可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸的酵母菌的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種釀酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae)的生物純培養物，其培養物具有可高量生產乳酸的特征性質。本發明亦提供一種包含制備所述生物純培養物的方法，及一種用于產生乳酸的方法。
【專利說明】可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸的酵母菌
【技術領域】
[0001]本發明關于乳酸的生產技術，詳細的，關于用于高量生產乳酸的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及方法。
【背景技術】
[0002]傳統乳酸生產是使用乳酸菌(Lactobacillus spp.)發酵而得,但乳酸菌的培養須使用復合式培養基，所述復合式培養基的成本高，除了增加發酵過程的成本外，亦增加自發酵液中分離純化乳酸的成本。然而，若欲應用以乳酸為單體所聚合成的聚乳酸于日用塑料中，生產乳酸的成本必須降低，因此，許多研究開始嘗試改良菌種，例如使用釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進行微生物發酵以生成乳酸。釀酒酵母菌的原生菌株無法進行乳酸發酵，因此在1994年Dequin等人透過基因工程，于釀酒酵母菌的細胞內表現外源乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)，使釀酒酵母菌可利用葡萄糖發酵生產乳酸(B1technology (New York), Feb.1994,12:ρ.173-177),此為利用酵母菌生產乳酸的第一篇報導文獻。
[0003]可做為發酵碳源的生質原料來源相當廣泛,包含糖質(sugar)、淀粉(starch)及木質纖維素(Iignocellulose),其中利用糖質或淀粉原料做為發酵碳源以生產乳酸、有機酸或酒精等生質能源與材料的技術已十分成熟，然而，因糧食供給壓力與谷物成本上漲，利用糖質或淀粉原料生產生質能源或材料并不經濟且不符期待，因此產業界積極投入發展以木質纖維素做為碳源而生產生質材料或能源。
[0004]五碳醣是半纖維素的主要組成之一，在植物纖維中含量可達到30%，因此，有效利用木醣并轉化為目標產物是使用木質纖維素為碳源的重要關鍵。以纖維素酒精工業發展為例，酒精工業上最廣為應用的原生釀酒酵母無法代謝五碳醣，因此從80年代開始科學家便利用基因工程技術或是馴化菌株方法改善酵母菌或細菌來發酵木醣等五碳醣生產酒精，其中以Nancy Ho等人最早揭露制備釀酒酵母菌的方法(美國實用專利第5789210號)，解決了培養成本以及使用混合碳源的問題，Nancy Ho等人利用基因轉殖技術，使酵母菌帶有并表現木醣還原酶(xylose reductase,XR)、木醣醇脫氫酶(xylose dehydrogenase,XDH)以及木酮醣激酶(xylulokinase，XKS)基因，此種重組酵母菌株可將木醣發酵為酒精。
[0005]于2001 及 2002 年，Nature Works LLC(美國實用專利第 7109010 及 7141410 號)分別揭露使用基因轉殖技術，讓原生菌株可代謝木醣的酵母菌Kluyveromyces marxianus以及Candida sonorensis表現外源乳酸脫氫酶，使其可將木醣發酵生成乳酸，但其產率低，約僅有5%至34%。至2004年Cargill Inc (美國實用專利第7943366號)揭露藉由剔除Kluyveromyces marxianus及Candida sonorensis原本的五碳醣代謝基因木醣還原酶(xylose reductase, XR)及木醣醇脫氫酶(xylose dehydrogenase, XDH),轉而表現木酮醣激酶(xylulokinase, XKS)以及外源木醣異構酶(xylose isomerase, XI),以提升所述酵母菌利用木醣發酵生成乳酸的能力，產率可達79 %。此技術雖然提升乳酸的產率，但Kluyveromyces marxianus 及 Candida sonorensis 并非一般常用的發酵菌種。
[0006]于2006 年，Takahashi 等人將 Saccharomyces cerevisiae 的原生 F1DCl 以及H)C5基因置換成LDH，讓酵母菌株可代謝葡萄醣生成乳酸，其產率雖可達81.5%，但此種菌株生長慢，且發酵速率慢，需時200小時才可達到最高產率(B1sci B1technolB1chem.2006May ；70(5):1148-53)，并不符合快速生產的要求。綜上，習知技術利用菌種改良所開發出的乳酸生產技術，其產率或生產過程雖已有提升，惟用于量產時，可使用的碳源仍受限，故開發出一種可以產生更高乳酸產量的菌株，以及可以產生更高乳酸產量的低成本生產方式仍有其需求。
【發明內容】
[0007]本發明提供一可高量生產乳酸的酵母菌，由于釀酒酵母菌具有培養容易且發酵能力強等許多優勢，本發明利用基因改質方式，使釀酒酵母菌可利用木醣發酵生成乳酸，且提高產率至約80%。
[0008]本發明提供一種微生物菌株的生物純培養物，其中所述微生物菌株源自釀酒酵母菌FENC-05并包含至少一套數的外源乳酸脫氫酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生產乳酸的產率為大于約75%，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖；及所述釀酒酵母菌FENC-05根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM25508。
[0009]本發明亦提供一種制備根據前述的生物純培養物的方法，其包含將所述外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，并篩選利用碳源生產乳酸的產率大于約75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0010]本發明再提供一種生產乳酸的方法，其特征在于一培養基中培養根據前述的微生物菌株的生物純培養物，并自所述生物純培養物獲得乳酸，其中所述培養基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0011]在以下部分中詳細描述本發明。可在以下【【具體實施方式】】及權利要求書中容易地發現本發明的其它特征、目的及優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1顯示pFENC-ΟΙ的質體圖譜。
[0013]圖2顯示pFENC-LOl的質體圖譜。
[0014]圖3顯示pFENC-Cre的質體圖譜。
[0015]圖4顯示pFENC-L02的質體圖譜。
[0016]圖5顯示FENC-Sc5dPL_4LK的乳酸脫氫酶蛋白質的蛋白質電泳圖及西方墨點法結果圖。
【具體實施方式】
[0017]參考以下對本發明的各方面、實例及伴隨相關描述的化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地了解本發明。在揭示與描述本發明的化合物、組合物和/或方法之前，應了解，除非由權利要求書另外特別地指出，否則本發明不受限于特定制備方法、載劑或調配物或將本發明化合物調配成用于局部、經口或非經腸投予的產物或組合物的特定模式，這是由于所屬領域的一般技術人員非常清楚這些事情是可以加以變化的。還應了解，本文所用的術語僅用于描述特定方面的目的而不意在用于限制本發明的范圍。
[0018]除非另外指出，否則如本發明所用的以下術語應解釋為具有以下含義。
[0019]如本文所用的術語「乳酸」是指2-羥基丙酸，其是多種生物化學過程中重要的化合物。乳酸為含有羥基的羧酸，其分子式為c3h603。乳酸有兩種旋光異構體，一個為L_(+)_乳酸或(S)-乳酸，另一個為D-(-)-乳酸或(R)-乳酸。于本發明的優選具體例中，乳酸指L- (+)-乳酸或(S)-乳酸。
[0020]本發明所言的「純培養物」乙詞指只有一種微生物的培養物，如果某一培養物是由單一微生物細胞繁殖產生的，就稱為所述微生物的純培養物。
[0021]范圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類范圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值的范圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應了解特定值可形成另一態樣。另外應了解，每一范圍的各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。
[0022]「視情況」或「視情況地」意謂隨后所述的事件或狀況可能發生或可能不發生，且所述描述包括所述事件或狀況發生的情況及其未發生的情況。舉例而言，「視情況包含試劑」意謂所述試劑可能存在或可能不存在。
[0023]根據本發明中乳酸的產率測定可為一般的測定方法，具體來說，可利用高效率液相層析儀(HPLC)定量。于下文中所言的乳酸產量是將酸酵后所得的樣品，經離心過濾，所得的濾液再經HPLC定量所得的數值。HPLC進行分析的條件為:管柱為TranSgen0miCS87Hcolumn,管柱溫度設定為65°C,移動相則為5mM H2SO4J^速為0.6mL/min。
[0024]必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利范圍中所用的單數形式「一」及「所述」包括復數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括復數且復數術語應包括單數。
[0025]本發明提供一種微生物菌株的生物純培養物，其中所述微生物菌株源自釀酒酵母菌FENC-05并包含至少一套數的外源乳酸脫氫酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生產乳酸的產率為大于約75%，優選為約75%至約80% ;及所述釀酒酵母菌FENC-05根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM25508。
[0026]本發明所言的「外源」乙詞指來源并非釀酒酵母菌野生種，亦即自然界不存在于釀酒酵母菌中。
[0027]本發明所言的「乳酸脫氫酶基因」乙詞指其編碼的產物為具有乳酸脫氫酶活性，其中乳酸脫氫酶具有催化丙酮酸與乳酸間的轉換能力，或具催化還原型煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸與其氧化型之間的轉換能力。因乳酸具有L- (+)-乳酸以及D-(-)-乳酸兩種旋光異構體，L_(+)_乳酸由L-乳酸脫氫酶生成，D-(-)_乳酸由D-乳酸脫氫酶生成，優選地，所述乳酸脫氫酶為由L-乳酸脫氫酶基因所編碼。
[0028]根據本發明的外源乳酸脫氫酶基因可為已經譯碼或未經譯碼的完整基因或其功能性片段。于本發明的一優選具體實施例中，所述外源乳酸脫氫酶基因源自牛。
[0029]由于每個物種進行胺基酸序列轉譯時，都有其慣用的核酸密碼子(codon)，因此，如欲于細胞內表現外源基因時，若直接使用原始物種基因序列，會因為密碼子無法被宿主細胞辨識而無法轉錄、轉譯成蛋白質，因此于本發明的一優選具體實施例中，所述外源乳酸脫氫酶是以小牛(bovine)的乳酸脫氫酶基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子數據庫(http://www.kazusa.0r.jp/codon/),將來自牛的乳酸脫氫酶基因編碼修改成易于酵母菌細胞辨識的人造序列(artificial sequence),并示于SEQ ID N0.11,使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的乳酸脫氫酶蛋白質。
[0030]根據本發明的所述外源乳酸脫氫酶基因可由釀酒酵母菌固有的啟動子啟動，或為外源啟動子所啟動。優選地，所述外源乳酸脫氫酶是由釀酒酵母菌固有的啟動子啟動；由于所述外源乳酸脫氫酶與碳源的利用相關，故更優選地，所述外源乳酸脫氫酶由與碳源利用相關的釀酒酵母菌固有的啟動子啟動；尤優選地，所述外源乳酸脫氫酶是經丙酮酸脫羧酶I啟動子所調控。
[0031]于本發明的優選具體實施例中，所述外源乳酸脫氫酶基因取代釀酒酵母菌中原生的丙酮酸脫羧酶I 結構基因，并由完整的丙酮酸脫羧酶I啟動子所調控。
[0032]于本發明的一優選具體實施例中，所述微生物菌株為釀酒酵母菌，另包含至少一套數的五碳醣代謝基因。優選地，所述五碳醣代謝基因是選自由木醣還原酶、木醣醇脫氫酶、木酮醣激酶及木醣異構酶所組成的群。
[0033]于本發明的一優選具體實施例中，所述生物純培養物包含釀酒酵母菌FENC-Sc5dPL-4LK,根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM26705。
[0034]FENC-Sc5dPL-4LK菌株相較于母株FENC-05，其使用包含五碳糖及六碳糖的碳源發酵時，酒精轉換率只剩下10%，而乳酸產率可達到80%。
[0035]本發明亦提供一種制備根據前述的生物純培養物的方法，其包含將所述外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，并篩選利用碳源生產乳酸的產率大于約75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0036]于本發明的一優選具體實施例中，所述方法包含剔除釀酒酵母菌的丙酮酸脫羧酶1，并使所述外源乳酸脫氫酶基因經丙酮酸脫羧酶I啟動子所調控。
[0037]根據本發明的方法，篩選生產乳酸的產率大于約75%的微生物菌株的方法，可直接測定乳酸的產率或篩選外源乳酸脫氫酶基因套數較多的微生物菌株，優選篩選外源乳酸脫氫酶基因套數較多的微生物菌株，于本發明的一優選具體實施例中，可利用含碳酸鈣的培養基進行篩選。因乳酸脫氫酶基因套數較多的微生物菌株可產生較多乳酸，且乳酸會與碳酸鈣反應，形成溶解度較碳酸鈣高的乳酸鈣，故在可產生乳酸的微生物菌落周圍，原本呈現白色的含碳酸鈣培養基會變成透明，形成一透明圈。因此，藉由挑選透明圈較大的微生物菌株，可得到乳酸產率較高的微生物菌株。另一方面，其中所述篩選方法可為同時轉殖一報導基因，并藉由測定所述報導基因的表現而測定。于本發明的一優選具體例中，所述報導基因為一抗藥性基因。
[0038]于本發明的具體實施例中，剔除釀酒酵母菌株FENC-05的原生丙酮酸脫羧酶1，并同時以外源乳酸脫氫酶基因取代原本丙酮酸脫羧酶基因的位置，使得乳酸脫氫酶表現受到原本丙酮酸脫羧酶I啟動子的調控，得到重組酵母菌株FENC-5dPLK。接著以Cre/loxp系統，移除菌株的抗藥性基因，得到FENC-5dPL使得菌株可以再次進行外源乳酸脫氫酶轉殖，讓外源乳酸脫氫酶伴隨抗藥性基因以隨機的方式，插入酵母菌基因體中，接著以含有高抗生素濃度的培養基篩選出抗藥性較高的菌株，以挑選出含有較多乳酸脫氫酶套數的酵母菌株，即為 FENC-Sc5dPL-4LK。
[0039]本發明再提供一種生產乳酸的方法,其特征在于一培養基中培養根據前述的微生物菌株的生物純培養物，并自所述生物純培養物獲得乳酸，其中所述培養基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0040]于本發明的優選具體例中，所述六碳糖是選自由葡萄糖、果糖(Fructose)、半乳糖(Galactose)及甘露糖(Mannose)所組成的群。
[0041]另一方面，于本發明的優選具體例中，所述五碳糖是選自由木糖及阿拉伯糖所組成的群。
[0042]根據本發明的方法可以本發明所屬【技術領域】中具通常知識者熟知的方式進行酸酵。培養優選為批次培養或饋料批次培養。其具體培養基的調配及培養條件的決定為本發明所屬【技術領域】中具通常知識者基于本發明說明書的揭示而可決定者。
[0043]根據本發明，乳酸存在于微生物中或培養基中。本發明的方法進一步包含自液體培養基中回收乳酸的步驟。可以一般本發明所屬【技術領域】中具通常知識者熟知的方式進行回收。
[0044]以下的非限制性的實例有助于本發明所屬【技術領域】中具通常知識者實施本發明。所述等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬【技術領域】中具有通常知識者可在不背離本發明的精神或范疇的情況下對本文所討論的實施例進行修改及變化，而仍屬于本發明的范圍。
[0045]SM
[0046]木醣代謝相關基因選殖及重組質體建構
[0047]本實例中木醣代謝相關基因選殖工作是利用聚合酶連鎖反應(Polymerase chainreact1n, PCR)進行。首先以 SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4 的引子組合，并以釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，選殖出pGK啟動子及pGK終結子；以 SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8 的引子組合，從 Pichiastipitis細胞中，選殖出木醣還原酶(XR)、木醣醇脫氫酶(XDH)基因；&SEQ ID N0.9/SEQID N0.10引子組合，并以釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，以PCR選殖木酮醣激酶(XKS)基因，將以上核酸片段以適當的限制酶切位共同構筑至PAUR101質體中，即完成木醣相關基因重組載體的建構，所得的質體為pFENC-01 (如圖1所示)。
[0048]建構可將roci基因置換成乳酸脫氫酶基因(LDH)的質體pFENC_L01
[0049]將Takahashi等人的方式稍做修改,建立基因轉殖載體,將LDH基因表現卡匣插入酵母菌染色體上 PDCl 的位置(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROB1LOGY, Apr.2005，p.1964-1970)，做法如下:
[0050]乳酸脫氫酶LDH全基因合成
[0051]以小牛(bovine)的LDH基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子數據庫(http://www.kazusa.0r.jp/codon/),將來自牛的LDH基因編碼修改成易于酵母菌細胞辨識的人造序列SEQ ID N0.11，使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的LDH蛋白質。
[0052]依照SEQ ID-1l的序列以PCR進行乳酸脫氫酶的全基因合成。
[0053]建構基因置換質體pFENC-LOl
[0054]分別以SEQ ID N0.12/SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14/SEQ ID N0.15 以及 SEQ IDN0.16/SEQ ID N0.17為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，進行PCR選殖部分roCl啟動子片段(400bp) ,PDCl終結子片段以及ENOl終結子；以SEQ ID N0.18/SEQ ID N0.19為引子組合，pFa_KanMX6質體為模板，進行PCR選殖抗G418基因表現卡匣，并使其帶有1xp序列。將上述核酸片段與LDH基因片段以及載體pBluescript II KS(-)以適當限制酶切位進行接合，得到基因置換質體pFENC-LOl (如圖2所示)。
[0055]建構Cre/1οχρ基因移除系統的重組酶表現質體pFENC-Cre
[0056]將Hegemann等人的方式稍做修改，建立酵母菌基因移除系統(Nucleic AcidsResearch, 1996，Vol.24，N0.132519-2524)，做法如下:
[0057]重組酶Cre全基因合成
[0058]以曬菌體 Pl (Enterobacteria phage Pl, NCBI Reference Sequence:YP_006472.1)的Cre基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子數據庫(http://www.kazusa.0r.jp/c odon/),將來自曬菌體Pl的Cre基因編碼修改成易于酵母菌細胞辨識的人造序列SEQ ID N0.20，使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的Cre蛋白質。依照SEQ ID N0.20的序列以PCR進行Cre的全基因合成。
[0059]建構重組酶Cre誘導表現質體pFENC-Cre
[0060]以SEQ ID N0.21/SEQ ID N0.22 為引子組合，pFa_KanMX6 質體為模板，進行 PCR選殖抗G418基因表現卡匣；以SEQ ID N0.23/SEQ ID N0.24為引子組合，pFa6a_Hyg質體為模版，進行PCR選殖抗Hygromycine基因表現卡匣；以SEQ ID N0.25/SEQ ID N0.26為引子組合，pYDl(Invitrogen)質體為模板，進行PCR選殖GALl啟動子片段；分別以SEQ ID N0.16/SEQ ID N0.17為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，進行PCR選殖ENOl終結子；以SEQ ID N0.27/SEQ ID N0.28為引子組合，pSosColI (AgilentTeclmologies)質體為模板,進行PCR選殖2u ori片段。將上述核酸片段與Cre基因片段及載體PUC19以適當限制酶切位進行接合，得到重組酶Cre誘導表現質體pFENC-Cre (如圖 3 所示)。
[0061]建構乳酸脫氫酶基因LDH表現質體pFENC-L02
[0062]分別以SEQ ID N0.29/SEQ ID N0.30 以及 SEQ ID N0.31/SEQ ID N0.32 為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，進行PCR選殖出酵母菌逆轉座子(retrotransposon) Delta 序列基因片段；以 SEQ ID N0.33/SEQ ID N0.13 為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取的基因庫為模板，進行PCR選殖完整roCl啟動子(900bp);以SEQ ID N0.34/SEQ ID N0.35為引子組合，質體pFENC-LOl為模板，進行PCR選殖抗G418基因表現卡匣；以限制酵素Avrll/BamHI對質體pFENC-LOl進行酶切反應，得到LDH-EN01終結子；將上述核酸片段與載體PUC19以適當限制酶切位進行接合，得到質體pFENC-L02(如圖4所示)。
[0063]建構可同時代謝葡萄醣以及木醣的酵母菌株FENC-05
[0064]將pFENC-ΟΙ質體以化學法轉殖至工業用酵母菌株(釀酒酵母菌BCRC22743)中(Tranformat1n of yeast by the LiAC/SS carrier DNA/PEG method.Methods inEnzymology,2002,350,p.87-96.)，以含 0.5μ g/L Aureobasidin A 的 YPD 固態培養基(1%酵母萃取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂)篩選轉型株，置于30°C培養，從轉型株中挑出代謝五碳醣能力優選的酵母菌株FENC-05，FENC-05根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM25508。
[0065]剔除FENC-05的原生I3DCl基因，并同時在所述基因座位置放入LDH基因，建立菌株 FENC-5dPL
[0066]以電穿孔方式將質體pFENC-LOl酶切片段送入酵母菌FENC-05的細胞中
[0067]以限制酵素BssHII對質體pFENC-LOl進行酶切反應，將所得帶有LDH基因編碼的核酸片段，以電穿孔方式(1.5kV, 200ohm, 25uF, 2mm cuvette)送入酵母菌細胞內，并且以含300 μ g/mL G418的YPD固態培養基篩選對G418具有抗性的轉殖株。
[0068]以碳酸鈣培養基篩選出roCl基因被置換成LDH基因的轉殖株
[0069]將對G418具有抗性的轉殖株轉移到含0.5%碳酸鈣的YPD固態培養基進行培養，由于BssHII酶切pFENC-LOl片段上只帶有部分I3DCl啟動子(400bp)，并不足以驅使LDH表現，因此，唯有完成以LDH基因取代原生roCl序列的轉殖株，其LDH基因才能受到完整原生roCl啟動子序列調控而表現，產生乳酸，并在碳酸鈣培養基上產生透明圈(clear zone) 0將會產生透明圈的菌株5dP5LK-10進行產孢培養(sporulat1n);先在YPK培養基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母萃取物， 10g/L KAc)中培養16小時，再將菌體移至SPM培養基(10g/LKAc, I g/L酵母萃取物，0.5g/L葡萄糖，0.05g/L腺苷，0.05g/L尿苷，0.1 g/L色胺酸，0.1 g/L亮胺酸，0.1 g/L組胺酸)，30°C培養5-7天進行產孢；將SPM菌液涂在YPD固態培養基上以挑選出單一菌落，將單一菌落轉移至含有0.5%碳酸鈣的YPD固態培養基進行培養，挑選出透明圈有變大的菌株，表示其基因體上的兩套roCl基因皆已置換成LDH基因，所述菌株為5dP5LK-10S8。
[0070]以Cre/loxP系統移除5dP5LK_10S8菌株的抗藥性基因，建立菌株FENC_5dPL[0071 ] 以電穿孔方式將質體pFENC-Cre轉殖入5dP5LK_10S8中，以含有300 μ g/mLHygromycin的YPD固態培養基篩選轉殖成功的菌株，以2% SG固態培養基(20g/L半乳糖，
6.7g/LYNB, 20g/L瓊脂)培養轉殖株，誘導Cre表現，進行抗G418抗藥性基因移除。將從2% SG培養基中長出的菌落分別移至含有300 μ g/mL G418或是300 μ g/mL Hygromycin的YPD固態培養基，確認其無法生長，表示已完成抗藥性基因移除以及pFENC-Cre丟失；得到菌株 FENC-5dPL。
[0072]建構高LDH表現量的菌株FENC-Sc5dPL_4LK
[0073]以電穿孔方式將質體pFENC-L02酶切片段送入酵母菌FENC_5dPL細胞中
[0074]以限制酵素XhoI對質體PFENC-L02進行酶切反應，將所得帶有LDH基因編碼的核酸片段，以電穿孔方式(1.5kV，200ohm，25uF，2mm cuvette)轉殖入FENC_5dPL細胞內，并且以含4000 μ g/mL G418的YPD固態培養基篩選對高濃度G418具有抗性的轉殖株。
[0075]以碳酸鈣培養基篩選出可能具有高LDH表現以及高乳酸產率特性的轉殖株
[0076]將對高濃度G418具有抗性的轉殖株移至碳酸鈣培養基進行培養，挑選出透明圈比 FENC-5dPL 大的轉殖株 FENC-Sc5dPL_4LK。
[0077]功效驗證:
[0078]FENC-5dPL 發酵測試:
[0079]1.前培養1:挑選單一菌落，以2mL YPD(10g/L酵母萃取物；20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)進行培養7小時，300C，200rpm。
[0080]2.前培養2:將前培養I菌液倒入10mL YPD60 (10g/L酵母萃取物；20g/L蛋白胨，60g/L葡萄糖)中，培養24小時，30°C，200rpm。
[0081]3.菌體制備:將前培養2的菌液以8000rpm離心，去掉培養基，以二次水清洗兩次，再以5mL 二次水懸浮菌體，測定0D600。
[0082]4.發酵:發酵液體積100mL(60g/L葡萄糖、35g/L木醣、lg/L尿素)；FENC_5dPL組別另外加入3%碳酸鈣。取適量菌體懸浮液，以0D12接種至發酵液中。以水封管封口，30°C，200rpm培養72小時。
[0083]5.發酵液成分分析:
[0084](I)依時間點取ImL發酵液，以13，200rpm離心，取上清液以0.22 μ m/PVDF無菌丟棄式過濾器過濾后，以二次水稀釋五倍。
[0085](2) HPLC 分析:Transgenomics87H column65°C, 5mM H2SO4,0.6mL/min。
[0086](3)產率(yield)計算:(產物濃度/起始總醣量)xlOO %,其結果示于表1及表2。
[0087]表1:發酵產物量
[0088]
【權利要求】
1.一種微生物菌株的生物純培養物，其中所述微生物菌株源自釀酒酵母菌FENC-05并包含至少一套數的外源乳酸脫氫酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生產乳酸的產率為大于75%，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖；及所述釀酒酵母菌FENC-05根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM25508。
2.根據權利要求1所述的生物純培養物，其中所述外源乳酸脫氫酶基因具有SEQIDN0.11所示的序列。
3.根據權利要求1所述的生物純培養物，其中所述外源乳酸脫氫酶基因經丙酮酸脫羧酶I啟動子所調控。
4.根據權利要求1所述的生物純培養物，其中所述微生物菌株另包含至少一套數的五碳醣代謝基因。
5.根據權利要求4所述的生物培養物，其中所述五碳醣代謝基因是選自由木醣還原酶、木醣醇脫氫酶、木酮醣激酶及木醣異構酶所組成的群。
6.根據權利要求1所述的生物純培養物，其中所述微生物菌株為FENC-Sc5dPL-4LK，根據布達佩斯條約寄存于德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM26705。
7.一種制備根據權利要求1至6任何一項所述的生物純培養物的方法，其包含將所述外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，并篩選利用碳源生產乳酸的產率大于約75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
8.根據權利要求7所述的方法，其包含剔除釀酒酵母菌的丙酮酸脫羧酶1，并使所述外源乳酸脫氫酶基因經丙酮酸脫羧酶I啟動子所調控。
9.一種生產乳酸的方法，其特征在于一培養基中培養根據權利要求1至6任何一項的微生物菌株的生物純培養物，并自所述生物純培養物獲得乳酸，其中所述培養基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述六碳糖是選自由葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖所組成的群。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述五碳糖是選自由木糖及阿拉伯糖所組成的群。
12.如權利要求9所述的方法，其進一步包含自所述培養基中回收乳酸的步驟。
【文檔編號】C12N1/19GK104073448SQ201310288914
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】呂立婷, 黃德仁 申請人:遠東新世紀股份有限公司