專利名稱：抗人cd80雙價抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雙價抗體，具體涉及一種抗人⑶80雙價抗體。
背景技術：
B7家族共刺激分子屬免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily, IgSF) 成員，包括CD80 (B7-1)、CD86 (B7_2)、ICOS等分子。其中，CD80分子又是B7家族中重要的成員。⑶80分子的配體為表達在T細胞表面的⑶觀和CTLA-4，與⑶觀結合轉導T淋巴細胞活化的共刺激信號，可促進特異性T細胞增殖、IL-2等細胞因子的分泌、誘導效應T細胞分化以及提供防治T細胞發生過早凋亡的信號等；而與CTLA-4結合可產生抑制性信號， 終止T細胞活化，調節T細胞免疫應答的強度。若缺乏此共刺激信號，抗原特異性的第一信號非但不能有效激活特異性T細胞，反而導致T細胞無能，或者耐受W]。研究表明，CD80 介導的信號通路不僅在T細胞活化過程中發揮重要作用，而且還參與到許多疾病的發生發展及預后狀況。鑒于此，可運用⑶80特異性的抗體來調節T細胞的免疫應答強度或者阻斷 CD80所介導的信號以抑制疾病的進展。單鏈抗體的基本形式單鏈抗體(single-chain variable fragment, kFv)包括重鏈可變區(the variable heavy chain, VH)禾口輕鏈可變區(the variable light chain, VL)，大小為2648kDa，其具有完整的抗原結合位點，是一個抗體分子最小的功能性VH-VL 區域。可變區有兩種形式VH -Iinker-VL和VL - linker-VH，前者更為普遍。VH和VL 之間通過一段連接肽相連，其長度上通常有10-25個氨基酸，最為普遍的為(GlyJer)3十五肽。第一個kFv分子是Huston等和Bird等在1988年同時研制成功并能以與親本抗體相似的親和力與靶抗原相結合。單鏈抗體的衍生形式AcFv大部分是單聚體，是通過12個或者更多的氨基酸連接肽將\和\相連而得。但是具有3 12個氨基酸連接肽的kFv鏈內不能折疊成一個功能性 Fv區域，相反可以與另一個kFv分子鏈間交聯形成一個雙聚體(diabody， 60 kDa)即雙價抗體。此外，減少連接肽到3個氨基酸或更少能夠HkFv相連形成三聚體(triabodies， 90 kDa)或者四聚體(tetrabodies， 120 kDa)。重組抗體廣泛應用于腫瘤等各種疾病的診斷和治療中，每年市場銷售額可達10 億美元并有逐漸增長的趨勢。因此，開發特異性強、親和力高的重組抗體受到每個國家的青睞。單鏈抗體^Fv是由12個氨基酸以上的連接肽將抗體分子的重鏈可變區(the variable heavy chain, VH)和輕鏈可變區(the variable light chain, VL)連接，其具有完整的抗原結合位點。與完整的IgG分子相比，ScFv表現出明顯提高的腫瘤特異性以及腫瘤細胞間的滲透性。然而，在腫瘤成像方面，由于它們在血液中的清除率較快，并且單一結合位點引起的親和力相對較低，致使這類抗體本地水平較高，顯像效果差。雙價抗體(diabody)含有兩個抗原結合位點，親和活性顯著提高，并且在腫瘤成像方面明顯改善。單鏈抗體VH和VL 之間的連接肽至少為12個氨基酸。當連接肽降低至3-10個氨基酸時，分子內的VH和VL 通常不能夠結合成有效的抗原結合位點，但是這促進了分子間VH和VL的配對，形成具有活
3性的 diabody。Diabody是一種雙價二聚體，即在單鏈抗體的基礎上采用基因工程技術改造而成。 Diabody分為同聚型和異聚型。Diabody分子量一般在50_60kDa之間，顯示出良好的組織穿透力、腫瘤靶向和血清清除率，極可能成為腫瘤免疫治療最具潛力的載體。目前，一株抗 CEA-diabody已批準進入臨床應用，主要用于放射免疫診斷。此外，另兩株抗CEA-diabody、 Jtl CD20- diabodies>Jji PSCA-diabodies (prostate stem cell antigen, PSCA)以及抗 HER-2-diabodies經過同位素標記后在臨床前期的研究當中并表現出良好的腫瘤成像能力。因此，需要研制一種具有自主知識產權的抗人⑶80雙價抗體。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種抗人CD80雙價抗體，所述雙價抗體可以特異性結合CD80分子；本發明的另一目的是提供產生抗人CD80雙價抗體的細胞株。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是一種抗人CD80雙價抗體，所述雙價抗體由重鏈可變區(the variable heavy chain，VH)和輕鏈可變區(the variable light chain, VL)組成，兩者間由連接肽Gly4Ser相連，所述重鏈可變區VH核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示；所述輕鏈可變區VL核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；雙價抗體的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。本發明同時要求保護產生上述抗人CD80雙價抗體的細胞株，所述細胞株的保藏信息為保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期2011年01月M日；保藏編號CGMCCNo. 4571 ；分類命名分泌抗人⑶80分子雙價抗體的細胞株。本發明同時要求保護所述抗人CD80雙價抗體在腫瘤成像中的應用。本發明同時要求保護所述抗人CD80雙價抗體在制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1.本發明所述細胞株分泌抗人CD80雙價抗體的能力強，性能穩定；本發明所述抗人 CD80雙價抗體與抗原的結合能力強，和鼠源親本抗體4E5相比，具有更高的親和力；
2.本發明所述抗人CD80雙價抗體可明顯抑制Raji細胞的體外增殖并呈劑量依賴性， 當終濃度為25 μ g/ml時即可出現明顯的抑制效應，在50 μ g/ml達最大值；抑制作用明顯強于對照組的單鏈抗體。3.本發明所述抗人⑶80雙價抗體能成功阻斷⑶80介導的信號通路。
圖1為實施例中抗⑶80雙價抗體、重鏈可變區和輕鏈可變區基因及 pIRES2-EGFP/diabody的雙酶切鑒定的結果圖，其中，M :DL2 000 DNA marker ;1 重鏈可變區基因；2 ；輕鏈可變區基因；3 抗CD80雙價抗體基因；4 真核表達載體pIRES2-EGFP/ diabody 經 by EcoR I and Sal I 雙酶切；5 真核表達載體 pIRES2_EGFP/diabody ；6 空載體 pIRES2-EGFP ；圖2為實施例中轉染72h的CHO細胞(400X )光鏡顯微圖； 圖3為實施例中轉染72h CHO細胞培養上清活性鑒定結果圖； 圖4為實施例中抗⑶80雙價抗體上清與⑶80細胞的結合結果圖； 圖5為實施例中抗CD80雙價抗體的效價評價結果圖6為實施例中Ni柱親和層析純化的雙價抗體變性(A)和非變性(B)聚丙烯酰胺凝膠電泳結果圖7為實施例中抗CD80雙價抗體與人B淋巴瘤細胞株Raji和Daudi的結合結果圖； 圖8為實施例中抗⑶80雙價抗體對鼠源性抗人⑶80抗體4E5與⑶80細胞膜型⑶80分子的競爭結合結果圖，其中，A: a:空白對照組；b:陽性對照組GE5); c:抗 ⑶80雙價抗體+ 4E5; d: b和c疊圖；B: a:陰性對照組；b:抗⑶80雙價抗體and 4E5 同時加入；c:抗⑶80單鏈抗體and 4E5同時加入；
圖9為實施例中抗CD80雙價抗體對Raji細胞體外增殖的抑制作用結果圖，其中，a:^ < 0. 05vs陰性對照；b:廣< 0. Olvs陰性對照；c: P< 0. 05vs陰性對照；d: P> 0. 05vs 抗CD80單鏈抗體(50 μ g/ml)；
圖10為實施例中抗CD80雙價抗體對APC表面膜型CD80分子的阻斷作用結果圖，其中， a :P < 0. 05 ；b :P > 0. 05。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一構建pIRES2-EGFP/diabody表達載體。1)復蘇含pIRES2-EGFP/^cFv大腸桿菌ToplO 吸取-80 V凍存保種的含 pIRES2-EGFP/^cFv大腸桿菌ToplO 50 μ 1，加入到已含有Kan+LB培養基的華氏管中， 37°C，200rpm，搖菌12h，次日備用。2)提取pIRES2-EGFP/^cFv質粒，按照質粒DNA小量試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下
a.取4 ml上述培養過夜的菌液，12，000 Xg離心1 min，棄盡上清。b.加250μ1 Buffer Sl (含有RNase Α)懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊。c.加250 μ 1 Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉10_15次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。d.加350 μ 1 Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉混合6-8次，12，OOOXg離心 15 min。e.吸取上步離心上清并轉移到制備管(置于2 ml離心管(試劑盒內提供)中)， 12，000 Xg離心lmin，棄濾液。f.將制備管置回離心管，加500 μ 1 Buffer Wl，12，OOOXg離心1 min，棄濾液。g.將制備管置回離心管，加700 μ 1 Buffer W2 (已加入無水乙醇)，12，OOOXg離心lmin，棄濾液；以同樣的方法再用700 μ 1 Buffer W2洗滌一次。棄濾液。h.將制備管置回anl離心管中，12，OOOXg離心1 min。i.將制備管移入新的1.5 ml離心管中，在制備管膜中央加60 μ 1 Eluent，室溫靜置 1 min。12，000 Xg 離心 1 min。將提取好的質粒于-80°C中保存，備用。3)提取抗CD80-diabody輕重鏈基因以上述獲取的pIRES2_EGFP/^cFV質粒為模板，分別以P1/P2和P3/P4為引物，PCR反應擴增重輕鏈基因，
權利要求
1.. 一種抗人CD80雙價抗體，所述雙價抗體由重鏈可變區和輕鏈可變區組成，其特征在于，兩者間由連接肽Gly4Ser相連，所述重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；雙價抗體的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所所示。
2.一種產生抗人CD80雙價抗體的細胞株，所述細胞株的保藏信息為保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所；保藏日期2011年01月M日；保藏編號CGMCCNo. 4571 ； 分類命名分泌抗人CD80分子雙價抗體的細胞株。
3.權利要求1所述抗人CD80雙價抗體在腫瘤成像中的應用。
4.權利要求1所述抗人CD80雙價抗體在制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗人CD80雙價抗體，所述雙價抗體由重鏈可變區和輕鏈可變區組成，其特征在于，兩者間由連接肽Gly4Ser相連，所述重鏈可變區核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述輕鏈可變區核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；雙價抗體的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；本發明所述雙價抗體與抗原的結合能力強，對Raji細胞具有明顯的抑制作用，可以用于腫瘤成像中，也可以應用在制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物中。
文檔編號C12N15/13GK102190729SQ20111005630
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者朱華亭, 邱玉華, 郭靜雅, 陳昌友, 陳永井 申請人:蘇州大學