用于中華鱘親子鑒定的ssr熒光標記引物及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于中華鱘親子鑒定的SSR熒光標記引物及應用，本發明成功篩選并合成10對熒光標記微衛星引物，該引物可以用于建立中華鱘親子鑒定技術，并且公開了所使用的親子鑒定的試劑盒。將所合成的不同熒光顏色的PCR產物混合后測定等位基因，進行中華鱘親子鑒定分析。本發明所述鑒定方法操作簡單、快捷、費用低廉，具有高效、經濟、簡便易行等特點，可以在中華鱘種質鑒定、家系管理和良種選育進行推廣應用，并可對人工增殖放流效果進行評估。
【專利說明】用于中華鱘親子鑒定的SSR熒光標記引物及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產養殖領域中的水產動物種質鑒定領域，具體涉及用于中華舞親子 鑒定的SSR熒光標記引物及應用。
【背景技術】
[0002] 中華舞（Acipenser sinensis)，隸屬于舞形目，舞科，舞屬，是一種在海洋中生長， 淡水中繁殖的大型海河洄游性原始古魚類，至今存活已有1.4億年歷史。該物種主要分布 在長江和珠江水系。目前珠江水系的中華舞已基本絕跡。葛洲壩修建后，阻斷了中華舞的 繁殖洄游通道，再加上過度捕撈，水域污染，生境退化，長江中華舞資源量也嚴重下降。2010 年，中華舞被列入瀕危物種保護紅皮書，是國家一級保護動物。
[0003] 微衛星 DNA (microsatellite)，又稱為簡單重復序列（Simple Sequence R印eats, SSR)，是指一類重復單位在2?6個堿基的重復序列。微衛星序列作為分子標記 有諸多優點：在真核基因組中分布廣泛、等位基因多、雜合度高；擴增片段短、擴增率高；靈 敏度比傳統的D NA指紋高得多，由于其結果可靠，方法簡單，省時省力，在親子鑒定和遺傳 多樣性研宄中微衛星標記技術正在逐步取代其他分子標記技術。目前國內外的科研工作者 已利用微衛星標記構建了人類、小鼠、大鼠及幾個植物等物種的染色體遺傳圖譜，并將微衛 星標記廣泛應于基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、繁殖育種以及進化研宄 等領域。
[0004] 目前，還沒有將微衛星分子標記應用到中華舞的親子鑒定和遺傳管理的報道。本 發明旨在利用微衛星熒光標記建立中華舞親子鑒定技術，為中華舞養殖場建立中華舞家系 譜系提供依據，以期合理的指導中華舞人工繁殖。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供了用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標記引物，該引物可以 用于中華舞親子鑒定。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供了用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標記引物的應 用。包括利用該引物制備成用于中華舞親子鑒定的試劑盒，或利用該引物對中華舞進行親 子鑒定，或利用其進行種質鑒定和家系管理。
[0007] 為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
[0008] 用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標記引物，具體如下：
[0009] Asi-75067F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT
[0010] Asi-67648F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC
[0011] As i-67123F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R:CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG
[0012] Asi-73843F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC
[0013] As i-72040F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ； R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT
[0014] Asi-70421F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R:TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC
[0015] Asi-56700F: CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R: TGCAAAAAGGAATTGGAATCG
[0016] Asi-65194F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC
[0017] Asi-77057F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT
[0018] Asi-66034F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG ；
[0019] 以上分子標記引物的正向引物標記常用的熒光染料，包括FAM、HEX、TAMRA、ROX 等。用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標記引物的應用，包括制備中華舞親子鑒定試劑盒，或 利用該引物進行中華舞的親子鑒定。
[0020] 中華舞親子鑒定方法包括：
[0021] 提取待鑒定樣品DNA，使用本發明開發的10對SSR引物進行擴增。使用常規軟件 統計等位基因數（Na)、期望雜合度（He)、排除概率（PE)以及累積排除概率（CPE)。
[0022] 本發明提供的中華舞親子鑒定試劑盒，其試劑盒包含10對中華舞微衛星標記引 物，以及10XPCR緩沖液，MgCl 2, dNTPs，rTaq DNA聚合酶和雙蒸水。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：
[0024] 1)本發明提供的SSR分子標記引物，可用于中華舞種質鑒定和家系管理，從而合 理的指導中華舞人工繁殖，保護長江中華舞的遺傳多樣性。對中華舞進行種質鑒定和家系 管理，指導人工繁殖，保護長江中華舞的遺傳結構。
[0025] 2)本發明采用合成不同的微衛星熒光引物，進行PCR擴增，將多個PCR產物混合測 定基因型數據，從而達到在一個測序反應中得到多個基因型數據進行親子鑒定，這樣大大 減少了測序所花的時間和費用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1為引物Asi-75067測序圖。
[0027] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0028] 圖2為引物Asi-67648測序圖
[0029] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0030] 圖3為引物Asi-67123測序圖
[0031] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0032] 圖4為引物Asi-73843測序圖
[0033] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0034] 圖5為引物Asi-72040測序圖
[0035] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0036] 圖6為引物Asi-70421測序圖
[0037] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0038] 圖7為引物Asi-56700測序圖
[0039] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0040] 圖8為引物Asi-65194測序圖
[0041] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0042] 圖9為引物Asi-77057測序圖
[0043] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0044] 圖10為引物Asi-66034測序圖
[0045] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
【具體實施方式】
[0046] 本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規方案。
[0047] 實施例1 :
[0048] 中華舞親子鑒定微衛星標記的篩選：
[0049] 1)采用經典的高鹽法提取宜昌22個野生中華舞DNA，稀釋至IOOng/μ L備用。
[0050] 2)將通過Primer Premier 5. 0設計的165對微衛星標記合成非焚光標記引物， 以步驟1)中的DNA為模板，以如下PCR反應條件擴增：95°C預變性5min ;95°C變性30s，最 適退火溫度下退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環；之后72°C延伸10min，4°C保存。利 用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行初步篩選分離，獲得了 24對多態性高并且能穩定擴增的 微衛星標記。
[0051] 3)將篩選出的中華舞多態引物繼續以步驟1)提取的DNA為模板，進行PCR擴增后 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用軟件ATetra 1.2計算各微衛星的等位基因數（Na)，期望雜 合度（He)，Shannon-Wiener多樣性指數（SW)，篩選出10對微衛星引物特征如表1 :
[0052] 表110對中華舞微衛星標記特征
[0053]
【權利要求】
1. 用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標記引物，包括： Asi-75067 F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT Asi-67648 F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC Asi-67123 F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R: CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG Asi-73843 F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC Asi-72040 F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ；R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT Asi-70421 F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R: TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC Asi-56700 F:CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R:TGCAAAAAGGAATTGGAATCG Asi-65194 F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC Asi-77057 F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT Asi-66034 F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG〇
2. 權利要求1所述引物在中華舞親子鑒定中的應用。
3. 權利要求1所述引物在制備中華舞親子鑒定試劑盒中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，所述的試劑盒包含： 10XPCR Buffer，MgCl2, dNTPs，10 對微衛星標記引物，rTaq Enzyme，ddH20〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104498613SQ201410854788
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優先權日:2014年12月31日
【發明者】張書環, 辛苗苗, 危起偉 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所