專利名稱：一種大豆葉片特異性啟動子srs4及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，確切地說是大豆葉片光控基因SRS4啟動子及其在轉基 因植物中的應用。
背景技術：
大豆為蝶形花科大豆屬一年生草本植物，種子含有豐富的蛋白質，原產我國，至今 已有5000年的種植史。大豆不僅是重要的食用油脂和蛋白食品原料，而且是飼養業重要的 蛋白飼料來源，是我國重要的糧油作物之一。我國是大豆生產大國，但由于我國大豆種植面積減少及食用油消費量的不斷增長 和養殖業發展對豆粕需求的增加，導致我國大豆需求量迅速增加，如今我國也成為世界最 大的大豆凈進口國。目前，利用傳統育種，改良栽培等方法提高大豆產量已陷入瓶頸；因此，利用基因 工程來獲得優質高產和穩產大豆是我國的當務之急。植物基因工程研究的主要內容是基因的表達和調控，但外源基因表達量不足是不 能獲得理想轉基因植物的重要原因。啟動子在決定基因表達方面起著關鍵作用，因此選擇 合適的植物啟動子是增強外源基因表達的首要問題。組成型啟動子在轉基因植物應用中暴露出一些問題，如外源基因在整株植物中 表達，產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累，打破了植物原有的代謝平衡；有些 產物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡。因此，人們必 需尋找特異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調控外源基因表達。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，是光合植 物葉片中含量最豐富的蛋白質，約占可溶性總蛋白的50% ；也是光合作用中的關鍵酶。 Rubisco由8個大亞基(rbcL)和8個小亞基(rbcS)組成，其中由核基因編碼的小亞基基因 的表達受光調控，并具有組織特異性。
發明內容
本發明的目的是提供一種大豆葉片特異性啟動子SRS4。一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，它的堿基序列如SEQ ID No. 1所示；它是以大豆“吉農13”基因組DNA為模板，以SS 5~ -GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3“ SA 5~ -TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3“為引物，通 過PCR方法擴增獲得。一種含有堿基序列為SEQ ID No. 1基因的植物表達載體。本發明另一個目的是，一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，在轉基因植物中的應用， 特別是轉基因大豆中的應用。本發明一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，是用本發明人獨特發計的引物，以大豆 “吉農13”基因組DNA為模板，采用TAIL-PCR克隆了大豆rbcS基因SRS4啟動子5、側翼，根據TAIL-PCR所得序列和已知序列設計特異引物，克隆大豆rbcS基因SRS4啟動子，并構 建其植物表達載體，用農桿菌介導的煙草遺傳轉化，表達GUS基因的方式進行篩選，篩出一 種葉片特異性光控啟動子SRS4。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，具有雙重 功能，既能催化RuBP與CO2形成3-磷酸甘油酸的反應，又能催化RuBP與O2氧化裂解形成 3_磷酸甘油酸、磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反應；因此，RuBP羧化酶是處于光合碳還原和光 合碳氧化兩個相反方向但又相互連鎖的循環交叉點上，它的含量和活性變化對植物凈光合 效率起著決定性作用；為建立植物轉基因表達的時、空、量三維調控系統奠定理論基礎；對 研究基因表達調控、構建基因工程載體、表達目的蛋白、提高產量有著重要的意義。
圖1為TAIL-PCR產物的電泳分析，M :DL2000 ；1，2，3泳道AD2和特異引物組合所 得的第1，2，3輪PCR產物；圖2為大豆rbcS啟動子SRS4的電泳分析，M :DL2000 ；1 大豆rbcS啟動子的PCR產物。圖3為重組質粒的PCR及酶切鑒定，M:DL2000，1 重組質粒的PCR鑒定，2 重組質 粒的雙酶切鑒定。
具體實施例方式實施例1 提取大豆“吉農13”基因組DNA將大豆“吉農13”種子播在裝好砂的營養缽中，放在RXZ型智能人工氣候培養箱中 培養。種子出芽前采用暗培養，出芽后采用Hoagland營養液培養，白天25°C，黑夜16°C，光 照16h/d，光強30001x，相對濕度75% ；取生長2周的大豆幼苗嫩葉，按照AxyPr印基因組 DNA小量提取試劑盒進行，提取大豆“吉農13”基因組DNA ；用紫外分光光度計測定DNA在260nm和280nm處吸光度，計算DNA濃度與純度，所 得 DNA 濃度為 OD260/OD280 = 1. 865，純度為 850ng/ μ 1 ；實施例2大豆rbcS基因SRS4啟動子側翼序列的克隆采用TAIL-PCR克隆大豆rbcS啟動子5、側翼序列，操作程序參照劉耀光等的方法。引物來源依據NCBI登錄的大豆RuBP羧化酶小亞基基因(SRS4)編碼區上游DNA 序列(GeneBank accession :M16889)設計退火溫度較高(60°C -65°C )的3個特異引物 SP1，SP2，SP3 ；經過獨特設計的退火溫度較低(40°C -45°C )的兼并引物AD2保存于本實驗 室(表1)。表1:引物及堿基組成
權利要求
一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，它的堿基序列如SEQ ID No.1所示；
2.權利要求1所述的一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，其特征在于它是以大豆“吉 農13”基因組DNA為模板，用下述引物SS 5~-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3~ SA 5~-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3~ 通過PCR方法擴增獲得。
3.一種含有堿基序列為SEQ ID No. 1基因的植物表達載體。
4.一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，在轉基因植物中的應用。
5.一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，在轉基因大豆中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種大豆葉片特異性啟動子SRS4及在轉基因植物中的應用，它是用獨特設計的引物，以大豆“吉農13”基因組DNA為模板，克隆了大豆rbcS基因啟動子SRS4并構建植物表達載體，命名為Pcambia-GrbcSP；采用農桿菌介導的煙草遺傳轉化，表達GUS基因的方式進行功能驗證，從大豆中獲得了一種特異性光控啟動子，大豆葉片特異性啟動子SRS4，可應用于轉基因植物，特別是轉基因大豆中；為建立植物轉基因表達的時、空、量三維調控系統奠定理論基礎，對研究基因表達調控、構建基因工程載體、表達目的蛋白、提高產量有著重要的意義。
文檔編號C12N15/113GK101979563SQ20101052625
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月1日 優先權日2010年11月1日
發明者劉曉慶, 宋慧, 崔喜艷, 張林波, 李海燕, 陳展宇 申請人:吉林農業大學