專利名稱：一種曼氏無針烏賊微衛星位點及引物的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學DNA標記技術領域，具體涉及一種曼氏無針烏賊微衛星位點及引物。
背景技術：
微衛星DNA (Microsatellite):又稱為短串聯重復序列(short tandemrepeats, STRs)或簡單序列重復(simple sequence repeats, SSRs)。它是以1- 6 個喊基的短核苷酸為基本單位首尾相連組成串聯重復序列，由于重復次數不同以及重復程度的不完全造成了每個位點的長度多態性。由于每個微衛星兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，可根據其兩端設計一對特異性引物，通過PCR技術來擴增相應位點的微衛星序列，再經電泳分析，即可顯示不同基因型個體微衛星的多態性。微衛星由于分布廣泛，密度大，多態性豐富，遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴增，所需DNA數量極少，對DNA質量要求不高，結果重復性好等優點，目前已被廣泛應用于遺傳多樣性、親緣關系分析、連鎖圖譜構建、功能基因定位、分子標記輔助育種(Marker-assisted Selection, MAS)等領域。曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni, Rochebrune)俗稱墨魚、日本無針烏賊，隸屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、二觸亞綱(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、烏賊超科(Sepiacea)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella),是我國近海廣布性種，曾是我國四大海產漁業(大黃魚、小黃魚、墨魚與帶魚)之一，以舟山漁場產量最大，在我國沿海知名度很高。由于過度捕撈，至上世紀80年代，烏賊的資源量銳減，漁訊消失，趨于瀕危狀態。為了加強對曼氏無針烏賊資源的保護，近年來其增殖放流及產卵場的保護和修復工作逐步展開，迫切需要對資源現狀及增殖放流的效果進行遺傳學評估以制定合理的放流措施。微衛星分 子標記在物種的群體遺傳學及放流增殖效果評估方面具有廣闊的應用前景，因此，選用有效的微衛星標記對于曼氏無針烏賊資源的保護和合理開發利用具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供曼氏無針烏賊微衛星位點及多態性引物，即提供6個曼氏無針烏賊的微衛星位點，以及相應的多態性引物，為曼氏無針烏賊的種群遺傳學、家系鑒定及分子標記輔助育種技術提供有效的工具。本發明一個方面提供6個微衛星位點,其核酸序列分別為SEQ ID N0:l_6。本發明還提供上述核酸序列的互補序列。本發明還提供從上述6個微衛星位點上設計的引物對，其中序列為SEQ ID NO 1的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。序列為SEQ ID NO :2的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :10。
序列為SEQ ID NO :3的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ IDNO 1USEQ ID NO :12。序列為SEQ ID NO :4的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ IDNO 13, SEQ ID NO :14。序列為SEQ ID NO :5的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ IDNO 15, SEQ ID NO :16。序列為SEQ ID NO :6的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ IDNO 17, SEQ ID NO :18。本發明的微衛星多態性引物用于曼氏無針烏賊種群遺傳多樣性的檢測，包括如下步驟I)基因組DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏無針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；2)微衛星PCR擴增采用設計的引物，曼氏無針烏賊基因組DNA為模板進行PCR，獲得曼氏無針烏賊個體微衛星擴增產物；3)電泳檢測擴增產物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測微衛星擴增產物； 4)遺傳多樣性分析根據每個個體微衛星擴增產物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計算遺傳多樣性參數。本發明從曼氏無針烏賊基因組DNA中篩選6個微衛星位點，并在微衛星重復序列兩端的側翼區設計特異性引物進行擴增，獲得的產物具有高度的多態性和穩定性，可用于曼氏無針烏賊的群體遺傳學、親緣關系分析、分子標記輔助育種等領域。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明的方法進行詳細的描述，對于實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。一、微衛星位點的篩選1、含有微衛星位點的序列查找從構建的曼氏無針烏賊墨囊基因文庫的序列中用軟件SSRHUNTER1.3 (http://www. biosoft. net/dna/SSRHunter. htm)進行微衛星序列的查找；參數設置為查找含有二堿基、三堿基和四堿基重復數5次以上的序列。共篩選出50個含有微衛星重復的位點，并從中設計引物進行多態性的檢測。2、微衛星引物設計從含有微衛星的基因序列中，選取符合引物設計的序列使用PrimerPremier5. O進行引物設計。主要參數設置為引物長度18_25p，20個為最適長度，PCR產物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65 °C。GC含量一般在40%_60%之間，盡量避免二級結構出現。3、將設計的弓丨物進行多態性檢測I)基因組DNA的提取
采用苯酚-氯仿法抽提25個曼氏無針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；2 )微衛星PCR的擴增采用設計的微衛星引物序列擴增曼氏無針烏賊基因組DNA ;反應體系10 μ L，包括2 X Power Taq PCR Master Mix (BioTeke, Beijing, China) 5 μι,正、反向引物各 I μ Μ,基因組DNA約100 ng。PCR反應程序為94° C預變性3 min，然后進行35個擴增循環，每一循環包括94° C變性I min，退火溫度I min (各引物退火溫度見表2)，72° C延伸Imin,最后 72° C 延伸 5 min。3)擴增產物電泳采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，800W恒功率電泳1-1. 5小時分離。膠板通過10%的冰醋酸溶液30min，蒸餾水6min，O. 2%硝酸銀溶液30min，3%的碳酸鈉顯色30秒,終止反應即得到擴增產物片段,采用10-bp DNA ladder (Invitrogen Inc.)作為marker檢測等位基因位置。4)遺傳多樣性分析根據每個體微衛星擴增產物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計算遺傳多樣性參數，從而篩選出具有多態性的微衛星引物及對應的位點。經過多樣性檢測，本發明共篩選出6個具有遺傳多態性的微衛星位點，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1-6,其設計的多態性引物的信息如表I所示表1:6個微衛星位點及對應引物信息
權利要求
1.一種曼氏無針烏賊微衛星位點，所述的位點為 1)序列為SEQID NO: 1-6中的任一個的微衛星位點， 2)與I)中的微衛星位點的核苷酸序列互補的微衛星位點。
2.微衛星引物對，所述的引物對是從權利要求1所述微衛星位點上設計的。
3.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :1的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。
4.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :2的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10o
5.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :3的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 120
6.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :4的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :14。
7.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :5的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 160
8.如權利要求2所述的微衛星引物對，其中序列為SEQID NO :6的微衛星位點設計的引物對，其上下游序列分別為SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 180
9.權利要求2所述的微衛星引物對用于曼氏無針烏賊種群遺傳多樣性的檢測，包括如下步驟1)基因組DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏無針烏賊肌肉組織的基因組DNA； 2)微衛星PCR擴增采用設計的引物，曼氏無針烏賊基因組DNA為模板進行PCR，獲得曼氏無針烏賊個體微衛星擴增產物； 3)電泳檢測擴增產物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測微衛星擴增產物； 4)遺傳多樣性分析根據每個個體微衛星擴增產物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計算遺傳多樣性參數。
全文摘要
本發明涉及一種曼氏無針烏賊微衛星位點及引物，6個微衛星位點，其核酸序列分別為SEQ ID NO:1-6。引物序列為SEQ ID NO:7-18。 本發明從曼氏無針烏賊基因組DNA中篩選6個微衛星位點，并在微衛星重復序列兩端的側翼區設計特異性引物進行擴增，獲得的產物具有高度的多態性和穩定性，可用于曼氏無針烏賊的群體遺傳學、親緣關系分析、分子標記輔助育種等領域。
文檔編號C12N15/11GK103060317SQ201210592860
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者李榮華, 王春琳, 章成龍, 宋微微, 母昌考, 詹萍萍 申請人:寧波大學