專利名稱：一種對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒，用于快速檢測患者血液樣品中丙型肝炎病毒的型及亞型，屬于醫療器械領域。
背景技術：
丙型肝炎病毒(h印atitis C viry s, HCV)是一種單股線性正鏈RNA病毒，是重要的肝病致病因子之一，嚴重威脅人類健康。目前全球有超過1.7億人感染HCV，其中每年有超過10萬例HCV感染患者發展為肝癌，繼而引起消化道出血和腹水。肝病患者中由HCV 感染導致的死亡正逐步增多。丙型肝炎病毒包括9400左右個氨基酸，HCV基因組具有一個單獨的開放閱讀框， 編碼一具有3010個氨基酸的多聚蛋白體，翻譯后被分為病毒復制和病毒粒形成所必須的結構和非結構蛋白。HCV基因組中各種基因結構和功能不同，有些區域高度保守，如5’非編碼區，非結構區。HCV具有高度的變異性，本身又具有負選擇作用，導致了 HCV基因分型眾多，目前已知HCV至少可分為6型(HCV1-6型)，各型又分為許多亞型(如la，lb, 2a, 2b, 3c等)，共70多種亞型。各型核酸序列之間相差31-34%，氨基酸序列相差大約30%，而亞型序列之間相差20-23%。不同型別的HCV對治療藥物如干擾素、利巴韋林的敏感程度不同，區別患者的HCV基因型對臨床治療用藥非常有幫助。目前對HCV基因分型的方法主要有=ELISA法，熒光定量PCR法，限制性片段長度多態性，型特異性探針核酸雜交分析法等。這些方法敏感性、特異性低，只能區分出主要的幾種基因型，對亞型分型能力不足，不能滿足臨床需求。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種能快速、敏感地檢測HCV基因型的試劑
品.ο由于同一基因型、不同亞型HCV5’非編碼區序列的差異度僅為1%-3. 3%，而NS5B基因序列的差異度為16. 5%-20. 1%，NS5B基因更適合用于HCV的基因分型。因此，根據HCV NS5B區基因序列而進行的基因分型被公認為HCV基因分型的“金標準”。
本發明為了提供對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒，首先設計了 HCV NS5B基因引物。HCV NS5B基因上游引物序列為
5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3‘ (SEQ ID No. 1) HCV NS5B基因下游引物序列為 5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ (SEQ ID No. 2) 同時設計了 HCV NCR保守區域基因引物
3HCV NCR保守區域基因上游引物序列為
5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3，(SEQ ID No. 3) HCV NCR保守區域基因下游引物序列為 5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3，(SEQ ID No. 4)
本發明提供的對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒，包括HCV NS5B基因擴增引物、 HCV NCR保守區域基因擴增引物、HCV RNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、cDNA合成試劑、 PCR反應液和PCR測序試劑，其中，
HCV NS5B 基因上游引物序列為5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3， HCV NS5B 基因下游引物序列為5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ HCV NCR保守區域基因上游引物序列為5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3， HCV NCR保守區域基因下游引物序列為5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3， 其中HCV RNA提取采用酚氯仿提取法提取，提取試劑為TRIzol，氯仿、異丙醇、無水乙醇和無RNase去離子水。其中的陰性對照和陽性對照，以去離子水為陰性對照，以已知型別的含有HCV樣品為陽性對照。其中的cDNA合成反應液包括200 U/μ L逆轉錄酶(M-MLV)、40 U/μ L RNase 抑制劑、50 μ M Oligo (dT)15、50 μ M隨機引物(Random primer)、5 X第一鏈合成緩沖液 (first-strand buffer) > 無 RNase 的去離子水(RNase-free ddH20)、10 mM dNTPs。其中的PCR反應液包括10XPCR混合液(premix)、0. 25 pmol/ μ L的引物、 2. 5 4. 0 mM 的氯化鎂、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs。其中PCR測序試劑為4 μ L測序緩沖液，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物。用本發明的試劑盒檢測臨床待檢者外周血HCV基因型，檢測方法如下首先制備待檢者血液樣品中的丙型肝炎病毒RNA，使用RNA提取試劑盒得到丙型肝炎病毒RNA，以此提取到的RNA為模板，通過合成的寡核苷酸逆轉錄引物進行逆轉錄反應得到cDNA，然后用此cDNA作為模板及合成的PCR引物進行PCR擴增，擴增產物采用凝膠回收試劑盒進行快速膠回收，取回收DNA做測序反應，結束后采用醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物，電泳前測序PCR 產物在PCR儀上進行熱變性(95°C aiiin)，冰中驟冷，基因測序儀測序；將所測序列結果與 NCBI核酸數據庫進行序列比對，得出待檢者HCV基因分型。本發明采用基因序列分析法進行HCV基因分型，和其他技術相比，操作快速，結果準確，能一次性對7種HCV基因型進行分型鑒定，涵蓋了目前所報道的所有亞型，是最直觀、 最準確的方法。本發明試劑盒的優點和有益效果如下
(1)敏感測序檢測技術是綜合了 PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數碼顯象技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。(2)特異使用特異性標記的熒光素對定量分子進行識別，具有很高的準確性，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。(4)快速速度快、高通量，可在12 14小時完成。
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圖1丙型肝炎患者HCV靶基因片段測序結果； 圖2為丙型肝炎患者HCV靶基因片段DNA序列；
圖3為所測基因序列與NCBI核酸數據庫比對結果，即檢測患者HCV基因分型結果。
具體實施例方式現結合實施例對本發明進一步描述，但本發明的實施并不僅限于此。實施例1本發明試劑盒的制備本發明試劑盒的組成如下
(1)丙型肝炎病毒RNA提取試劑TRIzol裂解液，氯仿、異丙醇和無水乙醇
(2)引物
HCV NS5B 基因上游引物序列為5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3， HCV NS5B 基因下游引物序列為5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ HCV NCR保守區域基因上游引物序列為5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3， HCV NCR保守區域基因下游引物序列為5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3， 以上引物由上海Life Technology公司合成。(3)陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有HCV RNA樣品為陽性對照。(4)逆轉錄 PCR 反應試劑200 U/μ L M_MLV、40 U/μ L RNase、50 μ M Oligo (dT)15、50 μ M Random primer (隨機引物)、5 X first-strand buffer (第一鏈合成緩沖液)、RNase-free ddH20、10 mM dNTPs
(5) PCR 反應液:IOXPCR Premix.O. 25 pmol/μ L 的引物、2. 5 4. 0 mM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP、通常取 1 2 μ L 的模板。PCR擴增程序的設定在ΑΒΙ9700儀器上通常是先95°C 5 min，然后95°C 30 s, 58°C 60 s，72°C 1 min，循環 40 次，最后 72°C 10 min。洲(g/ml)的DNA凝膠電泳后切取PCR產物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。(6)測序反應液4 μ L測序Buffer，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物。測序反應程序的設定在ΑΒΙ9700儀器上通常先98°C變性2 min，然后進行PCR循環，PCR循環參數為96°C 10 s,50°C 5 s,60°C 4 min，25個循環，擴增結束后設置4°C保采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應產物，上ABI3130測序儀進行測序。實施例2用實施例1制備的試劑盒檢測HCV的基因型以檢測20例丙型肝炎患者外周血樣品中HCV基因型結果為例。檢測流程首先根據HCV核酸數據庫提供的HCV核酸序列設計特異性引物。獲得臨床丙型肝炎患者外周血樣品，快速提取HCV RNA,以此提取到的RNA為模板，通過合成的寡核苷酸逆轉錄引物進行逆轉錄反應得到cDNA，然后用此cDNA作為模板及合成的PCR引物進行PCR擴增。擴增產物直接采用凝膠回收試劑盒進行快速膠回收，取回收DNA做測序反應，將測序反應產物純化后進行測序，最后在NCBI核酸數據庫中進行核酸序列比對，確定
5所測序列HCV基因型。具體操作步驟如下
(1)丙型肝炎病毒RNA提取按照RNA提取純化的方法提取丙型肝炎患者和正常人外周血 HCV RNA。(2)逆轉錄PCR 按照第一鏈合成方法將提取的RNA逆轉錄為cDNA。(3) PCR 擴增PCR 反應體系為 20μ 1 含 2X premix 10. 0 yL，引物濃度 0.2 ymol/L，超純水補齊。在ABI9700PCR儀上反應擴增條件95°C 5 min，然后95°C 30 s， 58°C 60 s，72°C 1 min，循環 40 次，最后 72°C 10 min。(4) ^)(g/ml)的DNA凝膠電泳后切取PCR產物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。(5)測序反應液4 μ L測序Buffer，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物，在ΑΒΙ9700 儀器上先98°C變性2 min，然后進行PCR循環，PCR循環參數為96°C 10 s,50°C 5 s，60°C 4 min，25個循環，擴增結束后設置4°C保溫。(6)采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應產物，按照ABI3130測序儀操作說明進行測序。(7)數據收集處理和分析將所測得序列在NCBI核酸數據庫中進行比對分析，分析HCV亞型(圖1、圖2、圖3)。
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權利要求
1.一種對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒，其特征在于，包括HCV NS5B基因擴增引物、HCV NCR保守區域基因擴增引物、HCV RNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、cDNA合成試劑、PCR反應液和PCR測序試劑，其中，HCV NS5B基因上游引物序列為SEQ ID No. 1所示， HCV NS5B基因下游引物序列為SEQ ID No. 2所示，HCV NCR保守區域基因上游引物序列為 SEQ ID No. 3所示，HCV NCR保守區域基因上游引物序列為SEQ ID No. 4所示。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中HCVRNA提取試劑為TRIzol，氯仿、異丙醇、無水乙醇和無RNase去離子水。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中的陰性對照和陽性對照，以去離子水為陰性對照，以已知型別的含有HCV樣品為陽性對照。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中的cDNA合成反應液包括200 U/μ L 逆轉錄酶、40 U/μ L RNase 抑制劑、50 μ M Oligo (dT) 15、50 μ M 隨機引物、5Χ 第一鏈合成緩沖液、無RNase的去離子水、10 mM dNIPs。
5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中的PCR反應液包括10XPCR 混合液、0.25 pmol/μ L 的引物、2. 5 4. 0 mM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、 0. 3 0. 6 mM dUTPo
6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中PCR測序試劑由4yL測序緩沖液，1 PL DNA模板，1 μ L測序引物組成。
全文摘要
本發明涉及一種對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑盒，包括HCVNS5B基因擴增引物、HCVNCR保守區域基因擴增引物、HCVRNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、cDNA合成試劑、PCR反應液和PCR測序試劑，其中，HCVNS5B基因上游引物序列為SEQIDNo.1所示，HCVNS5B基因下游引物序列為SEQIDNo.2所示，HCVNCR保守區域基因上游引物序列為SEQIDNo.3所示，HCVNCR保守區域基因上游引物序列為SEQIDNo.4所示。本發明的試劑盒檢測靈敏度很高，特異性好，可以檢測已報道的所有HCV基因型(亞型)，速度快，可在12~14小時完成。
文檔編號C12R1/93GK102286644SQ20111024831
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者李艷, 童永清, 鄭紅云, 顧劍 申請人:李艷, 童永清, 鄭紅云, 顧劍