城市垃圾堆肥微生物組分的提取方法

專利名稱：城市垃圾堆肥微生物組分的提取方法
技術領域：
本發明屬于環境保護技術領域，涉及城市垃圾堆肥微生物組分的提取方法。本發明為今后將采用生活垃圾堆肥分離培養的這些菌種應用于草坪植物建植體系中提供了有力的技術支持。
背景技術：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等) 或商業菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩定的腐殖質〔humicsubstance，HS) 轉化的生物化學過程。這一過程也是地球表面生態過程的一部分，它參與地球表面的物質和能量循環。在人為控制條件下，通過堆肥化可以將固體廢物中的有機物轉化成為有機肥料一堆肥(compost)，這種有機肥料作為堆肥化的最終產物，不僅性能穩定，并且對環境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無害化、穩定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發展至今，已經歷了漫長的歷史，對其產生和發展的歷史過程進行回顧和分析，可為今后開發新的堆肥工藝技術提供理論和實踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養基，在城市生活垃圾堆肥處理過程中，溫度達 45°C和55°C時，對堆肥菌株進行分離，發現在45°C時曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優勢菌群。而到55°C時則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優勢菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優勢菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過程中，微生物種群處在一個不斷變化的動態平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結果有力地促進了對垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對城市垃圾堆肥過程誒生物變化的調查發現，分解有機物產生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過程中，高溫階段初期和中期階段細菌均占主要地位。馬文漪等也報道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機物的組成來看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對各種物質的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過程中出現的微生物種群和數量上亦截然不同。近期的相關文獻及實際生產表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術水平、提高處理效率、改善產品質量，一直是相關科研人員所重點關注的研究內容；在堆肥物料中針對特定物質有目的的添加一些人工微生物制劑，已經被很多研究所證實是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考慮到在很多研究和生產實踐中，合理配比的復合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來的各種功能菌株結合起來開發高效堆肥復合菌劑，從根本上優化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質便成了相關科研人員研究的熱點問題。盡管植物接種微生物的效應研究報道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等)或商業菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩定腐殖質轉化的生物化學過程，是由群落結構演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現有機廢棄物資源化、無害化的動態過程。研究表明，單一的細菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化進程中的作用都比不上復合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復合菌劑對堆肥化過程中微生物的影響，有利于了解堆肥過程的生物化學過程及加入微生物制劑對堆肥的影響。近年來國內外學者對堆肥過程中的微生物現象進行了一系列理論和實踐研究，Vaz-Moreira等人對堆肥中細菌的群落多樣性進行分析，以期深入認識堆肥過程的本質，為堆肥技術和工藝的研究提供理論基礎。鑒于此，從生活垃圾堆肥中分離微生物，在用于農業生產將無疑具有重要重要作用，而這方面尚無細致和系統的開展工作。本技術就是為生活垃圾堆肥中微生物的應用開辟前景。但在復合微生物菌劑研究過程中，有關堆肥內部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關系具有模糊性和復雜性，以及將堆肥微生物菌劑應用于正常條件下對植物生長的影響方面，相關研究也鮮為報道。而有關堆肥內部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關系具有模糊性和復雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復合有益微生物菌劑，并應用于草坪建植體系，以改善草坪植物生長、 生理特性方面的作用還未見報道。

發明內容
本發明的目的就是公開了一種從堆肥原液中取出菌液，在適合不同菌種生長的固體培養基中分別培養分離，分離后的純菌種接種到液體培養基中進行增殖培養，從而鑒定堆肥有效微生物的組成，而應用于草坪建植中。為實現上述目的本發明公開了如下的技術內容
一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—號培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、牛肉膏蛋白胨培養基的固體培養基中分別培養分離，分離后的純菌種接種到液體培養基中進行增殖培養，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成，其特征在于按如下的步驟進行
(1)配制固體培養基燒杯中加一定量的蒸餾水、去離子水或自來水，按配方稱取營養成分，加入濃度為0. lg/L EDTA ；待全部營養成分配齊后，用質量濃度為100g/L的NaOH或質量濃度為100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2，然后加入緩沖劑，分裝，置高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，冷卻備用；
(2)菌種分離培養
1)到平板每種培養基倒入3個皿中；
2)制備堆肥稀釋液稱取新鮮堆肥10克，放入盛90ml無菌水，振搖約20min，制成ΙΟ—1- 10_6稀釋度的堆肥溶液；
3)涂布將上述每種培養基的平板底部或培養基周邊用記號筆分別寫上10_4，10_5， 和10_6 3種稀釋度字樣，每種培養基每稀釋度標記3皿，然后用滅過菌的量程為2(T200ul 的移液槍分別由10_4，10_5和10_6 3管堆肥稀釋液中吸取適量對號放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿放入0. ani，用無菌玻璃涂棒，在培養基表面皿輕輕地涂布均勻，室溫下靜置 5 IOmin ；
4)培養將含高氏Gause—號培養基的平板倒置于溫室下培養5 7天，馬鈴薯葡萄糖培養基的平板倒置于溫室下培養3飛天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C溫室中培養廣2天；
(3)配制液體培養基
1)牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 滅菌 20min ；
2)馬鈴薯葡萄糖培養基馬鈴薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.IMPa滅菌20分
鐘；
3)高氏合成一號培養基可溶性淀粉4g;硝酸鉀0.28;氯化鈉0.^;三水合磷酸氫二鉀0. Ig ；七水合硫酸鎂0. Ig ；七水合硫酸亞鐵0. 002g ；瓊脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸溜水 200ml ；pH7. 2 7. 4,0. IMPa 滅菌 20 分鐘；
(4)接種純菌種用灼燒過的接種環取菌種，先將接種環接觸一下沒長菌的培養基部分，使其冷卻以免燙死菌種，然后用接種環輕輕取菌少許，將取有菌種的接種環送入液體培養基中，并使接種環在液體與瓶壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中，接種后塞上棉塞，使液體培養基輕輕搖動，使菌體均勻分布于培養基中，以利生長；
(5)菌種的增值培養將液體培養基放入旋轉式搖床進行微生物振蕩培養，固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以200-250r/min的速度運動，由此帶動培養物圍繞著錐形瓶內壁平穩轉動，搖床恒溫30°C，培養Μ、》ι后，各培養基變混濁，表明各菌種已在培養基中生長，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的組成菌種。本發明所述提取微生物組分的方法，其中的固體培養基為
(1)牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏5. Og ；蛋白胨IOg ；NaCL 5g ；瓊脂20g ；水IOOOml ；PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 滅菌 20min ；
(2)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基馬鈴薯200g；葡萄糖(蔗糖)20g ；瓊脂15_20g ；水 IOOOml ；PH 自然，0. IMPa 滅菌 20min ；
(3)高氏合成一號培養基可溶性淀粉20g;硝酸鉀18;氯化鈉0.58;三水合磷酸氫二鉀0. 5g ；七水合硫酸鎂0. 5g ；七水合硫酸亞鐵0. Olg ；瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ； ρΗ7· 2-7. 4,0. IMPa 滅菌 20min。本發明所述提取微生物組分的方法，其中所述的緩沖劑為=K2HPO4 , KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。本發明所述提取微生物組分的方法，其中所述的KT1- 10_6稀釋度的堆肥溶液在測定
A.細菌數量時，采用10-4，10_5，10-6稀釋度；
B.放線菌數量時，采用10-3，10_4，10-5稀釋度；C.真菌數量時，采用10-2，10_3，10-4稀釋度。


圖1為牛肉膏蛋白胨培養基上的細菌生長情況； 圖2為高氏一號培養基上的放線菌生長情況； 圖3為土豆培養基上的酵母菌生長情況； 圖4為土豆培養基上的霉菌生長情況； 圖5，圖6為枯草芽孢桿菌劃線分離和純化培養的生長情況； 圖7，圖8為放線菌劃線分離和純化培養的生長情況； 圖9，圖10為酵母菌劃線分離和純化培養的生長情況。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供下述制備方法實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發明的范圍。實施例1
1研制材料與方法 1. 1試驗材料
菌種來源天津六里臺實驗基地垃圾堆肥原料。采土方式在選好適當地點后，先由人工撿去垃圾堆肥中的各類木頭、塑料、玻璃、 金屬等雜物。用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。采好的樣應及時處理，暫不能處理的也應貯存于4°C冰箱中，但貯存時間不宜過長，取天津市西青區天津師范大學的土壤基質為對照。1. 2微生物的營養和生長
微生物的營養要素
微生物的營養物質應滿足機體生長、繁殖和完成各種生理活動的需要。它們的作用可概括為形成結構(參與細胞組成)，提供能量(機體進行各種生理活動所需要的能量)和調節作用(構成酶的活性成分和物質運輸系統)。微生物細胞的化學組成從一個側面反映了微生物生長繁殖的物質需要。雖然，隨微生物種類、生理狀態及環境的不同，其組成也有變化，但通過對細胞元素組成的分析可大體看出微生物所需的營養物質。表1顯示細菌、酵母菌和霉菌的主要元素組成。這些元素主要以水、有機物和鹽的形式存在與細胞中；有機物主要是以蛋白質、糖、核酸、維生素以及激素等形式存在。表1細菌、酵母菌和霉菌的元素組成(干重％)
權利要求
1.一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—號培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、牛肉膏蛋白胨培養基的固體培養基中分別培養分離，分離后的純菌種接種到液體培養基中進行增殖培養，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成，其特征在于按如下的步驟進行(1)配制固體培養基燒杯中加一定量的蒸餾水、去離子水或自來水，按配方稱取營養成分，加入濃度為0. lg/L EDTA ；待全部營養成分配齊后，用質量濃度為100g/L的NaOH或質量濃度為100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2，然后加入緩沖劑，分裝，置高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，冷卻備用；(2)菌種分離培養1)到平板每種培養基倒入3個皿中；2)制備堆肥稀釋液稱取新鮮堆肥10克，放入盛90ml無菌水，振搖約20min，制成 ΙΟ—1- 10_6稀釋度的堆肥溶液；3)涂布將上述每種培養基的平板底部或培養基周邊用記號筆分別寫上10_4，10_5，和 10_6 3種稀釋度字樣，每種培養基每稀釋度標記3皿，然后用滅過菌的量程為2(T200ul的移液槍分別由10_4，10_5和10_6 3管堆肥稀釋液中吸取適量對號放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿放入0. anl，用無菌玻璃涂棒，在培養基表面皿輕輕地涂布均勻，室溫下靜置 5 IOmin ；4)培養將含高氏Gause —號培養基的平板倒置于溫室下培養5 7天，馬鈴薯葡萄糖培養基的平板倒置于溫室下培養3飛天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C溫室中培養廣2天；(3)配制液體培養基1)牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 滅菌 20min ；2)馬鈴薯葡萄糖培養基馬鈴薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.IMPa滅菌20分鐘；3)高氏合成一號培養基可溶性淀粉4g;硝酸鉀0.28;氯化鈉0.^;三水合磷酸氫二鉀0. Ig ；七水合硫酸鎂0. Ig ；七水合硫酸亞鐵0. 002g ；瓊脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸溜水 200ml ；pH7. 2 7. 4,0. IMPa 滅菌 20 分鐘；(4)接種純菌種用灼燒過的接種環取菌種，先將接種環接觸一下沒長菌的培養基部分，使其冷卻以免燙死菌種，然后用接種環輕輕取菌少許，將取有菌種的接種環送入液體培養基中，并使接種環在液體與瓶壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中，接種后塞上棉塞，使液體培養基輕輕搖動，使菌體均勻分布于培養基中，以利生長；(5)菌種的增值培養將液體培養基放入旋轉式搖床進行微生物振蕩培養，固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以200-250r/min的速度運動，由此帶動培養物圍繞著錐形瓶內壁平穩轉動，搖床恒溫30°C，培養Μ、》ι后，各培養基變混濁，表明各菌種已在培養基中生長，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的組成菌種。
2.權利要求1所述提取微生物組分的方法，其中的固體培養基為(1)牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏5. Og ；蛋白胨IOg ；NaCL 5g ；瓊脂20g ；水IOOOml ；PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 滅菌 20min ；(2)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基馬鈴薯200g；葡萄糖(蔗糖)20g ；瓊脂15_20g ；水 IOOOml ；PH 自然，0. IMPa 滅菌 20min ；(3)高氏合成一號培養基可溶性淀粉20g;硝酸鉀18;氯化鈉0.58;三水合磷酸氫二鉀0. 5g ；七水合硫酸鎂0. 5g ；七水合硫酸亞鐵0. Olg ；瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ； ρΗ7· 2-7. 4，0. IMPa 滅菌 20min。
3.權利要求1所述提取微生物組分的方法，其中所述的緩沖劑為=K2HPO4、KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。
4.權利要求1所述提取微生物組分的方法，其中所述的ΙΟ—1-10_6稀釋度的堆肥溶液在測定Α.細菌數量時，采用10-4，10_5，10-6稀釋度； B.放線菌數量時，采用10-3，10_4，10-5稀釋度；C.真菌數量時，采用10-2，10_3，10-4稀釋度。
全文摘要
本發明公開了一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在適合不同菌種生長的固體培養基中分別培養、分離，以及分離后的純菌種接種到液體培養基中進行增殖培養，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成。實驗結果表明，在城市垃圾堆肥中的優勢菌種為枯草芽孢桿菌、放線菌及酵母菌，這些菌種不僅數量多而且有的種類也很多。本發明為今后將采用生活垃圾堆肥分離培養的這些菌種應用于草坪植物建植體系中提供了有力的技術支持。
文檔編號C12N1/16GK102174404SQ201110037030
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月14日 優先權日2011年2月14日
發明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請人:天津師范大學