGG-3'和 BnRabOHSA = S' -CGTAAAACCACTCAGCCAA-3,。1. 2油菜BnRab⑶13基因的制備本發明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(油料作物研究所 王新發副研究員提供，以下相同)。中雙九號播種于大田，正常田間管理。利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)提取基因組DNA。以此為模版，進行PCR擴增(
圖1)。步驟是提取基因組DNA25y 1，以此為模板進行擴增，反應體系為50 μ 1，分別添加IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP4 μ 1，5，弓丨物 1μ 1，3’引物 I μ I7ExTaq O. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約 IOOng, ddH20 37. 5 μ I。根據油菜全基因組測序獲得的BnRab⑶13基因序列設計PCR所用引物為BnRab⑶13S和BnRab⑶13Α (前面已述)。擴增產物大小為2064bp，PCR反應程序為940C 5分鐘，94°C I分鐘，60°C I分鐘，720C 2分鐘，33個循環，720C 10分鐘，16°C 3小時，PCR產物經1. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)轉化gold菌株的感受態細胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨節青霉素50 μ g/mL (質量體積比，以下相同)的LB固體培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，37 °C培養過夜，挑選白斑6個。采用Ml3引物5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '和 5 ' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落 PCR 檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應體系為IOyL內含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I,1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5，引物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10ymol/L)0. 5μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為2744bp，1. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121 °C，6. 859X 104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)提取質粒，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA大小正確后(為2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質粒進行雙酶切(以下相同)，酶切體系(以下相同)為10 μ 1，包含質粒 DNA5y 1，Kpn I 0. 5 μ 1，Xba I O. 5 μ 1，ddH20 4 μ 1，37°C過夜，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-BnRabOTI3 (將目的基因序列BnRab⑶13連入pMD18_T載體構建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，將PMDlS-BnRab⑶13送上海英駿公司進行測序，分析結果顯示，獲得了一種分離的油菜BnRab⑶13基因全長，其序列為SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。通過在線軟件Genescan(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)分析得到該基因的⑶S序列以及氨基酸序列。將基因的⑶S序列與擬南芥⑶S序列通過NCBI比對分析，發現該段區域中含有完整的ORF閱讀框及起始密碼子ATG。獲得了一種分離的油菜BnRabGDI3蛋白全長，其序列為SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。對蛋白質的分子量和理論等電點進行在線計算(http://us. expasyorg/tools/pi tool.htm)。BLAST 發現 BnRabGDI3 與 AtRabGDI3CDS核苷酸同源性大于90%，利用DNA MAN以及在線軟件TCOFFEE (http://www. tcoffee.org/)它們的氨基酸同源性達到97%。結果表明所克隆的油菜Rab⑶13是AtRab⑶13的同·源基因，將其命名為BnRab⑶13。通過 GSDS (Gene Structure Display Server) (http: //gsds. cb1. pku. edu. cn/)分析預測發現BnRab⑶13與AtRab⑶13基因結構非常相似。該基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。含有12個外顯子，11個內含子，每個內含子、外顯子的大小、分布等都與AtRabGD13 相同。通過在線軟件 Genescan (http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)分析得到該基因的⑶S序列以及氨基酸序列。BLAST發現與AtRab⑶13⑶S核苷酸同源性大于90%，AtRab⑶13和BnRab⑶13同源基因分別編碼了 445、436個氨基酸。應用SOPMA預測發現兩個基因所編碼蛋白在二級結構上非常保守，其α螺旋、延伸鏈、β轉角和不規則卷曲等組成比例極為相似。通過在線軟件 ProtScale(http://www. expasy. ch/tools/protscale.html)分析二者氨基酸的親疏水性的排布較一致，兩序列大部分的氨基酸在O軸線的下方，因此大部分的氨基酸屬于親水氨基酸。我們利用TMHMM在線軟件(http://www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)對2個Rab⑶13蛋白的跨膜結構域進行了分析。擬南芥和甘藍型油菜的蛋白序列的AAs值表明兩條序列沒有信號肽段，沒有明顯的跨膜區域，且兩個蛋白序列的N-1n值都較低，因此Rab⑶13不是一個膜蛋白。應用PSORT程序(http://psort. hgc.jp/)對其進行亞細胞定位分析，結果表明該蛋白可能存在于細胞質中。軟件預測結果與GDI在Rab蛋白循環中的作用環境一致。因此BnRab⑶13和其他⑶I基因一樣在Rab蛋白調控囊泡轉運過程中起著重要作用，具有控制囊泡運輸的功能。本發明通過構建RabGDI3的RNA干擾載體轉化擬南芥后發現，轉基因植株由于RabGDI3的表達受到抑制而均出現了雄性不育的表型。說明RabGDI3具有控制擬南芥花藥發育和花粉育性的新功能。2、油菜BnRab⑶13基因的表達模式本發明所用另一種油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)顯性核不育雜合不育系JOSAI^Msmsrfrf^msmsrfrf )。系經多年回交和姐妹交而育成。不育株命名為A,可育株命名為B，二者可視為一對近等基因系，僅存在不育位點差異(胡勝武，于澄宇，趙惠賢，路明，油菜顯性核不育材料Shaan — GMS純合兩型系803AB的選育。西北農業學報，2002，ii (4)25 - 2)。供試材料播種于大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花蕾、角果，從花蕾中解剖分離雌蕊和雄蕊(花藥)，每種材料至少取三個重復，每個重復至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。在大田分別從油菜可育植株和不育植株上取花蕾，帶回實驗室后，在冰盒上分別挑取可育植株和不育植株花蕾中的雄蕊和雌蕊，每種材料至少取三個重復，每個重復至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。提取RNA時,在液氮中將植物樣品研磨至粉狀,利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進行RNA的提取。所提總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN，USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結合1% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板，根據Promega公司逆轉錄酶的說明進行逆轉錄，得到的cDNA分裝后于_80°C保存備用。熒光定量PCR儀為IQ5 (美國伯樂公司)，采用油菜Actin作為內標基因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ' CTGGAATTGCTGACCGTATGAG3 '和5 ' ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG 3 '。根據擬南芥和油菜Rab⑶13基因CDS序列的保守區段設計的BnRab⑶13基因引物為5 ' -CCCCGACTACTATGGAGGAGAA-3 '和5' -AGCGTGTGGATTAGGGTTTGA-3'。
熒光定量PCR反應每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。分別檢測BnRab⑶13在油菜組織(根、莖、葉、花、角果，大、中、小花蕾，雄蕊、雌蕊)中的表達。用比較Ct法(Λ ACt)計算基因的相對表達量。通過2_Λ w估算目的基因的相對表達量和系統誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of RelativeGeneExpression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_& &CT Method.METHODS 25，402 - 408.)。在計算相對表達量時，以根的樣本為參照，即將其值轉換成I (標準值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達值。3、Rab⑶13基因的功能驗證3.1Rab⑶13基因人工微RNA干擾植物表達載體pamiRNAi_AtRab⑶13的構建為了研究本發明中的花粉高效表達基因BnRab⑶13的功能，采用了 amiRNAi(artif icialmicroRNA interference,人工微RNA干擾，以下相同)技術。由于油菜BnRabGD13和擬南芥的RabGDI3具有相似的表達模式、基因結構(李振波.油菜小孢子發育相關基因BnRabGDI3的功能研究.[碩士學位論文].湖北武漢中南民族大學)以及90%以上的蛋白同源性，推測兩者具有相同的功能，因此油菜BnRabGDI3的功能是通過研究擬南芥AtRab⑶13的功能獲得的。人工微RNA干擾載體的構建原理如圖3所示(SchwabR. ,Ossowski S. , Riester M. , et al. Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis. Plant Cell, 2006，18 (5) : 1121-1133)。選取的革巴序列為TTACACAGCACTCAAACGTGG，相應的 Oligo DNA 為AATGTGTCGTGAGTTTGCACC。在此方法基礎上Yan等發明提出了一種快速高效的植物人工微RNA表達載體的構建方法(Yan H.，DengX. , et al. A novel approach for the construction ofplant amiRNA expressionvectors. Journal of Biotechnology, 2011, 151:9_14),參照上述文獻報道方法完成了本實驗中人工微RNA干擾載體pamiRNA1-AtRab⑶13的構建。通過凍融法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)將含有上述獲得的pamiRNA1-AtRabGDI3載體的質粒轉化農桿菌EHA105 (購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)步驟如下
1:取O. 2ml感受態農桿菌，于冰中緩慢融化。2 :加入約2 μ g重組質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液體培養基(前面已述)，28°C輕搖培養4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細胞重懸于O. 2ml LB液體培養基(前面已述)培養基。5 :將培養物均勻涂布在含Rif (50mg/L)和Str (50mg/L)的LB固體培養基(前面已述)瓊脂板上，28°C培養2天，待平板上出現轉化子 后挑菌，以BarF:5' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3'和 BarR:5' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3'為引物進行菌落PCR檢測。檢測方法如下是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模板，反應體系為10 μ I 內含模板 DNA 模板 I μ L(約 IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2)1 μ I,1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I μ 1，5，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l，Taq(5U/μ 1)0. 5μ l，ddH20 5· 5μ I。反應條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30 秒，55。。80 秒，72。。I 分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為1028bp。將pamiRNA1-AtRab⑶13轉入根癌農桿菌EHA105 (前面已述)，用利福平(50μ g/mL)抗性平板篩選，挑取菌斑，菌落PCR檢測驗證(前面已述)。3. 2amiRNAi植物表達載體pamiRNA1-AtRab⑶13在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選采用花序侵染法(Zhang X. R. et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsisthaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進行擬南芥轉化。制備含有重組載體pamiRNA1-AtRab⑶13的根癌農桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉化前一天轉入含有利福平50 μ g/ml的LB液體培養基((前面已述)中，28 °C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當菌液的吸光值達到在1. 6-2. O之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質量體積比，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet1-77 (購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)。混勻后把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥3-5天。將轉化收獲的TO代種子播在混有PNS營養液的蛭石中，(PNS營養液成份為每升含 5ml IM KN03，2ml IM Ca (N03) 2 . 4H20, 2ml IM MgS04 . 7Η20，2· 5ml 20mMFe. EDTA, 2. 5ml IM磷酸緩沖液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)。轉移到溫度20-25 °C，光照強度5000-10000流明，光周期為16小時光照/8小時黑暗，空氣濕度大于80%以上的培養間中，正常管理。根據表達載體上特有的草胺磷(Bar)抗性篩選陽性植株。擬南芥長出一片真葉后，噴灑30ppm的除草劑Basta (購自拜爾公司)。一星期后，噴灑50ppm的Basta，獲得擬南芥轉基因陽性苗。篩選得到的轉化植株，稱Tl代轉化植株(以下相同)。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA (前面已述)，進行轉化材料的PCR陽性檢測(以下相同)。引物序列為BarF: 5 ' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3 '和BarR: 5 ' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3 '，反應體系為 10 μ I 內含模板 DNA 模板 I μ L (約IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 5· 5μ I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C 30秒，55°C 80秒，72°C I分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為1028bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)，結果表明，Rab⑶13基因人工微RNA干擾植物表達載體PamiRNA1-AtRab⑶13已經成功轉入擬南芥。共獲得了 11株轉基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同，圖4)，分別命名為ΜΙ-1，ΜΙ-2等(以下相同)。3. 3人工微RNA干擾載體pamiRNA1-AtRab⑶13轉基因擬南芥表型觀察經過除草劑篩選和PCR檢測后獲得的轉基因陽性植株在生長間中正常管理并觀察其表型。在開花期，選取各個轉基因植株的分支頂端已經漏白但未開放的花朵，撥開花蕾。在放大鏡(3倍)以及體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61TRC)下觀察花藥以及花粉。用解剖針分離出花藥，參照亞歷山大染色法(Alexander, M. P. Differential staining of abortedandnon-aborted pollen. Stain Technol,, 44:117-122. , 1969,以下相同)，40 °C 水浴加 熱亞歷山大染色液(以配制大約100毫升染色液為例乙醇10ml，1%的孔雀石綠酒精溶液lml，蒸餾水50ml，甘油25ml，1%的酸性品紅水溶液5ml，1%的橙黃G水溶液0. 5ml，冰醋酸
l-4ml，苯酚5克，水合氯醛5克，以下相同)并浸泡花藥過夜(10-15小時)，用壓片法在顯微鏡(OLYMPUS 1X71)下觀察小孢子。通過觀察并統計正常小孢子(染成桔紅色)和敗育小孢子(染成綠色)的比例判斷小孢子的敗育程度。結實期用肉眼觀察轉基因擬南芥的結實情況。染色觀察結果顯示野生型擬南芥的花藥飽滿并且充滿了小孢子，小孢子均染成橘紅色，說明小孢子發育正常。而轉基因擬南芥的花藥中小孢子數目都遠遠少于野生型，有少量正常的小孢子數目，其它均為空癟或被染成綠色的敗育的小孢子(圖5)。經過對所有轉基因后代植株進行觀察統計，結果顯示大部分轉基因后代擬南芥均出現了雄性不育表型，說明AtRabGDI3干擾轉基因植株出現了典型的雄性不育表型。4、BnRab⑶13基因的互補功能驗證4.1BnRab⑶13基因過表達植物表達載體OX-BnRab⑶13的構建和根癌農桿菌菌株EHA105的轉化。為了進一步證實油菜BnRab⑶13基因和擬南芥AtRab⑶13基因具有相同的功能，我們構建BnRab⑶13基因過表達植物表達載體，轉化擬南芥。用獲得的OX-BnRab⑶13轉基因后代為父本，以人工微RNA干擾的pamiRNA1-AtRabGDI3雄性不育轉基因后代為母本進行雜交，檢測雜交后代植株的花藥育性是否能夠得到恢復。過表達載體的構建方法如下油菜花期，在田間收集油菜花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取中雙九號(前面已述)花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據Promega公司逆轉錄酶的說明進行逆轉錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_80°C保存備用。以獲得的花蕾cDNA為模板進行BnRab⑶13基因⑶NA片段的PCR擴增。根據甘藍型油菜BnPABP5基因序列(SEQ ID NO:1)設計引物，Rab⑶I3F:GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG和 Rab⑶I3R:GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC。引物序列的 5'末端分別引AT XbalI和SacI限制性內切酶位點。PCR反應體系為25 μ L內含:1 XPCR buffer, MgCI1.5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L,Pfu酶1. 5單位,模板約100ng。PCR 反應程序如下-MV 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec, 72°C lmin，35 個循環；72° C延伸8min。PCR產物經1. 0% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得BnRab⑶13基因⑶NA全長序列。用獲得的BnRab⑶13基因⑶NA全長序列替換pBI121植物表達載體中的⑶S基因序列，獲得BnRab⑶13基因的植物過表達載體。為完成此目的，首先用Xba I/SacI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)BnRab⑶13基因 CDNA 片段，同時用 Xba I/SacI 酶切 pBI121 (Chen, P. Y. , Wang, C. K.，Soong, S. C. To, Κ.Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloningT-DNAinsertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11，287-293)質粒的 GUS 片段。酶切體系為10 μ I (前面已述)，酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用1% (質量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。 將BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切產物和克隆載體ρΒΙ121上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切產物比ρΒΙ121載體片段(150ng BnRab⑶13基因⑶NA片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度t匕)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應緩沖液，無菌水補充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑后以NPT II F 5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5/ -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '引物進行菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應體系為 IOyL 內含10XTaq buffer (含 MgCl 2) I μ I,1. 5mmol/L dNTP (I Ommo I/L) I μ 1，5，弓 I物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C 30秒，72°C 2分鐘30秒，33個循環，72 °C 10分鐘，擴增大小為800bp，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。以BarF和BarR(前面已述)為引物進行做菌落PCR (前面已述)，選擇陽性菌株提質粒，酶切驗證正確的重組質粒命名為OX-BnRab⑶13。然后利用凍融法(前面已述)將OX-BnRab⑶13轉入根癌農桿菌EHA105 (前面已述),卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選,挑斑,進行菌落PCR檢測驗證(前面已述)。4. 20X_BnRab⑶13在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選采用花序侵染法進行擬南芥轉化(前面已述)。在轉化擬南芥前一天，將制備含有載體OX-BnRab⑶13的根癌農桿菌EHA105 (前面已述)菌液轉入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50μ g/ml的LB液體培養基中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L1300)于276納米波長下檢測吸光值，當菌液的吸光值在1.6-2. O之間時取出。室溫(20-25°C,以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清,沉淀懸浮于等體積的5%(質量體積比)鹿糖中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0. 02%(體積比)的Silwet
1-77 (購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)。混勻后把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥3-5天。將轉化收獲的TO代種子用70%(體積比)酒精和0. 01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養基(MS大量元素母液100ml ;MS微量元素母液10ml ;MS有機母液10ml ；MS鐵鹽IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養箱培養。根據表達載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片進行PCR陽性檢測，引物為NPT II F 和NPT II R(前面已述)，反應體系為10 μ I。內含:模板DNA I μ L (約IOOng)，10 X Taqbuffer(含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3’ 引物(10 μ mol/L)O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l,ddH20 5· 5μ I。反應條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為800bp。結果表明(圖7)獲得了轉基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。將陽性植株自交3代以上，獲得8個純合T3代株系。分別命名為OX-1，0X-7等(以下相同)。表IMS培養基母液配方
權利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.權利要求1所述的一種分離的基因在控制擬南芥花粉育性中的應用。
4.權利要求2所述的一種分離的多肽在控制擬南芥花粉育性中的應用。
5.權利要求1所述的一種分離的基因在控制油菜花粉育性中的應用。
6.權利要求2所述的一種分離的多肽在控制油菜花粉育性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜BnRabGDI3基因及其應用，一種分離的基因，其序列為SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。RabGDI3是一種GDP解離抑制劑，是RabGDP/RabGTP轉化過程所需的調控因子之一，在Rab蛋白調控囊泡轉運過程中起著重要作用。BnRabGDI3在油菜花藥和小孢子中呈顯著的優勢表達。干擾擬南芥AtRabGDI3基因的表達能夠使其小孢子敗育。利用過表達BnRabGDI3的轉基因擬南芥作為父本，和干擾RabGDI3基因的轉基因擬南芥授粉，雜交后代植株的花藥和花粉育性得到恢復。這一互補實驗證實油菜BnRabGDI3和擬南芥AtRabGDI3具有相同的功能控制油菜、擬南芥花藥發育以及花粉育性。通過基因工程技術調控RabGDI3的表達水平可以控制花粉的育性，創造雄性不育系材料和恢復系材料，可用于雄配子發育研究及農作物品質改良。
文檔編號C12N15/29GK103014018SQ20121049454
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍艷, 李振波, 童超波, 劉越英, 程曉輝 申請人:中國農業科學院油料作物研究所