專利名稱：重組il3與力達霉素的融合蛋白、制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤學、蛋白組學及生物藥學領域，提供了可以產生靶向腫瘤殺傷作用的融合蛋白、制備方法以及在腫瘤的靶向治療藥物中應用。
背景技術：
白血病是造血干細胞的惡性克隆性疾病，它的死亡率在導致兒童及35歲以下成年人死亡的惡性腫瘤中排首位。常規放療化療可以去除腫瘤組織中大多數增殖細胞及遺傳不穩定性細胞，但不能去除腫瘤干細胞，從而造成了腫瘤復發和轉移，同時缺乏針對性的常規放化療也可能損害體內某些類型的正常細胞，出現較明顯的毒副反應。腫瘤干細胞具有類似正常干細胞的自我保護特性，如有效的DNA修復、高表達多藥耐藥型膜轉運蛋白以及處于相對靜止狀態及擁有特定的微環境，使其能夠逃逸現有的腫瘤治療手段，針對這些保護機制，并利用腫瘤干細胞與正常干細胞的之間的差異進行靶向治療，才可能實現根治白血病的目的。在腫瘤干細胞靶向治療中，靶點的選擇非常重要，已知CD123在急性髓系白血病干細胞、變異性B細胞慢性淋巴增殖性疾病特別是毛細胞白血病細胞、以及不成熟的急性T淋巴細胞白血病細胞表面均可見表達，尤其在急性髓系白血病干細胞表面呈高表達，而在正常造血干細胞表面幾乎不表達此抗原，且⑶123是IL-3受體的α鏈，依靠細胞因子與細胞因子受體的結合方式，親和力較抗原抗體結合更高效，因此CD123可作為治療AML的有效靶點。雖然在靶向治療中使用最多、最為成熟的是與腫瘤相關抗原相關的單克隆抗體，但免疫原性大，一次注射毒副反應大，患者耐受性差等缺點也限制了其進一步的應用。而細胞因子及其受體結合的靶向治療導向特異性強、殺傷力高、穩定性好、毒副作用小、不易產生耐藥，從理論上講 ，既可靶向殺傷腫瘤細胞，還不會導致繼發性腫瘤，是目前國內外學者的關注熱點。IL-3融合蛋白在白血病治療中的應用已經取得了一定進展，1991年美國Immunex公司研制的GM-CSF/IL-3融合蛋白命名為Pixykine、其后IL-3與TPO的融合蛋白、IL-3與白喉毒素的融合蛋白DT388IL3、IL-3與bax的融合蛋白相繼問世，經過體內外試驗，DT388IL3以其良好的臨床療效、較小的毒副作用脫穎而出，目前已進入臨床II期實驗階段。但是DT388本身分子量較大難內化并具有一定免疫原性，體外實驗純化過程中也顯示其穩定性稍差，在實際應用方面還存在很多不足。因此研制以CD123為靶點的高效、小型化且性能穩定的靶向藥物成為針對腫瘤干細胞特異性靶向治療的新焦點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的、由IL3與力達霉素構建的融合蛋白及其制備方法，以及該融合蛋白用于制備治療白血病的藥物組合物的用途。在本發明中所提及的術語均按下述定義來理解。“LDP”等同于力達霉素的輔基蛋白，“LDM”等同于“LDP_AE”Sr輔基蛋白上結合有發色團AE”。發色團和輔基蛋白通過非共價鍵結合，兩者結合具有特異性和牢固性，LDM的輔基蛋白和發色團可以拆分和進行分子重新組裝。在本文中提到的“AE”是指具有下式I所示化學結構的發色團，LDM發色團的化學名:(2R，7S，9R，I OR) ~ ~ 氨基-7,8- (2*-氯-6*-羥基-1*，4*-亞苯基)-10- (4，-去氧-4’-二甲氨基-5’，5’-二甲基-吡喃核糖基)-4，8-氧雜-5-氧代-1，11，13-三烯-15，18- 二炔-三環[7，7，3, Oloa4]-2-十九碳醇-2”，3”- 二氫-7”-甲氧基-2”-亞甲基-3”-氧代-1”，4”-苯并惡嗪-5”-羧酸酯。分子式=C43H42O13N3Cl
權利要求
1.融合蛋白，其選自下述序列之一: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列構成的蛋白； (b)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列的生物學功能、僅在第131位1-L、132位F-L突變的氨基酸序列構成的蛋白。
2.權利要求1的融合蛋白，其還功能性地結合有式(I)所示結構的發色團AE。
3.核酸分子，其編碼權利要求1的融合蛋白的基因，其選自下述序列之一: (a)SEQ ID NO:3所示的編碼SEQ ID NO:1的核苷酸序列； (b)SEQID NO:4所示的編碼SEQ ID NO:2的核苷酸序列(由于密碼子簡并性造成的同氨基酸序列也在保護范圍內)；
4.載體，其可操作地連接有權利要求3所述的核酸分子。
5.權利要求4的載體，所述載體是質粒。
6.宿主菌，其包含權利要求4所述的載體。
7.制備權利要求2 的融合蛋白的方法，包括以下步驟: (a)將IL3和mIL3編碼基因與力達霉素輔基蛋白LDP基因可操作地連接到本室改造后的質粒pET28a中，得到重組表達質粒pET28a IL3-LDP和mIL3_LDP ； (b)在大腸桿菌BL21中誘導表達融合蛋白IL3-LDP和mIL3-LDP； (c)純化步驟(b)中獲得的融合蛋白； (d)使步驟(c)中獲得的融合蛋白與式(1)的發色團組裝； (e)任選地，其還包括測定步驟(d)中組裝后的融合蛋白的生物學活性的步驟。
8.藥物組合物，其中含有藥學有效量的權利要求1或者2所述的融合蛋白，任選地，還含有藥學上允許的佐劑。
9.權利要求1或者2的融合蛋白在制備用于腫瘤靶向治療的藥物中的用途。
10.權利要求9的用途，所述藥物用于靶向殺傷急性髓系白血病細胞。
11.權利要求9的用途，其中的急性髓系白血病是人急性髓系白血病。
12.權利要求9的用途，其包括向有此需要的受試者給予有效量的項目I或者2的融合蛋白。
13.權利要求9的用途，其中所述疾病是CD123陽性的人急性髓系白血病。
全文摘要
本發明涉及抗癌藥物力達霉素的強化融合蛋白I131L、F132L突變后的mIL3-LDM，其編碼基因；還涉及所述強化融合蛋白的基因工程構建方法和所述強化融合蛋白的用途。
文檔編號C12N15/62GK103102416SQ201110139158
公開日2013年5月15日 申請日期2011年7月28日 優先權日2011年7月28日
發明者楊純正, 甄永蘇, 邵榮光, 熊冬生, 張硯君, 苗慶芳, 劉榮, 張秀麗, 彭紅薇, 胡蘊惠, 李雙靜, 林陽, 李真真, 顏次慧, 姜琳琳 申請人:中國醫學科學院血液病醫院