專利名稱：一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種產皺胃酶工程菌株的構建方法。
背景技術：
在干酪生產過程中，需在乳中加入凝乳酶使其中的酪蛋白凝固成固態膠體，同時加入乳酸菌發酵劑并經壓榨成型和后期成熟而形成各種形態結構和風味的干酪制品。近年來世界干酪產量一直保持上升的態勢，因此對凝乳酶的需求量也在逐年增加。目前，世界上凝乳酶制劑年需求量為2.5X106L，產量占全世界酶制劑總量的15%，成為第二大酶制劑， 而且需求量仍在不斷增加。傳統的凝乳酶為犢牛皺胃酶，是從未斷奶犢牛第四胃(皺胃) 的鹽浸出液中提取出來的粗制酶。因該酶具有凝乳活力與蛋白水解活力比值高的特性而成為制作干酪的首選酶，用犢牛皺胃酶制作出來的干酪在風味、質地和產量等方面均優于其他來源的凝乳酶。因此被廣泛用于干酪制造業。目前世界年均約5000萬頭犢牛被宰殺供提取皺胃酶以用于干酪的生產。由于全球性的犢牛短缺使皺胃酶的來源變得極不穩定，而且生產成本高。近年來人們對于瘋牛病的恐慌使犢牛皺胃酶的應用受到置疑。為了解決這一矛盾，人們在不斷尋找新來源的具有凝乳作用的蛋白酶以替代犢牛皺胃酶，其中包括植物和微生物來源的凝乳酶。植物凝乳酶來源廣泛，如無花果蛋白酶和木瓜蛋白酶等，但受時間、地域、生長周期等條件的限制，而且用植物來源的凝乳酶生產干酪將導致凝乳質地松軟、干酪產率偏低且易產生苦味等不良現象。利用微生物凝乳酶生產干酪將導致產品性狀不一致，而且微生物來源的凝乳酶具有蛋白水解特異性差、耐熱性能強和蛋白水解活性高的特點，不但導致干酪得率降低而且成熟后會產生苦味，因此使其應用受到了限制。在這種情況下世界各干酪生產大國都在積極尋求新的凝乳酶資源來滿足干酪生產的需要。因此，如何開發優質和經濟的犢牛皺胃酶替代品成為當今世界研究的熱門課題之一。隨著基因工程技術的發展，利用微生物基因工程技術生產重組皺胃酶是解決上訴問題的理想途徑。重組皺胃酶成本較低、酶提取方便、經濟效益高，同時酶受奶粉成分和酸度影響較小，生產的干酪在得率與產品品質上甚至優于以犢牛皺胃酶制造的干酪。國外大公司如丹麥諾維信、美國Sigma、英國格連契昂哈賽等已經利用現代生物技術改良菌種，生產出高活力的重組酶，產生了巨大的經濟效益。我國所用的凝乳酶小部分是從微生物中提取的，主要還是依賴于進口。我國還沒有跨入用基因工程技術生產凝乳酶的國家之列。
發明內容
本發明的目的在于提供一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法。產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法按以下步驟進行一、根據Genebank中發表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列(AJ001018)設計上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因；
二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質粒pBluescript-II同時用&ic I和 Xho I進行雙酶切，回收所需目的片段并進行連接，獲得連接產物pBluescript-11-PMRl ；三、連接產物pBluescript-11-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pBluescript-11-PMRl，經PCR、酶切和測序鑒定后用Avr II酶切重組質粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質粒，回收所需目的片段連接得構建重組質粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質粒pBluesk_Z-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選陽性克隆用于重組質粒pBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質粒pBluesk-Z-PMRl分別用I和Bio I進行線性化，回收并純化雙酶切產物，然后轉化乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，構建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799，所得重組菌株即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進行密碼子優化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達密碼子，然后進行全基因合成，得優化犢牛皺胃酶基因，然后轉入PMD18-T載體，獲得含有優化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體；六、用Ml I和Not I分別雙酶切含有優化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達載體pKLACl，回收純化目的片段并進行連接得重組質粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pKLACl-S-chymosin， 經PCR、酶切和測序鑒定后用Mc II進行線性化，回收并純化酶切產物，然后采用化學法轉化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，獲得含有多個皺胃酶基因串連表達框的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉化株，即完成產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3'，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發明中產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，所得的重組乳酸克魯維酵母可用來生產制造干酪用的重組皺胃酶，且重組皺胃酶的活力高達860U/mL，本發明中為采用基因工程技術生產凝乳酶做了突出貢獻。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法按以下步驟進行一、根據Genebank中發表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列(AJ001018)設計上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因；二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質粒pBluescript-II同時用&ic I和 Xho I進行雙酶切，回收所需目的片段并進行連接，獲得連接產物pBluescript-11-PMRl ；
三、連接產物pBluescript-11-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pBluescript-11-PMRl，經PCR、酶切和測序鑒定后再用Avr II酶切重組質粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質粒，回收所需目的片段連接得重組質粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質粒pBluesk_Z-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選陽性克隆用于重組質粒pBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質粒pBluesk-Z-PMRl分別用I和Bio I進行線性化，回收并純化雙酶切產物，然后轉化乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，從而構建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進行密碼子優化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達密碼子，然后進行全基因合成，得優化犢牛皺胃酶基因，然后轉入PMD18-T載體，獲得含有優化犢牛皺胃酶基因的pMDlS-Τ載體；六、用Ml I和Not I分別雙酶切含有優化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達載體pKLACl，回收純化目的片段并進行連接得重組質粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pKLACl-S-chymosin， 經PCR、酶切和測序鑒定后用Mc II進行線性化，回收并純化酶切產物，然后采用化學法轉化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，獲得含有多個皺胃酶基因串連表達框的乳酸克魯維酵母GG799PMR1基因缺陷型轉化株，即完成產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3'，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列為:ATGAGATGTTTGGTTGTTTTGTTGGCTGTTTTCGCTTTGTCTCAAGG TGCTGAAATTACTAGAATTCCATTGTATAAAGGTAAATCTTTGAGAAAAGCTTTGAAAGAACATGGTTTGTTGGAAG ATTTCTTGCAAAAACAACAATATGGTATTTCTTCTAAATATTCTGGTTTCGGTGAAGTTGCTTCTGTTCCATTGACT AATTATTTGGATTCTCAATATTTCGGTAAAATTTATTTGGGTACTCCACCACAAGAATTCACTGTTTTGTTCGATAC TGGTTCTTCTGATTTCTGGGTTCCATCTATTTATTGTAAATCTAATGCTTGTAAAAATCATCAAAGATTCGATCCAA GAAAATCTTCTACTTTCCAAAATTTGGGTAAACCATTGTCTATTCATTATGGTACTAGATCTATGCAAGGTATTTTG GGTTATGATACTGTTACTGTTTCTAATATTGTTGATATTCAACAAACTGTTGGTTTGTCTACTCAAGAACCAGGTGA TGTTTTCACTTATGCTGAATTCGATGGTATTTTGAGAATGGCTTATCCATCTTTGGCTTCTGAATATTCTATTCCAG TTTTCGATAATATGATGAATAGACATTTGGTTGCTCAAGATTTGTTCTCTGTTTATATGGATAGAAATGGTCAAGAA ACTATGTTGACTTTGGGTGCTATTGATCCATCTTATTATACTGGTTCTTTGCATTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACA ATATTGGCAATTCACTGTTGATTCTGTTACTATTTCTGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAAGGTGGTTGTCAAGCTATTT TGGATACTGGTACTTCTAAATTGGTTGGTCCATCTTCTGATATTTTGAATATTCAACAAGCTATTGGTGCTACTCAA AATCAATATGGTGAATTCGATATTGATTGTGATAATTTGTCTTATATGCCAACTGTTGTTTTCGAAATTAATGGTAA AATGTATCCATTGACTCCATCTGCTTATACTTCTCAAGATCAAGGTTTCTGTACTTCTGCTTTCCAATCTGAAAATC ATTCTCAAAAATGGATTTTGGGTGATGTTTTCATTAGAGAATATTATTCTGTTTTCGATAGAGCTAATAATTTGGTT GGTTTGGCTAAAGCTATTTAA。本實施方式中質粒pBluescript-II、大腸桿菌JM109感受態細胞、含有kocin抗性編碼基因質粒和乳酸克魯維酵母GG799及其表達載體pKLACl均為購買得到(New EnglandBiolabs Inc.，MA, USA)；本實施方式中涉及引物合成與基因合成的部分由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應試劑均為購買得到(寶生物工程有限公司，大連，中國)；本實施方式在具體操作中涉及使用的試劑盒均按說明書操作(寶生物工程有限公司，大連，中國)。本實施方式步驟三中氨芐抗性的LB固體培養基每IOOOmL由50 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg NaCl的和余量的水組成，pH值為 6. 0 8. O。本實施方式步驟四中構建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799的篩選過程將轉化乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞的產物稀釋后涂布于含有10mmOl/LCaCl2和50 μ g/ mLZeocin的YPD固體培養基中，挑取生長的陽性菌落，接種到含有1 Ommol/LCaCl2和50 μ g/ mLZeocin的YPD液體培養基中擴培后用于鑒定；PMRl基因缺陷型菌株與野生型菌株相比生長緩慢，在鈣離子缺陷培養基中和含有EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)的培養基中無法正常生長，通過添加鈣離子可緩解或彌補缺陷型菌株的生長缺陷，以此對缺陷型菌株進行表型鑒定。本實施方式步驟五中野生型犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示； 步驟五中優化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，總計有編碼315個氨基酸的密碼子被優化，其中333個核苷酸發生改變。本實施方式步驟六中氨芐抗性的LB液體培養基中每IOOOmL由50 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg NaCl的和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。本實施方式步驟六中獲得含有多個皺胃酶基因串連表達框的乳酸克魯維酵母 GG799PMR1基因缺陷型轉化株，即完成產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建的過程及效果驗證將化學法轉化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞的轉化產物稀釋后均勻涂布于含有5mmol/L乙酰胺和10mmol/LCaCl2的YCB瓊脂培養基中30°C培養 48h，挑取菌落擴培后，用試劑盒提取陽性轉化子的DNA，對陽性克隆進行PCR鑒定；通過PCR 的方法分別篩選出了含有多個皺胃酶基因串連表達框的乳酸克魯維酵母GG799PMR1基因缺陷型轉化株；將篩選出來的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉化株接種于含有 IOmm0VLCaCl2 WYPD培養基中進行重組皺胃酶的表達，用Arima法檢測培養基中重組皺胃酶的活力為860U/mL。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成
權利要求
1.一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法按以下步驟進行一、根據Genebank中發表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列設計上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得乳酸克魯維酵母 GG799 的 PMRl 基因；二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質粒pBluescript-II同時用MeI和Xho I 進行雙酶切，回收所需目的片段并進行連接，獲得連接產物pBluescript-11-PMRl ；三、連接產物pBluescript-11-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pBluescript-11-PMRl，經PCR、酶切和測序鑒定后再用Avr II酶切重組質粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質粒，回收所需目的片段連接得構建重組質粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質粒pBluesk_Z-PMRl轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選陽性克隆用于重組質粒PBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質粒pBluesk-Z-PMRl分別用MeI和Bio I進行線性化，回收并純化雙酶切產物，然后轉化乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，構建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799，所得重組菌株即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進行密碼子優化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達密碼子，然后進行全基因合成，得優化犢牛皺胃酶基因，然后轉入PMD18-T載體，獲得含有優化犢牛皺胃酶基因的pMDIS-T載體；六、用MlI和Not I分別雙酶切含有優化犢牛皺胃酶基因的pMDIS-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達載體pKLACl，回收純化目的片段并進行連接得重組質粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆液體搖瓶培養后提取重組質粒pKLACl-S-chymosin， 經PCR、酶切和測序鑒定后再用Mc II進行線性化，回收并純化酶切產物，然后采用化學法轉化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，獲得含有多個含皺胃酶基因串連表達框的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉化株，即完成產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3‘ ，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟一中PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成
3.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因的雙酶切體系如下
4.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中質粒pBluescript-II的雙酶切體系如下
5.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中連接的體系如下成分用量IOxT4 Buffer2 |iL酶切后的乳酸克魯維酵母GG7992|iL的PMRl基因酶切后的質粒pBluescript-II15|iLT4DNA連接酶Ιμ 連接條件為16°C連接過夜。
6.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中重組質粒PBluescript-II-PMRl的酶切體系如下成分用量重組質粒 pBluescript-11-PMRl20μLAvrW5μ IOxBufFerΙΟμ ddH2065 μ 酶切條件為37°C，2 汕。
7.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中含有kocin抗性編碼基因質粒的酶切體系如下成分用量含有Zeocin抗性編碼基因質粒20|iLAvrW5μ IOxBufFerΙΟμ ddH2065 μ 酶切條件為37°C，2 汕。
8.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中連接的體系如下成分用量IOxT4 Buffer2 |iL酶切后的含有Zeocin抗性編碼基15|iL因質粒酶切后的重組質粒2|iLpBluescript-11-PMRlT4DNA連接酶Ιμ 連接條件為16°C連接過夜。
9.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟四中重組質粒PBluesk-Z-PMRl的線性化體系如下
10.根據權利要求1所述的一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，其特征在于步驟六中含有優化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體的雙酶切體系如下成分含有優化犢牛皺胃酶基因的pMD18-T載體 Sal I Notl IOxBuffer ddH20
全文摘要
一種產皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構建方法，它涉及一種產皺胃酶工程菌株的構建方法。方法擴增得到的GG799的PMR1基因插入質粒pBluescript-II中得重組質粒pBluescript-II-PMR1，然后插入Zeocin抗性編碼基因得重組質粒pBluesk-Z-PMR1，線性化后再轉化乳酸克魯維酵母GG799感受態細胞，構建GG799 PMR1基因缺陷型菌株；優化犢牛皺胃酶基因并插入GG799表達載體pKLAC1中得重組質粒pKLAC1-S-chymosin，線性化后轉化PMR1基因缺陷型GG799感受態細胞即完成。本發明中所得的重組乳酸克魯維酵母可用來生產制造干酪用的重組皺胃酶。
文檔編號C12R1/645GK102174559SQ20111005390
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者馮鎮, 張蘭威 申請人:東北農業大學