專利名稱：大豆磷轉運蛋白GmPHT15及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及大豆磷轉運蛋白GmPHT15及應用。
背景技術：
磷是生物生長發育的重要營養元素之一，是蛋白質、核酸、脂類以及各種重要的小分子(如能源供應者ATP)的重要組成成分，是各種代謝(如糖降解)必須的中介物，是生長發育的調節物(如磷酸化)。因此，施加磷肥對提高農產量起著關鍵作用。但是，磷是一種不可再生的資源，由于長期以來的過度利用，使得磷正在逐步成為一種地球上即將消失的礦產資源，在不遠的將來，磷將制約各國的經濟和政治命脈，磷也將成為許多國家的戰略物資(Steven Van Kauwenbergh)。然而，為了提高作物的產量，農業上還在不斷增加磷的施用量。據報道，我國小麥產區的磷施用量是小麥生長發育所需的兩倍(Vitousek，等，2009)；另外，人和動物糞中含有大量的磷也被直接釋放到環境中。結果導致土壤和水體中磷含量大量增加，引起環境污染。同時，在水體和土壤中的磷大多數是植物不可利用的有機磷。這樣，導致了土壤中的有效磷含量低。因此，提高植物對磷的利用率對于減少農業磷的施用量，維護生態安全，提高作物的產量，保障國家磷的戰略安全等方面具有重要和關鍵的意義。大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產物的重要來源，其產量與土壤磷的供應量和植株對磷的吸收能力直接相關。 本發明通過基因工程的方法，首次發現與提高大豆對磷的利用率有關的大豆磷轉運基因 GmPHT15及其編碼蛋白，該基因可用于提高各種植物對磷的利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高作物的產量。
發明內容
本發明的目的是提供一種大豆磷轉運蛋白GmPHT15。本發明的另一目的是提供編碼上述大豆磷轉運蛋白GmPHT15的基因。本發明的再一目的是提供上述編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種大豆磷轉運蛋白GmPHT15，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。如61位上缺失K，或在281位添加E，或在157位的R替換為K，或在464 位缺失PQDKTKTDAGYPP，或在521位增加TAATRESAMEAGLEVRPSV對蛋白的功能沒有影響。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發明還提供含有編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15基因的載體及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供含有編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15基因的轉化植物細胞及轉基因植物。
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本發明進一步提供編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。優選地，所述植物為擬南芥、大豆等。本發明提供的 GmPHT15 基因(全稱為 Glycine max phosphate transporter 15) 是從大豆墾農18(由黑龍江省八一農墾大學科學研究所提供)中克隆到的基因，基因的開發閱讀框為1584bp，它編碼527個氨基酸；大豆磷轉運蛋白GmPHT15與擬南芥AtPHTl ；3高度同源，具有11個跨膜域和PHTl特征域GGDYPLSATIxSE(圖1)；大豆磷轉運蛋白GmPHT15 在大豆各個組織、器官中都表達(圖幻；GmPHT15蛋白在大豆種子中的表達隨種子的發育逐漸減少(圖3)，GmPHT15蛋白的表達受低磷脅迫的誘導(圖4) ；GmPHT15蛋白在細胞中定位于細胞膜(圖5) ；GmPHT15基因能恢復酵母雙突變PAM2(即Δ pho84/Δ pho89)的表現型， 可以在磷脅迫的條件下正常生長(圖6)。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明提供了大豆磷轉運蛋白GmPHT15(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)及編碼該蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示)。(2)過表達GmPHT15基因可以提高酵母對磷的利用率。(3)本發明提供的編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15的基因可用于提高各種植物對磷的利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產量。
圖1示例表明大豆磷轉運蛋白GmPHT15與擬南芥AtPHTl ；3高度同源，其中 GmPHT 15的TMl 11代表11個潛在的跨膜域用黑實線標示，AtPHTl ；3的用黑虛線標示， PHTl特征域以黑框標示。圖2顯示了本發明大豆磷轉運蛋白GmPHT15在不同組織中的表達水平，其中，R: 根；U 單葉；Tl 第一復葉；T2 第二復葉；T3 第三復葉；T4 第四復葉；S 莖；F 花。圖3表明大豆磷轉運蛋白GmPHT15在種子中的表達與種子的發育水平呈負相關， 其中，Sl 開花后第7天；S2 開花后第14天；S3 開花后第21天；S4 成熟種子。圖4為在不同磷濃度下處理7天后根中GmPHT15蛋白的表達量，其中，PsOOOOR 0 μ M Pi ；PsOOIOR :10 μ M Pi ；PsOIOOR 100μ M Pi ；Ps0500R :500 μ M Pi ；PslOOOR :1000 μ M Pi ；Ps2000R 2000μ M Pi ；Ps5000R :5000 μ M Pi。圖5表明大豆磷轉運蛋白GmPHT15定位于細胞膜上(YFP 在514nm的激發光下觀察的結果；明場無激發光時觀察到的結果；疊加表示2種條件下觀察結果的重疊)。圖6為本發明GmPHT15基因在酵母中的異源表達，其中，第一列為空載體對照；第二列為野生型酵母菌對照；第三列(PAM2-GmPHT15)為實驗組。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1 GmPHT 15基因的克隆以大豆品種墾農18 (KN18)為試驗材料，在低磷脅迫(H2PO4, 100 μ Μ)下的液體培養基中培養至真葉張開，取根、莖和葉，利用iTrizol試劑盒提取總mRNA(Invitrogen公司)，并利用反轉錄試劑盒(Takara公司)對總mRNA進行反轉錄，得到cDNA。
液體培養基成份
H3BO3
MnSO4-H2O
ZnSO4CH2O
CuS04'5H20
Na2Mo04.2H20
FeS04.7H20
Na2EDTA.2H20
KH2PO4
KNO3
MgS04.7H20 Ca(N03)2'4H20
50xl0"'mM IOxlO"3 mM 2xl0-3 mM 1.5X10-3 mM 0.58X10-3 mM
0.1 mM 0.1 mM 1.0 mM 2.5 mM 1.0 mM 2.5 mM以大豆品種墾農18(KN18)為試驗材料，通過RT-PCR(其程序為95°C預變性 3min ；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 2min, 26 循環；72 "C 5min。反應體系0. 3 μ L LA Taq DNA 聚合酶，1 μ L 弓 I 物 F，1 μ L 弓 I 物 R，5 μ L IOX 緩沖液，4 μ L dNTP mix, 2 μ L cDNA, 36. 7 μ L H2O ；總體系為 50 μ L。其中，引物 F :5，-CAGGTTAAGGCACCTGGGAGAC-3，；引物 R 5‘-TGACAAGGGAGATGCAAAAAAG-3‘。擴增得到GmPHT15。將其重組到Gateway克隆體系的入門載體pGWC上。并送三博遠志生物公司測序，檢測GmPHT15的正確性。實施例2 GmPHT15基因在酵母中的表達通過Gateway克隆體系將GmPHT15重組到pYES_DEST52載體(購自hvitrogen 公司)上，并將重組質粒轉化到缺失兩個高親和磷轉運基因(PH089和PH084)的酵母 % ^ # PAM2 ( Δ pho89 TRP1 Δ pho84 HIS3 ade2 leu2 his3 trpl ura3。 Martinez， P. , Zvyagilskaya, R. , Allard, P 禾口 Persson, B. 1998. Physiological regulation of the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 180, 2253-2256.)中。在GAL(半乳糖)啟動子的作用下，GmPHT15可以互補 PH084和PH089的功能，即PAM2可以在低磷(< 50 μ M)條件下正常生長(如圖6所示)。實施例3 GmPHT15基因在大豆中的表達及其在提高大豆對磷的利用率中的應用選用籽粒飽滿且一致的大豆KN18作為測試材料；將其播種于新的蛭石中保濕催芽，待出土 2-3天后，移入H2PO4.為500 μ M的液體培養基中，培養至真葉張開。移至H2PO4 的濃度梯度為O μ Μ, 10 μ Μ，100 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ, 2000 μ M和5000 μ M的培養基中培養。 培養7天后取樣，同實施例1中的操作。利用Real-Time PCR檢測GmPHT15受磷脅迫的調控影響。引物F 5，-CAGGTTAAGGCACCTGGGAGAC-3，；引物 R:5，-TGACAAGGGAGATGCAAAAAAG-3，。擴增的長度為191bp。PCR 程序ABI M^One進行，用STOR Green I檢測熒光信號。采用15 μ 1反應體系，體系配制如下SYBR Primix Ex Taq ( 2x )7.5 ul上游引物(IOuM)0.3 ul下游引物(IOuM)0.3 ulROX Reference Dye ( 50x )0.3 ulcDNA1.0 ulddH,0 (滅菌雙蒸水)4.6 ul共計15 ulqRT-PCR 參數如下兩步法95°C10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin,40 個循環。從檢查結果來看，GmPHT15受低磷的強調控。磷濃度為0 μ M時基因的表達量分別是10“] 、100 4]\1、500 4]\1、1000 4]\1、2000 4]\1和5000 4]\1的7· 9,2. 1,1. 9,1. 6、0· 9和 1. 8倍。 但在有磷的條件下，GmPHT15的表達與磷的供給濃度成正相關。實施例4 GmPHT15基因在擬南芥中的表達及其在提高擬南芥對磷的利用率中的應用將GmPHT15基因構建在由35S啟動子驅動的雙元載體上，過表達到擬南芥中檢測該基因的功能，已獲得轉基因植株。并用測定了 3棵獨立轉基因植株在低磷(濃度為 10 μ M)脅迫的條件下植物體內總磷含量的變化。取生長14天的幼苗，用超純水清洗干凈， 放入60°C烘箱中過夜烘干，將稱量后的樣品(100 300mg)直接放入消化罐中，加入7ml 68% 的 HNO3 和 2ml 30% 的 H2O2 (優級純)，用 Microwave laboratory system (Milestone, Italy)在180°C，IKPa條件下消化15min。冷卻后，將消化液轉入25ml用超純水洗凈并烘干的容量瓶中，用超純水定容至 25ml。M Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer(ICP-0ES, Perkin Elmer, USA),以磷的標準溶液做標準曲線測定磷含量， 每個樣品重復測量2次。從測定結果來看，轉基因擬南芥比野生型的總磷含量提高了 2. 30% -5. 52%。由此可見，基因GmPHT15過表達于植物中，增強了轉基因植物在低磷脅迫條件下吸收磷的能力，進而有效地提高了植物抗低磷脅迫的能力。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.大豆磷轉運蛋白GmPHT15，其特征在于，其具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權利要求2或3所述基因的轉化植物細胞。
7.權利要求2或3所述的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其中所述的植物為擬南芥。
9.如權利要求7所述的應用，其中所述的植物為大豆。
全文摘要
本發明涉及大豆磷轉運蛋白GmPHT15，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及編碼該蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發明提供的編碼大豆磷轉運蛋白GmPHT15的基因可用于提高各種植物對磷的利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產量。
文檔編號C12N1/21GK102372768SQ20111022842
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月10日 優先權日2010年8月20日
發明者傅永福, 張曉玫, 范成明 申請人:中國農業科學院作物科學研究所