專利名稱：Msh3的表達狀態決定癌細胞對使用parp抑制劑和鉑藥物的化學療法治療的響應性的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及癌癥的檢測、診斷和治療領域，并且更具體地涉及結腸直腸癌細胞對于DNA損傷劑的敏感性。
背景技術：
在不限制本發明的范圍的前提下，其背景結合用于結腸和胃腸癌癥檢測的生物標記物進行描述。授權給Pant等人的第7，252，955號美國專利公開了用于結腸癌篩查的免疫檢測和試劑盒。從保持了免疫原性的單個樣品中提取了糞便糖蛋白。將經純化的糞便糖蛋白與結腸和卵巢腫瘤抗原(COTA)的抗體進行反應。黏液素抗原COTA特異性地存在于結腸直腸的癌組織中，而不存在于正常的結腸中。測定糞便樣品中的COTA的含量，并且該含量用于指示結腸癌的存在與否。授權給Liu等人的第7，575，928號美國專利公開了用于診斷結腸直腸癌的基因。簡單地說，本發明通過以下的步驟搜索基因序列，提供了用于診斷結腸直腸癌的基因(1)從正常的腸、腸息肉和結腸直腸的癌組織中得到上皮細胞；(2)通過高度差異基因表達收集基因并且建立文庫，所述的高度差異基因表達通過抑制消減雜交(SSH)進行；
(3)從癌組織中得到具有相對高的信號強度的群落；(4)通過RNA印跡雜交(NorthernHybridization)收集更多的癌組織,通過實時聚合酶鏈式反應(PCT)結合生物信息學的分析確認差異基因表達之間的變化；并且(5)從所述的文庫中選擇最適用的基因，并且將所述的基因序列用作試劑提供早期診斷，專一性、高度敏感性及安全性的效果。授權給Robbins等人的第7，022，472號美國專利公開了在診斷結腸直腸癌中有用的人類MLHl和人類MSH2基因的突變。也提供了簡單地說，發現人類MLHl和MSH2基因的變體可以用于診斷遺傳性非息肉病性結腸直腸癌(HNPCC)和/或測定患者對于發生HNPCC的易感性。還提供了用于鑒定MSH2基因的新變體MLHl的方法和組合物。除此之外，提供了包含這些變體基因的遺傳性非息肉病性結腸直腸癌的試驗模型。最終，由Baker等人遞交的第20090305277號美國專利公開描述了基于確定至少一個基因的表達水平，預測被診斷患有癌癥的人類患者的可能性的方法，所述的基因選自AURKB、Axin 2、B1K、BRAF、BRCA2、BUB1、C20 orfl、C200RF126、CASP9、CCNE2 變體 1、CDC2、CDC4、CENPA、CENPF、CLICI、CYR61、Cdx2、ChkI、DLCI、DUSPI、E2FI、EGR3、E124、ESPLI、FBX05、 FGF2、FOS、FUT6、GSK3B、GrblO、HES6、HLA-G、HNRPAB, H0XB13、HSPEl、KIF22、KIFCl、KLRKl、Ki-67、LAT、LMYC、MAD2L1、MSH2、MSH3、NR4A1、PDGFA、PRDX2、RAB32、RAD54L、RANBP2、RCCl、R0CK2、RhoB, S100P、SAT、SODl、SOSl、STK15、TCF-U T0P2A、TP53BP1、UBE2C、VCP 和 cMYC,或者其相應的表達，其中一個或者多個上述基因的表達增加與對化學治療的陽性響應的可能性增加呈正相關。
發明內容
關于MSH3的表達水平在評價預后和/或預測結腸直腸癌的癌細胞對化療的響應性方面，本發明人在此證明了與之前的發現具有顯著的和新的區別。在一個實施方案中，本發明提供了治療存在患一種或多種腺癌的風險，或者診斷患有一種或多種腺癌的患者的方法，所述的方法包括在得自患者的懷疑為腺癌細胞的細胞內測定MSH3的總體表達，并且預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑治療的療效，其中與正常細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對抗腫瘤劑治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的抗腫瘤劑給予患者。在上文中所描述的腺癌選自結直腸癌(CRC)、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、陰道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在更具體的方面，所述的腺癌是CRC并且所述的腺 癌包括實體瘤。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達、MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。在另一個方面，測定MSH3總體表達水平的步驟包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在再一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括免疫組織化學。在相關的方面，所述的抗腫瘤劑選自1，3_ 二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和電離輻射。在一個方面，所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑是選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素的鏈間交聯劑。在再一個方面，所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，該抑制劑選自奧拉帕尼(olaparib)、異卩引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。本發明的另一個實施方案提供了治療具有腺癌的風險或者診斷患有腺癌的患者的方法，所述的方法包括(I)在得自患者的懷疑為腺癌細胞的細胞中，測定MSH3的總體表達；并且(2)預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑治療的療效，其中與正常細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對抗腫瘤劑治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的抗腫瘤劑給予患者。在一個方面，所述的腺癌選自結直腸癌(CRC)、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、陰道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在另一個方面，所述的腺癌是CRC。在再一個方面，所述的腺癌包括實體瘤。如前文所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑為腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達，MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。在一個方面，所述測定MSH3總體表達水平的步驟包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在再一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括免疫組織化學。
在一個方面，所述的抗腫瘤劑選自1，3_ 二(2-氯乙基)-1_亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和電離輻射。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑是選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素的鏈間交聯劑。在再一個方面，所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，該抑制劑選自奧拉帕尼、異11引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。在再一個實施方案中，本發明公開了了治療具有結腸直腸癌的風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者的方法，所述的方法包括在得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞內測定MSH3的總體表達，并且預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑治療的療效，其中與正常結腸直腸癌細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對抗腫瘤劑治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的抗腫瘤劑治療給予患者。在一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是結腸直腸癌的組織樣品的MSH3蛋白表達。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是結腸直腸癌的組織樣品的MSH3核酸表達。在再一個方面，測定MSH3總體表達水平的步驟包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在再一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括免疫組織化學。在一個方面，所述的抗腫瘤劑選自1，3_ 二(2-氯乙基)-1_亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和電離輻射。在具體方面，所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑是選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素的鏈間交聯齊 。在再一個方面，所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，該抑制劑選自奧拉帕尼、異R引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4_甲氧基-咔唑的衍生物。本發明進一步提供了為具有結腸直腸癌風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者選擇癌癥治療的方法，所述的方法包括測定患者的MSH3的總體表達水平，并且預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑治療的療效，其中MSH3的總體表達水平的降低表明DNA交聯劑對于患者而言是適合的治療。在一個方面中，測定MSH3總體表達水平的步驟包括分析懷疑是結腸直腸癌的組織樣品的MSH3蛋白表達。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是結腸直腸癌的組織樣品的MSH3核酸表達。在再一個方面，測定MSH3總體表達水平的步驟包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在以上所描述的方法的又一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在所述方法的相關的方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者免疫組織化學法。在所述方法的一個具體的方面，所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素的鏈間交聯劑。在另一個方面，所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，該抑制劑選自奧拉帕尼、異口引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。本文公開的另一個實施方案涉及將患者分類到癌癥治療的臨床試驗的亞組中的方法，所述的方法包括在得自患者的懷疑為癌細胞的細胞內測定MSH3的總體表達，并且預測使用用于治療患者的候選藥物治療的療效，其中與正常細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對候選藥物治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的候選藥物給予患者，并且MSH3的表達水平使得能將患者分類到臨床試驗的亞組中。在一個方面，癌細胞選自結直腸癌(CRC)、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、 腎癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、陰道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在具體方面，所述的癌細胞是結直腸癌細胞并且所述的癌細胞位于實體瘤內。在所述方法的一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是結腸直腸癌的組織樣品的MSH3蛋白表達、MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達都分析。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在再一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在又一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括使用等位基因特異性探針或者抗體探針進行雜交。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括免疫組織化學。在一個相關的方面，候選劑是基因毒性劑或者聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑。在再一個實施方案中，本發明描述了通過包括以下步驟的方法將患者分類到結腸直腸癌的亞組中的步驟，所述的方法包括步驟在得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞內測定MSH3的總體表達，并且預測結腸直腸癌的階段，其中與正常的結腸直腸癌細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明疾病的進展。在前文所公開的分組方法的一個方面，疾病進展和MSH3表達的減少表明結腸直腸癌對抗腫瘤劑治療的傾向。本發明還公開了治療具有結腸直腸癌的風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者的方法，所述的方法包括以下步驟(i)在得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞中測定MSH3的總體表達，其表明了對于采用一種或者多種DNA交聯劑治療的響應性的傾向；并且( )測定患者中MSH3總體表達的持續的降低，并且(iii)給予治療上有效量的DNA交聯齊U，所述的DNA交聯劑的量足以消除MSH3表達降低的結腸直腸癌細胞。在一個實施方案中，本發明涉及進行臨床試驗從而評價候選藥物的方法，所述的候選藥物據信在治療與MSH3基因表達相關的疾病狀態中有用，所述的方法包括a)從來自一組患者中懷疑具有結腸直腸癌的組織中測定MSH3的表達水平；b)將候選的藥物給予第一亞組的患者，并將安慰劑給予第二亞組的患者，c)在給予所述的候選的藥物或者安慰劑的給予之后，重復步驟a)，并且d)測定所述的候選藥物是否減少了結腸直腸癌的細胞的數量，所述的細胞具有降低的MSH3表達，該降低與第二個亞組的患者中所發生的任何降低相比具有統計學上的顯著性，其中統計學上的顯著性降低表明所述的候選藥物在治療所述的疾病狀態中是有用的。
在另一個實施方案中，本發明提供了檢測哺乳動物的結腸直腸癌對于DNA損傷劑是否很可能具有抗性或者是有響應的方法，所述的DNA損傷劑用于結腸直腸癌的治療，該方法包括以下步驟(或多個步驟)在來自該癌癥的生物樣品中檢測MSH3的總體表達的下降，并將該結腸直腸癌鑒定為對該DNA損傷劑具有增強的感受性，其中在對該DNA損傷劑有響應的癌癥中，相對于同樣的生物標記物的表達或者活性水平，MSH3的表達或者活性降低。
在再一個實施方案中，本發明公開了用于結腸直腸癌疾病進展的生物標記物，其中所述的生物標記物是MSH3，并且與正常的結腸直腸癌細胞，或者在更早的時間點得自同一患者的結腸直腸癌細胞相比，從患者中得到的結腸直腸癌細胞內MSH3的總體表達的減少意味著結腸直腸癌疾病的進展。在一個方面，所述MSH3的總體表達水平包括分析懷疑為結腸直腸癌的組織樣品的MSH3蛋白的表達。在另一個方面，MSH3的總體表達水平包括分析懷疑為結腸直腸癌的組織樣品的MSH3核酸的表達。在另一個方面，MSH3的總體表達水平包括將得自個體的MSH3核酸進行質譜分析。在再一個方面，MSH3的總體表達水平包括將從個體得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在另一個方面，MSH3的總體表達水平包括使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交。本發明還描述了用于診斷結腸直腸癌的試劑盒，所述的試劑盒包括用于測定MSH3的差異表達水平的生物標記物檢測試劑和針對其在診斷結腸直腸癌風險中的應用的說明。在一個方面，與正常的受試者相比，在來自存在結腸直腸癌風險的患者的樣品中，MSH3mRNA和蛋白質表達水平均顯著降低。在另一個方面，與正常的受試者相比，在具有結腸直腸癌風險的患者中，MSH3mRNA表達水平降低。在再一個方面，與正常的受試者相比，在具有結腸直腸癌風險的患者中，MSH3蛋白質表達水平降低。最后，本發明提供了用于在人類受試者中，診斷或者檢測結腸直腸癌進展的方法，該方法包括步驟(i)鑒定懷疑患有結腸直腸癌的人類受試者，(ii)從該受試者得到一個或多個的生物樣品，其中所述的生物樣品選自組織樣品、糞便樣品、細胞勻漿和包含一種或更多種生物流體，(iii)在來自受試者的生物樣品的一個或者多個細胞中，測量MSH3的總體表達特征，并且(iv)將來自懷疑患有結腸直腸癌的受試者的生物樣品中的MSH3總體表達特征與來自正常的受試者的生物樣品的MSH3的總體表達特征進行比較，其中所述正常的受試者是未患有結腸直腸癌的健康受試者，其中在受試者的生物樣品中，MSH3的總體表達特征的下降意味著存在結腸直腸癌、具有發生結腸直腸癌的風險或者同時存在結腸直腸癌和具有發生結腸直腸癌的風險。在前文所公開的診斷方法的一個方面，MSH3mRNA、MSH3蛋白質或者MSH3mRNA和MSH3蛋白質兩者表達水平的顯著下降預示著存在侵襲性結腸直腸癌、具有發生侵襲性結腸直腸癌的風險或者同時存在侵襲性結腸直腸癌和具有發生侵襲性結腸直腸癌的風險。在另一個方面，測定MSH3的總體水平的步驟包括分析來自生物樣品中的一個或多個細胞的MSH3核酸表達。在另一個方面，測定MSH3總體表達水平的步驟包括將得自受試者的MSH3核酸進行質譜分析。在再一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括將從受試者得到的MSH3核酸的一部分進行滾環擴增。在一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交。在另一個方面，測定MSH3的總體表達水平的步驟包括免疫組織化學。在再一個方面，該方法用于治療有結腸直腸癌的風險或者患有結腸直腸癌的患者，用于選擇具有結腸直腸癌的風險或者患有結腸直腸癌的患者的DNA交聯劑治療，用于將患者分類為結腸直腸癌的亞組中或者用于結腸直腸癌治療臨床試驗，用于確定對結腸直腸癌治療具有抗性或者響應性，用于開發用于診斷結腸直腸癌的試劑盒，或者它們的任何組合。
為了更完全地理解本發明的特征和優點，現參考本發明的詳述以及所附的圖，其中圖I顯示了在由MSH3shRNA穩定地感染的得自HCTl 16+3+5的克隆中，MSH3的表達受到tet-off系統的控制(1A)在HCTl 16、HCTl 16+3、HCTl 16+3+5以及三個得自HCTl 16+3+5的克隆、GU G2和G5細胞中MSH3，MLHl和β -肌動蛋白的蛋白質印跡分析；(IB)在此1116+3+5、61、62和65細胞中，1013以及β -肌動蛋白的蛋白質印跡分析，其中所述的細胞在具有和不具有I μ g/ml的強力霉素的培養基中培養。按照密度計量學計算相關的MSH3表達，并且結果得自三次或更多次的獨立研究。圖2顯示了與富含MSH3的細胞(MSH3_prof icient cell)相比，缺乏MSH3的細胞對于順鉬和奧沙利鉬更為敏感(2A)使用順鉬處理的HCT116、HCT116+3、HCT116+3+5和G5細胞的無性系存活部分，(2B)使用含有或者不含I μ g/ml的強力霉素的培養基培養的G5細胞的無性系存活部分，該細胞使用順鉬處理，(2C)使用奧沙利鉬處理的HCT116、HCT116+3、HCTl 16+3+5和G5細胞的無性系存活部分，(2D)使用含有或者不含I μ g/ml的強力霉素的培養基培養的Gl、G2和G5細胞的無性系存活部分，該細胞也使用奧沙利鉬進行處理，(2E)S期的群體的減少，以及(2F) HCTl 16+3+5和Gl細胞的sub_Gl群體的增加，(2G)與未經處理的對照相比，相對的BrdU摻入的減少，以及(2H)在HCT116+3+5和G5細胞的免疫熒光中顯示出的抗-活性半胱天冬酶3陽性細胞的增加。將數據表示為來自三個或者更多個獨立的研究的平均值土平均值的標準誤(SE)。統計上的差異按照雙側Student t檢測確定(two-sided Student’ s t test)。星號 *、** 和 *** 分別代表 p < O. 05、p < O. 01 和 p< 0.001。NS代表P = O. 05或者P > 0.05。在此圖中顯示了來自三個缺乏MSH3的克隆之一的代表性數據。圖3顯示了 siRNA導致的MSH3的短暫耗盡也使得HCT116+3+5細胞對順鉬和奧沙利鉬敏感(3A)通過短暫的siRNA轉染得到的MSH3耗盡的HCT116+3+5細胞中MSH3和β-肌動蛋白的蛋白質印跡分析。在使用非靶向(對照)siRNA和使用MSH siRNA轉染之后，使用順鉬(3Β)以及奧沙利鉬(3C)處理的HCT116+3+5細胞系的無性系存活部分的比較。在siRNA轉染72小時之后提取細胞。在使用對照siRNA和MSH3siRNA進行轉染之后，使用順鉬(3E)和奧沙利鉬(3F)處理HT29細胞的無性系存活部分的比較。數據表示為來自五次獨立的試驗中的平均值土SE。統計上的差異按照雙側Student t檢測確定。星號*和**分別代表P < O. 05和P < O. 01 ；NS表示P彡O. 05。圖4顯示了使用siRNA短暫地耗盡MLHl不影響富含及缺少MSH3的細胞對于順鉬和奧沙利鉬的抗性(4A)短暫的siRNA轉染之后，在MLHl耗盡的HCT116+3+5和G5細胞中MLHl和β -肌動蛋白的蛋白質印跡分析；(4Β)在使用對照的siRNA或者MLHlsiRNA轉染之后，使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理的HCT116+3+5和G5細胞的無性系存活部分。在使用順鉬(4C)和奧沙利鉬(4D)處理的MLHl耗盡的HCTl 16+3+5和G5細胞之間，無性系存活部分的比較。數據表示為來自四次或更多次獨立試驗的平均值土SE。統計差異按照雙側Student t檢測確定。星號*和**分別代表P < O. 05和P < O. Ol ；NS表示p^O. 05。圖5證明了缺少MSH3的細胞顯示出DNA雙鏈斷裂修復效力的下降(5A)在使用強力霉素的HCTl 16+3+5、G5和不使用強力霉素的G5細胞中針對pH2AX核灶形成的熒光染色。所述的細胞使用5 μ M的奧沙利鉬處理6小時,并在所指示的小時數后通過免疫熒光進行分析。上方的圖；DAPI，下方的圖pH2AX ;(5B)在缺少MSH3的細胞中，pH2AX陽性細胞的低效率地減少，(5C)在使用強力霉素的G5以及無強力霉素的G5細胞中，針對53BP1核灶形成的免疫熒光染色。所述的細胞使用5 μ M的奧沙利鉬處理6小時，并在48小時后通過免疫熒光進行分析(5D)。在各個載玻片上至少數出100個細胞。數據表示為來自三次或四次獨立的試驗的平均值土SE。在缺少MSH3的G5和富含MSH3的G5之間的統計差異按照雙側Student t檢測確定。星號*和#分別代表p < O. 05和p < O. 01 ；NS表示p彡O. 05。圖6顯示了缺少MSH3細胞對于奧拉帕尼，一種PARP抑制劑，以及其與奧沙利鉬的組合是敏感的^A)HCT116+3+5、不含強力霉素的G5和含有強力霉素的G5細胞的無性系存活率，該細胞使用2 μ M的奧沙利鉬，2 μ M的奧拉帕尼及這兩種藥物的組合處理，以及(6Β)是ΗΤ29細胞的無性系存活率，該細胞使用I μ M的奧沙利鉬，2 μ M的奧拉帕尼及這兩種藥物的組合處理。數據表示為來自三次或更多次獨立的試驗的平均值土SE。統計差異按照雙側Student t檢測確定。星號*、#和林*分別代表p < O. 05、p < O. 01和p < O. 001。發明描述盡管在下文中詳細討論了制備和應用本發明的不同的實施方案，應該認識到本發明提供了多個可實施的發明構思，所述的發明構思可以在具體上下文的大范圍內實施。在此討論的具體實施方案僅僅說明了制備和使用本發明的特定方式，而不限制本發明的范圍。為了便于理解本發明，在下文中定義了多個術語。在此定義的術語與本發明相關領域具有普通技術人員所一般地理解的意義。術語如“一個”、“一種”以及“該”無意于僅指單個的實體，而包括可以用作說明的具體例子的大類。該術語在此用于描述本發明的特定實施方案，但是其使用不限制本發明，除非在權利要求中概述。在此使用的縮寫包括MMR，錯配的修復；MSI，微衛星不穩定性；CRC，結腸直腸癌；MeG，06-甲基鳥嘌呤；ICL，鏈間交聯；NER，核苷酸剪切補修復；HR，同源重組；PARP，聚(ADP-核糖)聚合酶；EMAST，在四核苷酸重復處的上升的微衛星改變；DSB，雙鏈斷裂；BrdU,溴脫氧尿苷；pH2AX，磷酸化的H2AX。如本文使用的，術語“結腸直腸癌”包括廣泛接受的醫學定義，該定義規定結腸直腸癌是醫學疾病，特征在于小腸下方(即大腸(結腸)，包括盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、 S形結腸以及直腸)的腸道細胞的癌變。除此之外，如本文所使用的，術語“結腸直腸癌”還進一步地包括這樣的醫學疾病，其特征在于十二指腸和小腸(空腸和回腸)內細胞的癌變。術語“組織樣品”(術語“組織”與術語“組織樣品”可交換地使用)應該理解為包括由一個或者多個細胞所組成的任意材料，其是單獨的或者與任意的基質復合，或者與任意的化學物質結合。該定義應包括任意的生物或有機材料，以及任意的細胞的亞部分，其產物或者副產物。“組織樣品”的定義應該理解為包括但不限于精子、卵子、胚胎和血液的組分。為了本發明的目的，術語“組織”還包括的是特定的非細胞結構如皮膚的真皮層，該真皮層來自于細胞但是不再具有細胞的特征。如本文所使用的術語“大便”是臨床術語，指人類排出的糞便。在本文使用的術語“基因”指編碼功能蛋白質、多肽或者肽的單元。如本領域的技術人員所理解的，這一功能性的術語包括兩個基因組序列、cDNA序列或者其片段或組合，以及基因的產物，包括可以經人工改變的那些。經純化的基因、核酸、蛋白質等等用于指從至少一種通常與其相關的污染核酸或者蛋白質中鑒定并分離出來的這些實體。術語“等位基因”或者“等位基因形式”指編碼同樣的功能性蛋白的基因的可選擇的形式，但是含有與同一基因的其他形式相關的核苷酸序列上的差異。如本文所使用的，“核酸”或者“核酸分子”指多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶鏈式反應(PCR)所產生的片段以及通過任意的連接、 剪切、核酸內切酶和核酸外切酶活動產生的片段。核酸分子可以由天然產生的核苷酸的單體組成(例如DNA和RNA)，或者由天然產生的核苷酸的類似物組成(例如天然產生的核苷酸的α-對映體形式)，或者兩者的組合組成。經修飾的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤堿基部分上有改變。糖的修飾包括，例如將一個或者多個羥基以鹵素、烷基、胺和疊氮基團替代，或者可以將糖功能化成為醚或者酯。除此之外，整個的糖部分可以用空間上和電子上類似的結構替換，如阿扎糖以及碳環的糖類似物。在堿基部分上修飾的實例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或者其他公知的雜環替代物。核酸單體可以通過磷酸二酯鍵或者該連接的類似物進行連接。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代憐酸酯、硒代憐酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroaniIothioate> phosphoranilidate、氨基憐酸酯等等。術語“核酸分子”還包括所謂的“肽核酸”，其包括連接到聚酰胺骨架上的天然產生的或者經修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈的或者雙鏈的。如本文所使用的，術語“雜交”指兩個單鏈的多核苷酸非共價結合，形成穩定的雙鏈多核苷酸的過程；三鏈的雜交在理論上也是可能的。所產生的(通常是)雙鏈的多核苷酸是“雜交物”。形成穩定的雜交物的多核苷酸的群體的比例在本文中稱作“雜交度”。雜交通常在嚴格的條件下進行，例如在鹽濃度不多于IM并且溫度為至少25°C下進行。例如，5XSSPE 的條件(750mM NaCl，50mM 磷酸鈉，5mM EDTA，pH 7.4)以及 25_30°C的溫度對于等位基因特異性的探針雜交而言是合適的。對于嚴格的條件，參見例如Sambrook, Fritscheand Maniatis. “Molecular Cloning A laboratory Manual ”第二版· Cold Spring HarborPress (1989)，其由于前述的所有目的，以全文的方式并入作為參考。如本文所使用的，術語“滾環擴增(RCA) ”描述了 DNA的復制和擴增的方法，該方法導致包括序列的一個或者多個拷貝的與原始環狀DNA的序列互補的核酸鏈。該擴增過程(產生互補的拷貝)包括將寡核苷酸引物雜交到環狀的靶DNA上，隨后進行等溫循環(例如，在連接酶和DNA聚合酶的存在下)。使用RCA的單輪擴增導致在環靶中產生大量序列的擴增，從而得到高濃度的所期待的位于核酸的單鏈上的寡核苷酸。由于所期待的核酸序列成為混合物中主要的序列(在濃度的意義上)，這稱作“RCA擴增的”。通過RCA，可能將一個拷貝的特定的核酸序列擴增到可以通過幾種不同的方法檢測的程度(如與經標記的探針雜交；在抗生物素蛋白-酶綴合物檢測之后加入生物素化的引物；在擴增的片段中加入32P標記的脫氧三磷酸核苷，如dCTP或者dATP)。如本文所使用的，術語“抗體探針”指對于任意靶抗原而言特異性并且與之結合的抗體。該靶抗原可以是抗體能夠特異性地結合的肽、蛋白質、碳水化合物或者任意的其他生物聚合物。如本文不同的實施方案中所使用的，術語“生物標記物”指體內的特定生物化學物質，其具有特別的分子結構，從而使其在診斷疾病、測量疾病的進展或者治療的效果中有用。例如，在人的呼吸中所發現的普通代謝物和生物標記物，以及提供該代謝物的人的相應的診斷狀況，所提供的該代謝物包括但不限于乙醛(來源乙醇、X-蘇氨酸；診斷中毒)，丙酮(來源乙酰乙酸鹽；診斷飲食/糖尿病)，氨(來源氨基酸的脫氨基作用；診斷尿毒癥及肝臟疾病)，CO(—氧化碳)(來源CH2C12，升高的％ COHb ;診斷室內空氣污染)，氯仿(來源鹵化物)，二氯苯(來源鹵化物)；二乙胺(來源膽堿；診斷腸道細菌過度生長)，H (氫)(來源腸；診斷乳糖不耐受性)，異戊二烯(來源脂肪酸；診斷代謝壓力)，甲硫醇(來源甲硫氨酸；診斷腸道細菌過度生長)，2- 丁酮(來源脂肪酸；診斷室內空氣污染/飲食)，鄰-甲苯胺(來源癌代謝物；診斷支氣管癌)，戊烷硫化物和硫化物(來源脂質過氧化；診斷心肌梗死)，H2S (來源代謝；診斷牙周病/排卵)，MeS (來源代謝；診斷肝硬化)以及Me2S (來源感染；診斷壞死性潰瘍性齦炎)。如本文所使用的，術語“免疫組織化學(IHC) ”當用于細胞時，也稱作“免疫細胞化學(ICC) ”，其指診斷病理學中的工具，其中可以在未分化的腫瘤的差異診斷中使用多組的單克隆抗體(例如，用于區分淋巴瘤、癌癥和肉瘤)，從而顯示對特定的腫瘤類型和其他疾病特異性的標記物，從而實現惡性淋巴瘤的診斷和分類，并且證明病毒性抗原、癌基因蛋白、荷爾蒙受體和增殖相關的核蛋白的存在。如本文所使用的，術語“臨床試驗”包括設計用于收集特定的治療帶來的臨床數據的任意研究，并且包括但不限于一期、二期及三期臨床試驗。為了限定患者群體并入選受試者，使用了標準的方法。術語在研究組之間的“統計學上的顯著性”差異指在使用合適的統計分析(例如卡方檢驗，t-檢驗)時，各組是一樣的概率小于5%的情形，例如P <0.05。換言之，在完全隨機的情況下，在100次嘗試中得到相同結果的概率少于5次。如本文所使用的，術語“候選的藥物”指任意來源的任意化合物，根據本發明的方法，其適用于篩選其在使MSH3表達降低的結腸直腸細胞數量減少上的活性。如本文所使用的，術語“基因毒性劑”定義為能夠引起人類的DNA或者基因損傷的化學試劑及物理試劑。致癌劑和誘變劑是化學的基因毒性劑的常見實例，而UV照射，y及X射線等等當其產生氧化的DNA產物時，是物理的基因毒性劑的常見實例。如本文所使用的，術語“抗腫瘤劑”指具有抑制哺乳動物，如人的腫瘤的發生或者進展的功能特性的藥劑，并且也指對轉移或者轉移可能性的抑制。 術語“試劑盒”或者“試驗試劑盒”指分析所需的試劑和佐劑的組合。盡管試驗試劑盒在大多數的情況下由數個單元組成，也可以使用單件的分析單元，這類似地被認為是試驗試劑盒。MSH3基因(保藏編號P20585)是DNA錯配修復(NMR)基因之一，其在缺少NMR的癌癥中頻繁地經歷體細胞突變。MSH3與MSH2 —起形成MutS β異源雙鏈核酸分子，其與藥物誘導的鏈間交聯(ICL)相互作用，所述的藥物如順鉬和補骨脂素。但是，MSH3在介導ICL誘導劑的細胞毒性作用中的確切作用仍然知之甚少。本發明人在此證明了缺少MSH3對于由順鉬和補骨脂素，其他的ICL誘導鉬藥物引起的細胞毒性的作用。
使用得自HCTl 16的克隆發現了 MSH3缺乏使得細胞對臨床相關劑量的順鉬和奧沙利鉬敏感化，所述的得自HCT116的克隆中MSH3的表達受到tet-off系統中的shRNA控制。有趣的是，siRNA所誘導的MLHl蛋白下調不影響這些藥物的MSH3-依賴性毒性，這說明了該方法不需要正確的MMR途徑的參與。除此之外，與富含MSH3的細胞相比，缺少MSH3的細胞在奧沙利鉬處理之后，保持了更高水平的磷酸化的H2AX和53BP1，這說明了 MSH3在修復DNA雙鏈斷裂(DSB)中起到了重要的作用。MSH3的這一作用進一步地受到在此的發現支持，在此發現中缺少MSH3的細胞對于奧拉帕尼，一種聚(ADP-核糖)聚合酶抑制劑具有敏感性。除此之外，奧沙利鉬和奧拉帕尼的組合與它們中任一種單獨地處理相比，呈現出協同作用。這些結果共同地證明了，通過不充分的DSB修復，MSH3的缺少增強了鉬藥物的細胞毒性。這些數據使得能夠對具有MSH3缺少的癌癥進行有效的預測和治療。關于基因(包括MSH3)和基因的系列在評價預后和/或預測癌癥對化學治療的響應中的有用性，本發明的發現與此前的發現相比顯示出了顯著的及新穎的變化。由Baker等人遞交的第20090305277號美國專利申請描述了基于測定至少一個基因的表達水平，預測被診斷為癌癥的人類患者的可能性的方法，該方法與本發明相反，也就是說包括MSH3的特定基因表達的上升與對化學治療的陽性響應上升的可能性呈正相關。然而該申請不包括細胞或者組織數據，卻使用了一般性的基因挖掘方法得到了他們的結論。DNA錯配修復(MMR)系統由幾個蛋白組成，所述的蛋白如MLH1、MSH2、MSH6、MSH3和PMS2，消除了復制的錯誤并保持基因組的穩定性。MutS α，一種MSH2/MSH6的異質二聚體，識別單個的堿基錯配，然而MutS β，一種MSH2/MSH3異質二聚體主要地識別2_4個bp的插入-缺失環(1,2)。MutL復合物，主要地為MutL α，一種MLH1/PMS2異質二聚體，與一種MutS異質二聚體形成四聚體復合物，該四聚體復合物在復制期間結合于DNA的錯配，并且導致募集其他蛋白質，從而完成DNA MMR的過程。在MMR基因中的種系突變導致林奇綜合征(Lynch syndrome),該病的特征在于遺傳地易患微衛星不穩定(MSI)的癌癥,所述的癌癥位于結腸、子宮內膜、卵巢及尿道(3，4)。與此相反，MLH啟動子的甲基化所導致的MMR缺少導致偶發的MSI腫瘤，其包括結腸直腸癌(CRC)( 15% )，子宮內膜癌(20 25% )和卵巢癌( 12% ) (4-6)。MMR系統也參與DNA損傷劑所產生的特定DNA加和物的修復，所述的DNA損傷劑如烷基化劑和6-硫鳥嘌呤。烷基化劑所產生的主要的細胞毒性損傷是O6-甲基鳥嘌呤CfeG),其導致sfeG-C或者sfeG-T的錯配(7)。MutSa識別這些錯配，并募集用于隨后的修復反應的MutL a (8,9) ο MutSa或者MutL α的丟失導致細胞對這些藥物的細胞毒性作用具有耐受性，這說明了這兩種復合物也與導致細胞生長抑制或者細胞死亡的信號轉導途徑有聯系(10，11)。另一方面，MutS β識別由DNA交聯劑所產生的鏈間交聯(ICL)，所述的DNA交聯劑如補骨脂素和順鉬。哺乳動物提取物中，補骨脂素所誘導的ICL的識別和分開涉及MutS β (12)。最近已經顯示MutS β與XPA-RPA或者XPC-RAD23B相互作用，這兩者均涉及核酸切除修復(NER)，補骨脂素ICL的識別，并且促進NER過程(13，14)。修復ICL的同源重組(HR)的水平也取決于MutSP，而非MutSa或者MLH1。這些結果說明，MutSP可以與NER、HR和Fanconi貧血癥蛋白協同作用，修復由補骨脂素誘導的ICL(15)。除此之外，MutS β還與PARP-1、DNA連接酶111、XRCC_1、Ku80和Ku70 —起結合于順鉬誘導的ICL，這說明MutSii也可以與其他的修復路徑協同作用，從而識別并修復鉬藥物所誘導的ICL。(16)奧沙利鉬，第三代的鉬藥物，是當前用于治療CRC患 者的主要藥物之一。與順鉬類似，奧沙利鉬也形成鏈內交聯及ICL (17)。然而，奧沙利鉬所誘導的加成物，尤其地ICL的修復和細胞毒性作用中所涉及的詳細分子機制仍然未得到廣泛探索。考慮到MutS β復合物在ICL的修復中起作用，本發明人認識到MSH3的缺乏可以使鉬藥物所誘導的ICL的修復停止，這導致這些藥物在癌癥患者中的細胞毒性增強。除此之外，由于MSH3的缺乏導致抑制的HR(15)，并且缺少HR的細胞對于聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑具有高度敏感性(18，19)，本發明人進一步地認識到MSH3的缺乏還可以導致細胞對PARP抑制劑的敏化。在MSI CRC中，在MSH3的外顯子中單核苷酸[八]8重復之內的頻繁的移碼突變(20-50%)導致MSH3的丟失或者減少(20-22)。最近，本發明人發現了MSH3陰性的癌癥細胞群體在偶發的CRC組織中存在，所述的細胞群體顯示出低的MSI水平和/或在四核苷酸重復位置升高的微衛星改變(EMAST) (23)。如果MSH3的缺少在臨床的環境下支配了鉬藥物和PARP抑制劑的毒性，可以將MSH3的狀態在缺少MSH3的患者中用作化學治療的預測性標記物。為了證明可以將MSH3的狀態在具有缺少的MSH3的癌癥患者中用作化學治療的預測性標記物，本發明人使用同基因的細胞系，其中MSH3蛋白質的表達可以通過tet-off系統中的shRNA的表達進行調節，并且研究了 MSH3缺少對于細胞對兩種鉬藥物及一種公知的PARP抑制劑的敏感性的影響。這些研究揭示了新的分子證據，在CRC細胞系中，MSH3的缺少對鉬藥物的細胞毒性，尤其是作為損傷性的雙鏈斷裂(DSB)修復的結果的細胞毒性有貢獻。試劑一順鉬，奧沙利鉬，N-甲基-V -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)及碘化丙唆購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。奧拉帕尼，一種 PARP 抑制劑，購自 SelleckChemicals(Houston,TX)。細胞系和細胞培養物一人類結腸癌細胞系HCT116、HCT116+ch. 3 (HCT116+3)、HCTl 16+ch. 3+ch. 5 (HCT116+3+5)均已在前文描述(10，23)。HCTl 16+3+5 細胞由四環素調節的反轉錄病毒載體穩定地轉染，所述載體為TMP(0pen Biosystems, Huntsville, AL),其編碼針對MSH3的shRNA。分離了穩定的缺少MSH3的克隆G1、G2和G5 (參見結果和(23))。在具有 10%胎牛血清的 IMDM(Invitrogen, Rockville, MD)中生長 HCT116、HCT116+3 和HCTl 16+3+5細胞。在含有10%胎牛血清和0. 6 μ g/ml的嘌呤霉素的HffiM中生長G1、G2和G5細胞。為了關閉MSH3shRNA的表達，在培養基中加入I μ g/ml的強力霉素。蛋白質印跡分析一如前所述地，由細胞裂解液制備蛋白質，將該蛋白質分離在SDS-PAGE上，并轉移到PVDF膜上(31)。使用抗_hMSH3鼠單克隆抗體(稀釋；I 250，Clone 52，BD Pharmingen，San Jose，CA)，抗-hMLHl 鼠單克隆抗體(I 200，G168-728，BDPharmingen)和抗-β-肌動蛋白抗體(I : 10000, Clone AC-15, Sigma-Aldrich)作為特異性蛋白檢測的一抗。使用山羊抗鼠抗體(I : 3000, sc-2005, Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA)作為二抗。信號放大和檢測通過將膜暴露于ECL試劑(GE Healthcare,Piscataway，NJ)，隨后在 Storm成像系統(Storm imaging system) (Amersham, Piscataway,NJ)上可視化來完成。無性系存活率分析一將200個細胞種在六孔板的各個孔中。為了測量順鉬或者奧沙利鉬所引起的細胞毒性，一旦細胞附著于板，便使用所述的藥物處理細胞24小時。為了測量奧拉帕尼所引起的細胞毒性，在試驗中將細胞繼續使用該藥物進行處理。在8-10天之后，計數群落的數量(大于50個細胞的群落)，并且測定藥物處理的與未處理的細胞中無性系存活率的相對變化。細胞周期分析一將一百萬個細胞種于IOcm的盤中。一旦附著，將所述的 細胞系使用奧沙利鉬處理24小時。在此后的48小時后，將細胞使用冷的PBS洗滌兩次，在冷的70%乙醇中-20°C下固定過夜或者持續幾天。隨后，將經乙醇固定的細胞(2X106)使用PBS洗滌兩次并且使用300 μ I的PBS和O. 15% RNase A在37°C下溫育15分鐘。將該細胞使用75 μ g/ml的碘化丙啶處理30分鐘，并隨后使用FACSCantoII流式細胞儀(FACSCantoIIflow cytometer) (BD Biosciences, San Jose, CA)分析其 DNA 含量。細胞周期數據使用Flowjo 軟件(Tree Star, Ashland, OR)進行分析。增殖分析一增殖指數通過溴脫氧尿嘧啶在HCT116+3+5和G5中的摻入來測定，該測定在最初使用順鉬或者奧沙利鉬(Cell Proliferation ELISA, BrdU, RocheDiagnositics, Indianapolis, IN)處理24小時之后48小時時進行。試驗進行三次，并且數據從三次或者四次的獨立試驗中得到。siRNA 處理一MLHl siRNA、MSH3siRNA 和非 IE 向的 siRNA 購自Dharmacon(Lafayette, CO)。將二十萬個細胞種在24孔板中。經過夜溫育之后，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)按照生產商的說明書，將該細胞使用83nM的靶向siRNA或者非靶向siRNA，進行轉染。轉染后兩天，收獲細胞并再次將細胞鋪板用于無性系存活率分析。免疫熒光染色一在12孔板中，將一萬個細胞在玻璃蓋玻片上生長。將細胞使用4%的多聚甲醛(pH 7. 5)在PBS中固定15分鐘，使用0. 3% Triton X-100滲透五分鐘，并隨后使用10%的山羊血清(Invitrogen, Carlsbad, CA)封閉I小時。隨后，將該細胞與抗活性的半胱天冬酶-3抗體(I : 500, G748, Promega, Madison, WI), —種抗磷酸化的H2AX(pH2AX)抗體(I 5000, JBW301, Millipore Corporation, Billerica, MA)或者一種抗 53BP1 抗體(I : 600, ab21083, Abeam, Cambridge, MA) 一起溫育 I 小時，隨后與二抗(I : 800, Alexa Fluor 555山羊抗小鼠或者抗兔抗體，Invitrogen) 一起溫育40分鐘。在封固培養基時使用了 Prolong Gold with DAPI (Invitrogen)。這些圖像使用配備有AxioVision軟件的AxioSkop2多通道落射突光顯微鏡(AxioSkop2 multichannelepifluorescence microscope equipped with the AxioVision software)(Carl Zeiss,Thornwood, NY)得到。在缺少MSH3的克隆中，MSH3的表達受到強力霉素的控制。本發明人首次確定了在HCT116 CRC細胞的G1、G2和G5細胞克隆中，MSH3的表達是否受到強力霉素的控制。將HCTl 16和HCTl 16+3細胞用作MSH3表達的陰性對照，以及將HCTl 16+3+5用作MSH3表達的陽性對照。HCT116和HCT116+3未顯示出可檢測的MSH3蛋白質表達(圖1A)，這與在MSH3外顯子7的單核苷酸重復中存在純合子移碼突變的HCTl 16細胞一致(23)。通過5號染色體的拷貝的轉移由缺少MSH3的HCT116+3產生的HCT116+3+5顯示出表達MSH3。盡管在沒有強力霉素的G1、G2和G5克隆中未檢測到MSH3，在這些克隆中，強力霉素的加入將MSH3的表達恢復到親代HCTl 16+3+5水平的約40-60% (圖IA和1B)。盡管期待在這些細胞系中甚至在強力霉素的存在下完全阻礙MSH3shRNA的產生具有技術挑戰性，但在本研究中，在這些結果中的蛋白質水平足以用來分析MSH3對藥物敏感性的效果，由于即使考慮到體外的EMAST表型，在G5細胞中的MSH3的該水平足以恢復MSH3的功能(23)。與富含MSH3的細胞相比，缺少MSH3的細胞對于順鉬和奧沙利鉬更為敏感。為了測定MSH3的狀態是否影響對兩種鉬藥物的細胞敏感性，檢查了 HCTl 16和得自HCTl 16的細胞系在順鉬處理的細胞中的無性系存活率情況。在缺少MLHl以及MSH3的HCT116與僅缺少MLHl的HCT116+3細胞系之間沒有觀察到順鉬敏感性上的顯著性差異，然而在富含MSH3的HCTl 16+3+5細胞系中觀察到了更高的耐受性(圖2A)。在不同的細胞系中，缺少MSH3的G5克隆比其親代的HCT116+3+5更為敏感(圖2A)。為了進一步確認MSH3的存在影響順鉬所誘導的細胞毒性，比較了在強力霉素存在及不存在下，G5細胞的無性系存活率。發現了MSH3表達的恢復使細胞對順鉬的不敏感(5 μ M ;圖2B)。這些結果表明，MSH3的耗盡導致細胞對順鉬的敏感。同時還分析了其他克隆，Gl和G2的無性系存活率，并且發現這些克隆與G5表現類似(數據未顯示)。這進一步地增強了 MSH3在順鉬導致的細胞毒性中的可能作用。隨后，測定了 MSH3的缺少是否也影響到對奧沙利鉬的細胞敏感性。出人意料地，缺少MSH3的HCTl 16、HCT116+3和G5顯著比親代的HCTl 16+3+5對奧沙利鉬更為敏感，就像順鉬的情況一樣(圖2C)。此外，觀察到了在缺少MSH3的細胞中，MSH3的恢復導致奧沙利鉬不敏感性的恢復(圖2D)。隨后，在缺少MSH3的細胞與經奧沙利鉬處理的缺少MSH3細胞之間比較了生長速率的抑制及凋亡水平。通過使用流式細胞儀，本發明人發現在缺少MSH3的細胞中，細胞生長抑制(圖2E)的程度和凋亡水平(圖2F)顯著地比在富含MSH3的細胞中更高。還分別通過BrdU分析和免疫熒光法，確認了在經奧沙利鉬處理的缺少MSH3的細胞中細胞增殖降低并且凋亡的部分增加。圖2G顯示了與未經處理的對照相比，相對的BrdU摻入的減少，并且圖2H顯示了在HCT116+3+5和G5細胞的免疫熒光中，抗-活性的半胱天冬酶陽性細胞的增加。這些結果與在本文中顯示的通過無性系分析所得到的生長抑制結果—致。通過siRNA轉染的MSH3的缺少也使細胞對順鉬及奧沙利鉬敏感。為了進一步確認與MSH3相關的對順鉬和奧沙利鉬的敏感性的作用，測定了短暫地轉染了 MSH3siRNA和非靶向的siRNA的細胞的無性系存活率頻率。在這些研究中，已知在HCTl 16+3+5細胞中，MSH3蛋白質表達在siRNA轉染之后72小時顯著地減少(與未處理的細胞相比98%的MSH3表達抑制)(圖3A)。將HCT116+3+5細胞用MSH3siRNA進行轉染，并且在轉染之后48小時，將所述的細胞暴露于順鉬(5 μ M和10 μ Μ)或者奧沙利鉬(2 μ M和5 μ Μ)。如圖3Β和3C中 所示，MSH3siRNA的轉染使得HCT116+3+5細胞與經非靶向的siRNA轉染的細胞系相比，變得對順鉬和奧沙利鉬更為敏感。為了進一步確認在缺少MSH3的細胞中這種對鉬藥物的敏感性的增加，將另一個結腸癌細胞系，HT29，使用MSH3siRNA或者非靶向的siRNA進行轉染。證實了在HT29細胞中，MSH3基本上被完全抑制(圖3D)，并且使用MSH3siRNA處理的HT29細胞變得對順鉬和奧沙利鉬兩者都更為敏感(圖3E和3F)。這些結果進一步加強了 MSH3的缺少使得細胞對順 鉬和奧沙利鉬敏感的這一發現。在富含MSH3和缺少MSH3的細胞中順鉬或者奧沙利鉬的敏感性是與結腸癌細胞中的MLHl狀態獨立地發生的。從臨床觀點來看，確定MSH3狀態是否影響MLHl也缺少的癌癥患者是否對于順鉬和奧沙利鉬的敏感性是重要的。為了解決這一問題，通過誘導siRNA介導的MLH表達的下調，比較了缺少MSH3的G5細胞和富含MSH3的細胞對于順鉬和奧沙利鉬的敏感性(圖4A)。當MLHl在由MLHlsiRNA轉染的HCTl 16+3+5和G5細胞中均下調時，兩種細胞系與未經處理的對照細胞系相比，均變得對MNNG更具抗性(圖4B)，從而在這些情況下確認了 MLHl的功能抑制(10，11)。有趣的是，在這一情況下，觀察到G5細胞與HCT116+3+5相比，對于順鉬和奧沙利鉬更為敏感(圖4C和4D)。這些結果證明了 MSH3依賴的對順鉬和奧沙利鉬的敏感性與MLHl狀態是獨立發生的。缺少MSH3的細胞證實了在奧沙利鉬處理后，持續的PH2AX和53BP1水平。鉬藥物誘導DNA的鏈內交聯以及ICL，并且一些損傷最終導致繼發的DNA雙鏈斷裂(DSB)，據推測是解體的復制叉所導致的(24)。為了確定MSH3是否包含在DSB的修復中，使用免疫熒光染色分析了核PH2AX，一種DNA DSB的替代標記物的水平隨時間的變化(25)。發現富含和缺少MSH3細胞系在奧沙利鉬處理之前和之后，pH2AX核灶陽性的細胞數目沒有變化。相反，觀察到在缺少MSH3的G5細胞中，與MSH3恢復的G5細胞以及HCT116+3+5細胞系相比，在奧沙利鉬處理的48小時和72小時期間，pH2AX核灶陽性的細胞數目減少的速度更低(圖5A和5B)，表明DSB修復僅在缺少MSH3的細胞系中受到損害。為了進一步地確認這種DSB修復的效率低下，使用抗-53BP1抗體，另一種檢測DNA DSB的標記物進行了免疫熒光測試。證實了在奧沙利鉬處理之后，在缺少MSH3的G5細胞中持續的53BP1水平(圖5C和5D)。這些結果顯示了缺少MSH3的細胞對于奧沙利鉬具有的更高的敏感性可能部分由于降低的DNA DSB修復效率，而不是由于處理所誘導的DNA損傷負擔的數量上的差異。缺少MSH3的細胞對奧拉帕尼，PARP抑制劑也是敏感的。PARP抑制劑增加單鏈斷裂的數目，其最終導致由HR系統修復的DNA DSB。缺少HR的細胞對PARP抑制劑是高度敏感的，由于它們不能修復這些DSB (18，19)。MSH3在DSB修復中可能的功能從結果(圖5A-5D)中得到證明，這促使進一步地調查缺少MSH3的細胞是否也對PARP抑制劑敏感。如圖6A中所顯示的，缺少MSH3的細胞與恢復了 MSH3的G5細胞系相比，對奧拉帕尼更為敏感。這些數據清楚地支持在CRC細胞中，MSH3在DSB修復中的作用。除此之外，在缺少MSH3的G5細胞中，與親代的HCT116+3+5相比，奧沙利鉬和奧拉帕尼的組合在細胞毒性中顯示協同效應。該效應在使用MSH3siRNA的短暫壓制系統(knockdown system)中，通過兩種其他的結腸癌細胞系HT29(圖6B)和SW480(數據未顯示)得到證實。這些結果證實了鉬藥物和PARP抑制劑對缺少MSH3的癌癥的聯合治療。本研究闡明了 MSH3的損失影響由鉬藥物引起的細胞敏感性。該觀察可以用于建立診斷和治療策略，其中在缺少MSH3的腫瘤患者中MSH3的狀態可以用作化學治療結果的預測性標記物。總地來說，通過使用MSH3表達受到tet-off系統調節的同基因結腸癌細胞系，證實了在結腸癌細胞中，MSH3表達的缺失使得所述的癌細胞不僅對順鉬，而且對奧沙利鉬及PARP抑制劑敏感化。盡管MSH3牽涉到DNA DSB修復中的確切機理仍待進一步探索，這些數據說明，這些效果可以由缺少MSH3的細胞的降低的修復DSB的能力來很好地解釋，所述的DSB是在使用這些藥物處理之后引起的。這是首次證實了 MSH3的選擇性抑制增加了針對鉬藥物和PARP抑制劑增強的細胞敏感性。此外，這些結果證實了這種MSH3依賴的針對順鉬和奧沙利鉬的敏感性增加不受MLHl下調的影響，并且很可能對于標準的MMR系統是獨立的。
MutS和MutL同源物在ICL修復中的作用已經通過補骨脂素ICL進行了徹底研究(12-15, 26) 0這些數據說明與其他蛋白如NER和HR蛋白結合，MutSii牽涉到特定類型的ICL的識別及處理中，并且說明了 MutS β與其在MMR中的主要功能獨立地也在ICL修復中起作用。此處的這些發現顯示，缺少MSH3的細胞對于順鉬和奧沙利鉬是敏感的，并且這一事實與MLH功能獨立，以上的結果與使用補骨脂素ICL的發現是一致的。這些結果顯示了 MutSP牽涉到ICL加成物所導致的有毒性的DSB的修復中。首先，有證據顯示MSH3與DSB損傷呈現出共定位，所述的DSB損傷由激光(27)以及由致癌物如六價鉻(28)誘導產生。其次，本發明人意識到在奧曬鉬處理之后，與富含MSH3的細胞相t匕，在缺少MSH3的細胞中與DSB共同定位的pH2AX和53BP1具有持續的水平。第三，缺少MSH3的細胞對于PARP抑制劑是敏感的，所述的PARP抑制劑誘導DSB。因此，這些數據顯示，由于MSH3缺少導致的未修復的DSB是細胞死亡的直接原因。然而，近期的研究顯示出，與具有MSH2G674D突變的小鼠中的腫瘤相比，在無MSH2的小鼠中產生的腫瘤對于順鉬，以及對于5-FU和奧沙利鉬的組合更具抗性(29)。有趣的是，盡管該錯義突變導致MMR活性的損失，其仍然對于DNA損傷是敏感的。這些結果顯示出MSH2在MMR活性以及化學敏感性中具有區別的功能(29)。已經證明了在順鉬處理之后，細胞凋亡途徑中涉及的不同蛋白如JNK和c-Abl的活化中需要MSH2和MLHl (30)，然而，MutS α或者MutS β，或者MutS α和MutSii兩者是否牽涉到順鉬或者奧沙利鉬的信號轉導途徑中還不清楚。然而，由于該結果表明，MSH3的損失增加了對順鉬及奧沙利鉬的敏感性，MutS β很可能主要參與DNA損傷的修復中，以及MutSa參與到修復及導致細胞死亡的信號轉導途徑中。進一步的研究可以解釋MutSa或者MutSP在DNA損傷修復以及這些藥物導致的損傷信號轉導中的具體作用。缺少MSH3的細胞對順鉬和奧沙利鉬的敏感性這一結果和此前Vaisman等人的報道(31)不一致。Vaisman等人的研究報道了針對這些藥物的敏感性在缺少MSH3的HHUA細胞和與5號染色體互補的富含MSH3的HHUA細胞之間并無不同(31)。在他們的研究中，5號染色體的數百個其他基因的影響未加以排除；因此在本文中所獲得的數據更為有力，由于使用了 HCT116結腸癌細胞的同基因的克隆，其中MSH3的表達按照需要選擇性地進行了調節。從臨床的角度來看，本文中所給出的結果證實了相當大群體的MSI CRC患者可以從基于奧沙利鉬的處理方案、PARP抑制劑或者尤其地，兩者結合的治療方法中獲益。在CRC中，許多近期的研究顯示，三期MSI癌癥的患者從5-FU佐劑化學治療中不獲益(32-34)。除此之外，Bertagnolli等人報道了三期MSI癌癥的患者從含有5-FU和伊立替康的佐劑化學治療中獲益(35)，然而另一個研究報道了這些患者并不從這一佐劑治療中獲益(36)。這些不一致的結果提高了具有患者的亞組的可能性，在各亞組之間在MSICRC中具有不同的化學敏感性。例如，這些結果顯示至少有兩個亞群體的缺少MLHl的CRC，富含MSH3的和缺少MSH3的CRC，并且這些可能依據MSH3狀態對奧沙利鉬、PARP抑制劑及其組合的響應不同。除了 MSH3外，在MSI癌癥中使其他幾個DNA修復基因發生突變。MREllA和RAD50是在MSI癌癥中最經常突變的基因(22)，其產物在DSB修復復合物MREllA-hRAD50-NBSl中產生。已經證明了在MREllA和RAD50中的突變增加了對伊立替康的敏感性，所述的伊立替康在培養的細胞中誘導繼發的DSB (37，38)。這些結果顯示，MSH3的缺少使細胞對SN-38敏感，所述的SN-38是伊立替康的活性代謝物(數據未顯示)。除此之外，磷酸酶和強力蛋白同系物的損失，另一種在MSI中經常發生突變的基因顯示出通過HR修復的無效，使得細胞對PARP抑制劑敏感(39，40)。因此，分析這些DSB修復中涉及的基因或者蛋白質對于預測MSI癌癥患者的治療結果是有幫助的。用于驗證作為MSI癌癥的藥物治療的預測標記物的臨床研究得到保證。此前，本發明人證實了 MSH3表達的損失導致EMAST和MSI低的表型，并且在偶發的CRC組織中，MSH3表達的實質減少與EMAST有關(23)。除此之外，多數MSI低的CRC和相當比例的MSS腫瘤顯示出EMAST，這表明這些組織可能經歷過MSH3的缺少(23)。MSH3缺 少可能與缺少MLHl的CRC(20)的疾病進展，以及MSI低的CRC具有差的預后(41，42)有關，這提高了 MSH3的損失可以與CRC的轉移和重現的促進相關這一可能性。在這種環境下，含有MSH3陰性的癌癥細胞種群的偶發性CRC使用鉬藥物或者PARP抑制劑，或者兩者處理，可以抑制疾病的進展。總而言之，本文證明了缺少MSH3的細胞對于順鉬、奧沙利鉬和PARP抑制劑是敏感的，這可能是由DNA DSB減少的修復造成的。這些發現有助于更好地理解MSH3在DNA修復和藥物敏感性中的功能，以及有助于預測及改進具有缺少MSH3的癌癥的患者的治療結果。預期的是，本說明書中所討論的任何實施方案可以通過關于本發明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物來實施，反之亦然。此外，本發明的組合物可以用于實現本發明的方法。要理解的是，本文所述的具體實施方案是通過舉例說明而不是限制本發明的方法來展示的。本發明的主要特征可以在不脫離本發明范圍的情況下用于各種實施方案中。本領域技術人員將認識到，或者僅僅利用例行的實驗能夠確定，本文所述具體步驟的許多等同物。這樣的等同物被認為是在本發明的范圍內，且被權利要求所涵蓋。本說明書中提到的所有出版物和專利申請指示了本發明所涉及領域的技術人員的水平。所有的出版物和專利申請均引入本文作為參考，其引入的程度如同各個獨立的出版物或專利申請具體并獨立地被指明弓I入作為參考。詞語“一個”或“一種”當與權利要求和/或說明書中的術語“包含”結合使用時，可以指“一種”，但其也與“一種或多種”、“至少一種”和“一種或多于一種”的意思相一致。在權利要求中所使用的術語“或者”是指“和/或”，除非明確指明僅僅是指供選擇物，或供選擇物為相互排斥的，盡管公開內容支持僅僅指供選擇物及“和/或”的定義。在整個本申請中，術語“大約”用來說明這樣的值，其包括裝置和用來測定所述值的方法的誤差的固有變化，或者研究受試者之間存在的變化。如在本說明書和權利要求書中所使用的，詞語“包含”(以及任何形式的“包含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”)或“含有”(以及任何形式的“含有”)是包括的或開放式的，且不排除額外的，未述及的元素或方法步驟。如本文所使用的，短語“大體上由..·組成”將權利要求的范圍限定至指定的物質或步驟和未在實質上影響要求保護的發明的基本和新穎的特征。如本文所使用的，短語“由...組成”不包括在權利要求中指定的任何元素、步驟或者成分，除了例如通常與元素或限制有關的雜質。
本文所使用的術語“或其組合”是指在該術語之前所列舉項目的全部排列和組合。例如，“A、B、C或其組合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一種，并且如果在特定的上下文中順序是重要的，那么還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續這個例子，明顯包括的是包含一種或多種項目或術語的重復的組合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等等。本領域技術人員將理解的是，通常對任何組合中的項目或術語的數目沒有限制，除非從上下文中另外是明顯的。 如本文所使用的，表示近似的詞語如但不限于“約”、“基本的”或者“基本上”指這樣的情況，當這樣修飾時理解為并非必須是絕對的或者精確的，而應認為是足夠地接近本領域技術人員認為與當前的情況一樣可以使用的情況。說明書可以變化的程度取決于進行多大的變化之后，仍然使得本領域技術人員認為經改變的特征仍然具有所需的性質和未經改變的特征所具有的能力。總地來說，與前面的討論一致地，使用表示近似的詞語如“約”修飾的數值可以從所宣稱的數值變化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15%。
根據本發明的公開內容，在沒有不適當的實驗下可以制備和實施本文所公開和要求保護的全部組合物和/或方法。盡管已就優選的實施方案描述了本發明的組合物和方法，但是對于本領域技術人員來說明顯的是，在不脫離本發明的構思、精神和范圍的情況下，可以改變本文所述的組合物和/或方法以及方法的步驟或方法的步驟的順序。所有這樣相似的對本領域技術人員而言明顯的取代和修飾被認為是在所附的權利要求所限定的本發明的精神、范圍和構思內。參考文獻第7，252，955 號美國專利Method of Detecting Colon Cancer.第7，575，928 號美國專利Genes for Diagnosing Colorectal Cancer.第7，022，472 號美國專利Mutations in Human MLHl abd Human MSH2 Genesuseful in Diagnosing Colorectal Cancer.第20090305277號美國專利申請GeneExpression Markers for Prediction ofPatient Response to Chemotherapy.I. Kunkel，T. A.，and Erie, D. A. (2005) Annu. Rev. Biochem. 74，681-7102. Jiricny, J. (2006) Nat. Rev. Mol.Cell Biol. 7，335-3463. Hendriks, Y. M.，de Jong, A. E.，Morreau, H.，Tops，C. M.，Vasen，H. F.，Wi jnen,J. T.，Breuning, M. H.，and Brocker-Vriends, A. H. (2006) CA Cancer J. Clin. 56，213-2254. Boland，C. R.，and Goel, A. (2010) Gastroenterology 138，2073-2087 e20735. Black，D.，Soslow, R. A.，Levine, D. A.，Tomos，C.，Chen, S. C.，Hummer, A. J.，Bogomolniy, F.，Olvera, N.，Barakat, R. R.，and Boyd, J. (2006) J. Clin. Oncol. 24，1745-17536. Pal，T.，Permuth-Wey, J.，Kumar, A.，and Sellers, T. A. (2008)Clin. CancerRes.14,6847-68547. Duckett，D. R.，Drummond, J. T.，Murchie, A. I.，Reardon, J. T.，Sancar, A.，Lilley, D. M.，and Modrich，P. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93，6443-64478. de Wind, N.，Dekker, M.，Claij, N.，Jansen，L，van Klink，Y.，Radman, M.，Riggins，G.，van der Valk, M. , Vanr t Wout, K. , and te Riele，H. (1999) Nat. Genet. 23，359-362
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權利要求
1.一種用于預測具有患一種或多種腺癌的風險，或者診斷患有一種或多種腺癌的患者的治療方案的療效的方法，所述方法包括 測定得自患者的懷疑為腺癌細胞的細胞中的MSH3的總體表達；并且 根據在患者細胞中MSH3的總體表達的測定，預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑的治療方案的效果，其中與正常細胞中MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對抗腫瘤劑治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的抗腫瘤劑給予患者。
2.權利要求I所述的方法，其中所述的腺癌包括實體瘤，所述的實體瘤選自結腸直腸癌(CRC)、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、陰道癌、乳腺癌、食 道癌、胰腺癌和胃癌。
3.權利要求I所述的方法，其中所述的腺癌是CRC。
4.權利要求I所述的方法，其中所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑為腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達，MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。
5.權利要求I所述的方法，其中所述的測定得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
6.權利要求I所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑選自1，3_二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和電離輻射。
7.權利要求I所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑，所述鏈間交聯劑選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素。
8.權利要求I所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑選自奧拉帕尼、異吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
9.一種用于治療具有患結腸直腸癌的風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者的方法，所述的方法包括 測定得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞中的MSH3的總體表達；并且 根據在患者細胞中MSH3的總體表達的測定，預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑的治療方案的效果，其中與正常結腸直腸癌細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達的減少表明對抗腫瘤劑治療的響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的抗腫瘤劑治療給予患者。
10.權利要求9所述的方法，其中所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑為腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達，MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。
11.權利要求9所述的方法，其中所述的從得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸測定MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
12.權利要求9所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑選自1，3_二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和電離輻射。
13.權利要求9所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑，所述鏈間交聯劑選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素。
14.權利要求9所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑選自奧拉帕尼、異吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
15.一種為具有患結腸直腸癌風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者選擇癌癥治療的方法，所述的方法包括 測定患者的MSH3的總體表達水平，并且預測使用用于治療患者的抗腫瘤劑治療的療效，其中MSH3的總體表達的減少表明DNA交聯劑對于患者而言是適合的治療。
16.權利要求15所述的方法，其中所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達、MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。
17.權利要求15所述的方法，其中所述的從得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸測定MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
18.權利要求15所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑選自1，3_二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、達卡巴嗪、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔紅霉素、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、馬法蘭、絲裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康和電離輻射。
19.權利要求15所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是鏈間交聯劑，所述鏈間交聯劑選自順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、呋喃香豆素或補骨脂素。
20.權利要求15所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑選自奧拉帕尼、異吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
21.一種用于將患者分類到癌癥治療的臨床試驗的亞組中的方法，所述的方法包括步驟 測定得自患者的懷疑為癌細胞的細胞中的MSH3的總體表達；并且 預測使用用于治療患者的候選藥物治療的療效，其中與正常細胞中的MSH3的表達相t匕，患者細胞中的MSH3的總體表達的減少表明對使用該候選藥物治療響應性的傾向，其中所述的治療包括將有效量的候選藥物給予患者，并且MSH3的表達水平使得患者能分類到臨床試驗的亞組中。
22.權利要求21所述的方法，其中所述的癌細胞是位于實體瘤內的，并且選自結腸直腸癌(CRC)、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、陰道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。
23.權利要求21所述的方法，其中所述的癌細胞是結腸直腸癌細胞。
24.權利要求21所述的方法，其中所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑是腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達、MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。
25.權利要求21所述的方法，其中所述的測定得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
26.權利要求21所述的方法，其中所述的候選藥物是基因毒性劑。
27.權利要求21所述的方法，其中所述的候選藥物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑。
28.一種用于將患者分類到結腸直腸癌的亞組中的方法，所述的方法包括步驟 測定得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞中的MSH3的總體表達；并且 預測結腸直腸癌的階段，其基于與正常的結腸直腸癌細胞中的MSH3的表達相比，在患者的細胞中的MSH3的總體表達的變化。
29.一種用于治療具有患結腸直腸癌的風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者的方法，所述的方法包括 測定得自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞中MSH3的總體表達，其中MSH3的總體表達的變化表明了對于采用一種或者多種DNA交聯劑治療的響應性的傾向； 給予治療上有效量的DNA交聯劑，所述的DNA交聯劑的量足以減少結腸直腸癌細胞中的MSH3表達；并且 測定在患者中MSH3的總體表達的持續降低。
30.一種用于進行臨床試驗從而評估候選藥物的方法，所述的候選藥物據相信在治療與MSH3基因表達有關的疾病狀態中有用，該方法包括 a)測定來自一組患者的懷疑具有結腸直腸癌的組織中的MSH3表達的水平； b)將候選藥物給予第一亞組的患者，并將安慰劑給予第二亞組的患者； c)在給予候選藥物或者安慰劑之后，重復步驟a);并且 d)測定所述的候選藥物是否減少了結腸直腸癌的細胞的數目，所述的細胞具有降低的MSH3表達，該降低與第二個亞組的患者中所發生的任何降低相比具有統計學上的顯著性，其中統計學上的顯著性降低表明所述的候選藥物在治療所述的疾病狀態中是有用的。
31.一種用于確定哺乳動物的結腸直腸癌對于DNA損傷劑是否很可能具有抗性或者是有響應的方法，所述的DNA損傷劑用于結腸直腸癌的治療，該方法包括以下步驟 檢測來自所述癌癥的生物樣品中MSH3的總體表達的下降；并且 將所述的結腸癌鑒定為對該DNA損傷劑有反應或者具有增強的敏感性，其中在生物樣品中降低的MSH3的表達或者活性是對DNA損傷劑的指示或者響應。
32.一種用于結腸直腸癌疾病進展的生物標記物，其中所述的生物標記物是MSH3，并且與正常的結腸直腸癌細胞，或者在更早的時間點上得自同一患者的結腸直腸癌細胞中的MSH3表達相比，從患者中得到的結腸直腸癌細胞中MSH3的總體表達的減少意味著結腸直腸癌疾病的進展。
33.權利要求32所述的生物標記物，其中測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑為腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達、MSH3核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3核酸表達兩者都分析。
34.權利要求32所述的生物標記物，其中測定得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
35.一種用于診斷結腸直腸癌的試劑盒，所述的試劑盒包括用于測定MSH3的差異表達 水平的生物標記物檢測劑和針對其在診斷結腸直腸癌風險中的應用的說明。
36.權利要求35所述的試劑盒，其中在來自具有患結腸直腸癌風險的患者的樣品中，MSH3mRNA和蛋白質表達水平與正常受試者相比均顯著地降低。
37.一種用于診斷或者檢測人類受試者的結腸直腸癌進展的方法，該方法包括以下步驟 鑒定懷疑患有結腸直腸癌的人類受試者； 從該受試者得到一個或多個的生物樣品，其中所述的生物樣品選自組織樣品、糞便樣品、細胞勻漿物和所包含的一種或更多種生物流體； 測定來自受試者的生物樣品中的一個或者多個細胞中的MSH3的總體表達特征；并且 將來自懷疑患有結腸直腸癌的受試者的生物樣品中的MSH3的總體表達特征與來自正常的受試者的生物樣品的MSH3的總體表達特征進行比較，其中所述正常的受試者是未患有結腸直腸癌的健康受試者，其中在受試者的生物樣品中，MSH3的總體表達特征的下降意味著存在結腸直腸癌、具有發生結腸直腸癌的風險或者存在結腸直腸癌和具有發生結腸直腸癌的風險。
38.權利要求37所述的方法，其中所述的測定MSH3的總體表達水平的步驟包括分析懷疑為腺癌細胞的細胞的MSH3蛋白表達、MSH3mRNA核酸表達或者MSH3蛋白表達和MSH3mRNA核酸表達兩者都分析。
39.權利要求37所述的方法，其中MSH3mRNA、MSH3蛋白質或者MSH3mRNA和MSH3蛋白質兩者的表達水平的顯著降低說明存在侵襲性結腸直腸癌、具有發生侵襲性結腸直腸癌的風險或者存在侵襲性結腸直腸癌和具有發生侵襲性結腸直腸癌的風險。
40.權利要求37所述的方法，其中所述的測定得自個體的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的總體表達水平的步驟包括進行質譜分析，滾環擴增，免疫組織化學分析，使用等位基因特異性探針、抗體探針或者使用等位基因特異性探針和抗體探針兩者進行雜交，或者其任意的組合或者修改。
41.權利要求37所述的方法，其中所述的方法用于治療存在患結腸直腸癌的風險或者患有結腸直腸癌的患者，用于選擇用于存在患結腸直腸癌的風險或者患有結腸直腸癌的患者的DNA交聯劑治療，用于將患者分類到結腸直腸癌的亞組中或者用于結腸直腸癌治療臨床試驗，用于確定針對結腸直腸癌治療方案的抗性或者響應性，用于開發用于診斷結腸直腸癌的試劑盒，或者其任意的組合。
全文摘要
本文公開了治療具有患結腸直腸癌的風險或者診斷患有結腸直腸癌的患者的方法。本發明的方法確定了來自患者的懷疑為結腸直腸癌細胞的細胞中的MSH3的總體表達水平，并預測使用有基因毒性的抗腫瘤劑治療患者的療效，其中與正常的結腸直腸癌細胞中MSH3的表達相比，在患者的細胞中MSH3的總體表達水平的下降表明對基因毒性抗腫瘤劑治療的響應性的傾向性，其中該治療包括將有效量的基因毒性抗腫瘤劑治療給予患者。
文檔編號C12Q1/68GK102636648SQ20111022834
公開日2012年8月15日 申請日期2011年8月10日 優先權日2011年2月12日
發明者A·古勒, C·R·伯蘭德, 兒井稔, 高橋雅信 申請人:貝勒研究院