專利名稱：豬微衛星標記的復合擴增的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬微衛星標記的復合擴增的方法及其專用引物。
背景技術：
微衛星(microsatellite)，一般指基因組中由短的重復單元(一般為1 6個堿基)組成的DNA串聯重復序列。微衛星標記(microsatellite)，又稱為短串聯重復序列 (simple tandem repeats, STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeats)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由2 6個核苷酸的串聯重復片段構成，由于重復單位的重復次數在個體間呈高度變異性并且數量豐富，因此微衛星標記的應用非常廣泛。微衛星標記在目前應用極為廣泛，具有以下顯著特點1)在高等動物的基因組內存在廣泛的分布，據文獻報道大約每間隔10-50kb就存在著一個微衛星標記；2)遺傳穩定， 符合孟德爾遺傳定律，多態性高，信息含量豐富，許多微衛星位點都具有5個以上的等位基因；3)呈共顯性遺傳，易于區分純合型和雜合型；4)通過PCR擴增和電泳分型，可以直接獲得個體基因型，檢測所需檢材量少，靈敏度成功率高；5)大部分微衛星標記是位于基因組非編碼區內的，不受自然和人工選擇的影響，是一種中性標記。因此，在人類法醫學鑒定、動物系譜分析和個體及親緣關系鑒定、分析群體的遺傳結構及群體間的遺傳距離、監測育種和遺傳操作效應、構建基因圖譜、尋找與動物各個性狀位點連鎖的分組遺傳標記等方面，微衛星標記具有重要的作用。微衛星標記的檢測包括DNA的提取、PCR擴增和基因型分型三個步驟。針對親子鑒定、個體鑒定、遺傳變異分析、系譜鑒定及育種選擇等情況，通常需要對多個微衛星位點進行擴增和檢測以達到所要求的精確度，這樣實驗成本高昂、費時長、工作量大。借助復合擴增技術(mutiplex PCR)能顯著提高檢測效率并極大的降低實驗成本。其原理是，在同一個反應試管或者反應體系中加入多對引物，同時擴增檢測多個目標序列，從而大大的減少了多次單獨PCR擴增和檢測的費用，縮短了實驗時間、成本，提高了檢測效率。然而，為了保證多個目的片段同時在一個PCR反應體系中特異性擴增，引物組合的選擇以及反應條件的優化就格外重要了。這就需要多次反復的實驗來摸索了。微衛星的不同等位基因往往只是相差2到5個堿基，因此就需要高分辨率的電泳來區分。分型方法最早是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合放射自顯影或者硝酸銀染色來進行的，這種方法操作復雜且分型的條帶不易讀取，準確率差；自上世紀末以來，熒光標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光標記毛細管電泳逐漸興起并替代傳統方法，其操作方便、準確率也大大提高。針對多個位點，采用不同顏色的熒光標記引物，利用基于熒光掃描技術的遺傳分析儀，結合分子量標準自動計算等位基因大小，能夠實現高通量和半自動化的微衛星分型。目前，微衛星標記檢測試劑盒在一些物種上已經商業化了，如人親子鑒定的檢測試劑盒、牛的微衛星標記檢測試劑盒等等；但在豬上面并沒有出現。我國是世界上養豬生產和豬肉消費第一大國，近年來，隨著人們對親子鑒定技術的了解越來越多，許多民事和刑事案件中與豬相關的親權鑒定和個體識別檢驗要求也越來越多，另外養豬業也是我國畜牧業和農村支柱產業的重要組成部分，在豬遺傳育種方面，國內還相對薄弱；利用微衛星標記檢測對豬的親子鑒定、育種及生產有重大的意義
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于豬微衛星標記的復合擴增的引物組合物。本發明提供的引物組合物由引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10組成；其中，弓丨物對1由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA組成；引物對2由序列表中序列3所示的DNA和序列表中序列4所示的DNA組成；引物對3由序列表中序列5所示的DNA和序列表中序列6所示的DNA組成；引物對4由序列表中序列7所示的DNA和序列表中序列8所示的DNA組成；引物對5由序列表中序列9所示的DNA和序列表中序列10所示的DNA組成；引物對6由序列表中序列11所示的DNA和序列表中序列12 所示的DNA組成；引物對7由序列表中序列13所示的DNA和序列表中序列14所示的DNA 組成；引物對8由序列表中序列15所示的DNA和序列表中序列16所示的DNA組成；引物對 9由序列表中序列17所示的DNA和序列表中序列18所示的DNA組成；引物對10由序列表中序列19所示的DNA和序列表中序列20所示的DNA組成。上述引物組合物中，每對引物對中的兩條引物之間的摩爾比為1 1。進一步，上述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、 引物對8、引物對9和引物對10的摩爾比是5 :1:4:3:7:4:3:4:5:4。上述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對 8、引物對9和引物對10均單獨包裝或整體包裝。含有上述引物組合物的試劑盒也屬于本發明的保護范圍之內。本發明的另一目的在于提供一種豬微衛星標記的復合擴增方法。本發明提供的豬微衛星標記的復合擴增方法，包括如下步驟用上述引物組合物進行PCR擴增。上述PCR擴增條件是95 V預變性5min，95 V變性30s，56 V退火30s，72 V延伸 30s，35個循環，最后72°C延伸lOmin。上述豬微衛星標記選自下述10個微衛星位點中的至少一個位點SW240、SW951、 SW857、S0155、S0386、SW902、S0101、S0225、S0227 和 S0355。上述的復合擴增方法在動物個體識別和/或親子鑒定中的應用也屬于本發明的保護范圍之內。上述動物可以為豬。實驗證明實施例3步驟一中用選取的特定比例的特定引物對進行復合擴增(圖 1-圖4)與實施例2單重PCR擴增得到的數據(表2、3和4)完全一致，從而證實了本發明提供的十重PCR的準確性與可行性。
圖 1 是 10 個微衛星位點 SW240、SW951、SW857、SO155、S0386、SW902、SO101、S0225、S0227、S0355的復合擴增在ABI3700測序儀的測序峰圖。圖2 是10個微衛星位點復合擴增的測序峰圖的分熒光顏色顯示，圖中所示為藍色熒光標記的SWMO、SO155、S0225和S0227位點峰圖。圖3 是10個微衛星位點復合擴增的測序峰圖的分熒光顏色顯示，圖中所示為綠色熒光標記的SW951、S0386和S0101位點峰圖。圖4 是10個微衛星位點復合擴增的測序峰圖的分熒光顏色顯示，圖中所示為黑色熒光標記的SW857、SW902和S0355位點峰圖。圖5 是對照組10個微衛星位點在各引物濃度一致的條件下復合擴增的測序峰圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1 微衛星標記的選擇標記選擇原則通用性美國豬基因組協作計劃推薦用于全球豬遺傳多樣性研究的微衛星標記；分布廣挑選的10個座位分布于10條染色體上；多態性在普通豬群中的等位基因數為5-22個。所選擇的微衛星標記及熒光標記如下表1 表1 豬微衛星檢測位點信息
權利要求
1.一種用于豬微衛星標記的復合擴增的弓丨物組合物，由引物對1、引物對2、引物對3、 弓I物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10組成；其中，引物對1由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA組成；引物對2 由序列表中序列3所示的DNA和序列表中序列4所示的DNA組成；引物對3由序列表中序列5所示的DNA和序列表中序列6所示的DNA組成；引物對4由序列表中序列7所示的DNA 和序列表中序列8所示的DNA組成；引物對5由序列表中序列9所示的DNA和序列表中序列10所示的DNA組成；引物對6由序列表中序列11所示的DNA和序列表中序列12所示的 DNA組成；引物對7由序列表中序列13所示的DNA和序列表中序列14所示的DNA組成；引物對8由序列表中序列15所示的DNA和序列表中序列16所示的DNA組成；引物對9由序列表中序列17所示的DNA和序列表中序列18所示的DNA組成；引物對10由序列表中序列 19所示的DNA和序列表中序列20所示的DNA組成。
2.如權利要求1所述的引物組合物，其特征在于所述引物組合物中，每對引物對中的兩條引物之間的摩爾比為1 1。
3.如權利要求2所述的引物組合物，其特征在于所述引物對1、引物對2、引物對 3、引物對4、弓I物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10的摩爾比是 5:1:4:3:7:4:3:4:5:4。
4.如權利要求1-3中任一所述的引物組合物，其特征在于所述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10均單獨包裝或整體包裝。
5.含有權利要求1-4中任一所述引物組合物的試劑盒。
6.一種豬微衛星標記的復合擴增方法，其特征在于，包括如下步驟用權利要求1-4中任一所述引物組合物進行PCR擴增。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件是95°C預變性5min， 95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，最后72°C延伸IOmin。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述豬微衛星標記選自下述10個微衛星位點中的至少一個位點SW240、SW951、SW857、SO155、S0386、SW902、S0101、S0225、S0227 和 S0355。
9.權利要求1-8中任一所述的方法在動物個體識別和/或親子鑒定中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述動物為豬。
全文摘要
本發明公開了一種豬微衛星標記的復合擴增的方法及其專用引物。本發明提供的引物組合物由引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10組成。實驗證明用選取的特定比例的特定引物對進行復合擴增與單重PCR擴增得到的數據完全一致，從而證實了本發明提供的十重PCR的準確性與可行性。本發明提供的復合擴增方法在豬親子鑒定、育種及生產有重大的意義。
文檔編號C12N15/10GK102154280SQ20111005583
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月8日 優先權日2011年3月8日
發明者凃政, 崔文濤, 張穎, 徐小玉, 程文科, 裴黎, 黃宏剛 申請人:公安部物證鑒定中心