一種水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原粒子的制備方法

專利名稱：一種水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原粒子的制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原粒子的制備方法。
背景技術：
水貂病毒性腸炎，是由水貂腸炎細小病毒(Mink Enteritis Virus, MEV)引起的以劇烈腹瀉為主要臨床特征的急性、烈性和高度接觸性傳染病，具有較高的發病率和死亡率。在自然條件下，不同品種和不同年齡的水貂均有感染性，幼貂的感染性極強，病貂的年齡愈小，死亡率愈高。幼貂發病率為50% -60%，致死率高達90%，成年貂多呈慢性經過或隱性感染，發病率為13. 8%-85.4%，死亡率高達80%。由MEV引起的水貂病毒性腸炎存在于世界各養貂國家，本病最早于1949年由Schofield報道于加拿大(Schofield F W, Vims enteritis in mink. Am Vet，30 :651_654，1949)，1952 年由 Wills 分離鑒定了病原，并命名為水貂腸炎病毒。隨著毛皮動物飼養業的發展，病毒性腸炎己經成為危害水貂飼養業的三大疫病之一，給養貂業帶來巨大的經濟損失(高云等，水貂病毒性腸炎(MEV)流行病學調查及防治，特產科學實驗，(4)33-34. 1984)。MEV病毒呈20面立體對稱結構，直徑20nm 24nm，無囊膜，其基因組為單股線性 DNA分子，基因組長約5064nt，是動物DNA病毒中最小的。水貂腸炎細小病毒VP2蛋白是該病毒的主要結構蛋白，病毒的主要抗原位點均在VP2蛋白上，VP2幾個堿基和氨基酸的改變就會景i響病毒的生物學特征(Steinel A，et al,Genetic characterizatinn of feline parvovirus sequences from various carnivores,J Gen ViroL,81(2) :345_350,2000)。 MEV不能在雞胚組織中增殖，能在貓腎細胞系等多種貓源細胞培養物及水貂腎、脾、心肌細胞株培養中增殖，產生細胞病變(吳志明等，動物疫病防控知識寶典，北京中國農業出版社，358-360，2006)。MEV的血凝性較弱，僅在4°C，ρΗ6· 0 7. 2條件下對豬和恒河猴的紅細胞有凝集作用，也能凝集馬和貓的紅細胞，但Rivera等分離的MEV-S株對豬、猴或馬、牛、 恒河猴的紅細胞均不表現凝集作用(廖國安，水貂病毒性腸炎，中國預防獸醫學報，12 (2) 53-55，1990)。患此病的水貂主要的癥狀是腹瀉，臨床上分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性病貂只表現拒食，不見腸炎癥狀，于12-24h死亡。根據病變特點可作出初步診斷，結合實驗室檢測病死水貂組織中的病毒抗原進行確診，主要用血凝實驗(HA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫電鏡技術及分子生物學方法。目前，MEV基因工程疫苗研究仍然存在一些問題大腸桿菌表達的MEV-VP2蛋白具有不可溶性及免疫效果相對較差的缺點，其應用前景并不樂觀；重組病毒疫苗存在向環境擴散經遺傳修飾的生物體安全問題；采用轉基因植物生產MEV-VP2蛋白的表達水平目前還不理想；因而研制MEV安全、高效的新型疫苗勢在必行。近年來，應用病毒樣顆粒(VLPs)作為疫苗的抗原載體越來越受到廣大科學家的重視。VLPs常可以誘導產生較滅活疫苗和可溶性多肽更為強烈的體液免疫應答，因為其表
3面是以非感染性的顆粒狀態模擬天然抗原呈遞過程來呈遞糖蛋白抗原的，而該法提呈引起的免疫應答優于溶解狀態，故在保護作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫應答可望更接近自然感染，這樣，病毒樣顆粒更有可能廣泛用于疫苗的研制。而且，VLPs由于不包裹核酸，不能復制，因此也沒有感染性，是一種安全的抗原載體(Nagesha H S，Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers, Arch Virol, 144 :2429_2439,1999)。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(BEVS)自1983年建立以來(Smith，Mol. Cell Biol.， 3 =2156-2165,1983)，已有近千種外源基因在該系統中得到表達。其優點為A :BEVS表達效率高，表達產物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似；B 家蠶桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖；C 應用晚晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因，即使重組基因產物對細胞有毒性，也不影響表達水平；D 借多元表達載體或借幾個不同重組病毒共感染，可以同時表達2個或更多個外源蛋白，研究肽鏈超分子裝配以及蛋白寡聚體的結構與功能；E 桿狀病毒對脊椎動物無病原性，家蠶沒有與人畜共患的疾病，被認為遺傳學上是安全的表達載體(景志忠等，中國獸醫科技，31 :43-45，2001)。家蠶BmNPV表達系統(家蠶生物反應器)自1984年開發以來已在醫學、獸醫學和農業上得到廣泛的應用。如口蹄疫病毒等數十種動物病毒抗原蛋白先后被表達和純化，其中相當一部分正在進行商品化開發(李志勇等，Plos One，e2273，2008，木村滋，昆蟲生物工廠[M]，日本工業調查會，2000，124-127)。現今家蠶桿狀病毒表達系統的有關技術已相對成熟，該系統表達外源基因，不僅經濟、高效，而且可提供一條新的技術途徑。利用家蠶生物反應器生產水貂腸炎細小病毒 VP2抗原，保證其具有正常的蛋白結構和生物學免疫活性，為水貂腸炎細小病毒疫苗的商業
生產奠定基礎。

發明內容
本發明的發明人為了解決上述問題提出并完成了本發明。本發明的目的是克服現有技術的不足，提供了利用家蠶桿狀病毒表達系統在昆蟲體內安全、高效的表達水貂腸炎細小病毒VP2抗原并能自主組裝成MEV病毒空衣殼顆粒的方法。本發明的另一目的是提供水貂腸炎細小病毒VP2優化基因。本發明的再一目的是提供包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或上述優化基因的桿狀病毒轉移載體、及重組桿狀病毒。本發明的再一目的是提供制備水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的昆蟲生物反應器。本發明的再一目的是提供通過上述方法制備的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原。本發明的再一目的是提供通過上述方法制備的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原作為疫苗的應用。根據本發明的水貂腸炎細小病毒VP2優化基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
進一步，本發明提供了包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或上述優化基因的桿狀病毒轉移載體。本發明還提供了通過使用上述的桿狀病毒轉移載體感染桿狀病毒獲得的重組桿狀病毒。本發明還提供了制備水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的昆蟲生物反應器，通過使用上述重組桿狀病毒感染昆蟲宿主獲得。因此，根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法包括以下步驟1)構建包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或上述優化基因的桿狀病毒轉移載體，其中，是按家蠶的密碼子頻率進行密碼子優化；2)將構建得到的轉移表達載體與桿狀病毒DNA進行共轉染，以發生同源重組或轉座，獲得重組桿狀病毒；3)將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主細胞；4)培養被感染的昆蟲宿主，表達相應的水貂腸炎細小病毒VP2蛋白組裝的空衣殼抗原顆粒，收獲并純化所表達的抗原。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其中，所述的水貂腸炎細小病毒VP2基因的原始序列及經密碼子優化后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，其編碼的病毒VP2的氨基酸序列SEQ ID NO. 3。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法包括，其中，所述的桿狀病毒轉移載體優選自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、 p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、 pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、 pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUffl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、 pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBac 1、 pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVPIO、 pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1. 1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、或 pUAC-5， 或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉座載體，更優選為PVL1393桿狀病毒運載載體。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其中，所構建的轉移載體為帶有水貂腸炎細小病毒VP2基因原始序列的載體pVL1393-MEV-VP2和帶有水貂腸炎細小病毒VP2基因經密碼子優化后序列的載體pVL1393-MEV-VP2-0。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其中，所述的桿狀病毒優選自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV 或 SpltNPV,更優選為家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8。根據本發明的優選實施方式，其中，所述的重組桿狀病毒選自以下任意一種重組病毒(1)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV-MEV-VP2，(2)重組家蠶核型多角體病毒 rBmNPV-MEV-VP2-0。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其中，所述的昆蟲宿主選自鱗翅目昆蟲，如家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻蠶(Philosamia cynthia ricim)(Dictyoplca japanica)(Philosamia cynthia pryeri)、豐乍H (Antheraea pernyi)、日本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus) > 苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae) > ^ (Spodoptera littoralis)、H占蟲(Spodoptera frugiperda) >粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、煙草夜蛾 (Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar) 等；更優選為家蠶(Bombyx mori)。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其中，所述的感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體(更優選為將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集含 MEV-VP2抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿)；其中，所述的蛹體最優為1-2天的早期嫩蛹。本發明采用基因重組技術，對水貂腸炎細小病毒(MEV)的VP2蛋白基因序列進行密碼子優化，將該蛋白的原始序列(SEQ ID NO 1)及優化后的序列(SEQ ID NO 2)克隆到桿狀病毒轉移載體(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid， BlueBacII (pETL)，p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3, pAcC129、C4、 DZl, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2、7、8， pAcMPl、2， pAcRP23、25， pAcRW4, pAcsMAG, pAcUWl、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII， pBlueBacHis, pEV55、mXIV, pIEINeo, ρJVETL, pJVNhel, ρJVP10, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl，pPBac，pSHONEX 1. l,pSYN XIV VI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393， pVL941、945、985，ρVTBac, pBM030, pUAC-5)上，在多角體啟動子、plO啟動子或別的病毒和真核生物的強啟動子控制之下，通過體內或體外(in vivo/in vitro)重組，使MEV-VP2蛋白的原始序列及優化后的序列整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組病毒；重組病毒可通過添食或采用各種手段透過表皮感染1-5齡(最優時間為四或五齡)的昆蟲幼蟲或蛹體 (最優時間為1-2天的早期嫩蛹)，表達生產水貂腸炎細小病毒VP2抗原。根據本發明的優選實施方式，對水貂腸炎細小病毒(MEV)的VP2衣殼蛋白基因序列進行密碼子優化，將該蛋白的原始序列及優化后的序列，即SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的堿基序列克隆到桿狀病毒運載載體PVL1393上，再通過體內重組將水貂腸炎細小病毒VP2蛋白基因的原始序列及密碼子優化后的序列VP2-0分別轉移到家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的基因組上，替代基因組上的Polyhedrin基因，通過空斑篩選技術和PCR 檢測技術，獲得攜帶水貂腸炎細小病毒VP2基因的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(MEV-VP2)和 rBmNPV(MEV-VP2-0)；將其感染家蠶細胞系或穿刺接種1_5齡的家蠶幼蟲或蛹，大量繁殖 rBmNPV (MEV-VP2)和 rBmNPV (MEV-VP2-0)；當 rBmNPV (MEV-VP2)和 rBmNPV (MEV-VP2-0)在蠶體內復制時，VP2及VP2-0基因在多角體蛋白基因(polh)啟動子控制下高效表達，并能自我組裝成為病毒樣粒子；在感染3-6天(最佳為5天，25度飼養溫度)后收集含水貂腸炎細小病毒VP2抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿)，經過輻射照射殺滅桿狀病毒、蛋白純化后便得到安全、高效的水貂腸炎細小病毒VP2空衣殼抗原顆粒，此抗原可用于制備預防水貂病毒性腸炎的疫苗。本發明方法采用桿狀病毒表達系統在家蠶生物反應器中安全、高效的生產水貂腸炎細小病毒VP2抗原，其生產成本顯著低于傳統的制備水貂腸炎細小病毒VP2抗原的方法， 建廠，三廢，電力和水資源等能源消耗極少。由于家蠶已經被我國衛生部批準為食藥兼用昆蟲，所以將本發明方法所制備的抗原純化后，安全性極高，可直接制作疫苗免疫動物。
總體而言，本發明方法可以大幅度降低水貂腸炎細小病毒VP2抗原的生產成本， 具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優點。


圖1為家蠶生物反應器表達的MEV-VP2病毒樣粒子的電鏡掃描圖；圖2為家蠶生物反應器表達的MEV-VP2免疫金標記電鏡掃描圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖詳細產生本發明，本領域的普通技術人員可以理解這些實例完全是例證性的，不限制本發明的保護范圍。實驗材料克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；原核表達載體pET_28a+、受體菌E. coli T0P10和BL21 (DE3)均為常規菌株購自Novagen公司，，運載載體pVL1393購自于 Invitrogen公司；水貂腸炎細小病毒VP2基因的原始序列是取自發病動物糞便中提取模板 D N A，經PCR擴增并克隆到載體上得到，密碼子優化后的序列VP2-0直接基因合成得到；家蠶細胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJS由中國科學院生命科學院吳祥甫研究員惠贈，中國農業科學院生物技術研究所分子微生物實驗室保；高表達家蠶品種JYl由中國農業科學院蠶業科學研究所選育，中國農業科學院生物技術研究所保存。酶與試劑所用限制性內切酶和配套的緩沖液均購自Promega公司；T4DNA Ligase及緩沖液為Promega公司產品；LA Taq聚合酶及緩沖液購自TaKaRa公司；RnaseA、 dNTPs購自Sigma公司；各種規格的DNA和蛋白質分子量標準為TranGen Biotech公司產
ρ
BFI οt it i式 M :bisacrylamide> acrylamide> IPTG、X-Gal _ 自 Promega 目； Tris, Ampicillin、Kanamycin, IPTG、SDS,尿素、咪唑、TritonX-100, TEMED(N, N，N ‘， N ‘ -Tetramethylethylene diamine)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、卡那霉素 (Kanamycin)、細胞培養基TC-100購自GIBCO公司；瓊脂糖為Sunbiotech公司產品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均購自英國OXOID公司；0. 2um、0. 45um濾器購自Gelman Sciences公司；溴化乙錠(EB)、考馬斯亮蘭R-250購自Fluka公司；瓊脂粉為日本進口分裝；Ni-NTA樹脂、Proteinase K、胎牛血清購自Invitrogen公司；其它均為國產或進口分析純試劑。引物均由三博遠志生物技術有限責任公司合成培養基大腸桿菌培養基為LB培養基；家蠶細胞培養基為TC-100培養基。水貂腸炎細小病毒VP2基因表達產物的動物實驗在隔離實驗室進行。實施例1、水貂腸炎細小病毒VP2基因的原始序列在家蠶生物反應器中的可溶性表達及表達產物的檢測 取發病水貂糞便，反復凍融數次后，取5000rpm離心10分鐘后的上清液，加入等體積的裂解緩沖液(20mmol Tris,20mmol EDTA，1 % SDS)，然后加入蛋白酶K至終濃度為 200yg/ml，56t^KS30min。用等體積的Tris_cl飽和酚、酚/氯仿(1 1)、氯仿各抽提一次，12000rpm,離心5min。取上清加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)，2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min，12000rpm, lOmin，棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌1次，自然干燥后，加入100 μ 1 TER (含RNase)溶解。設計引物，通過PCR的方法擴增出水貂腸炎細小病毒VP2基因的原始序列(SEQ ID NO :1)。所設計特異引物為MEV-VP2-F 5 ‘ -GCGGATCCAACATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3 ‘ (BamH I) MEV-VP2-R 5' -GCTCTAGATTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3' (Xba I) PCR擴增結束后，取5. OuL反應產物進行1. 0%的TAE瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含有0. 5 μ g/mL的溴化乙錠，電泳緩沖液為0. 5 X TAE, 100V,大約20min后于紫外凝膠成像系統觀察片段大小，與標準的DNA Marker比較，結果顯示成功擴增MEV-VP2基因，大小與預期一致。純化回收PCR產物與克隆載體(pMD18-T vector)連接，取連接產物加入感受態細胞(E. coli)中。鑒定選出陽性重組質粒，取少量鑒定為陽性克隆菌液送至北京三博遠志生物技術有限公司測序部進行測序，測序結果用DNAStar、DNAMAN等軟件對序列進行比對分析。結果顯示PCR擴增的序列與理論序列一致，沒有移碼或突變，得SEQ ID NO. 1，進行蛋白翻譯后得SEQ ID NO. 3。2、桿狀病毒轉移載體DVL1393-MEV-VP2的構津測序鑒定正確的重組質粒pMD-18T-MEV-VP2用BamH I和Xba I雙酶，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。真核表達載體質粒PVL1393作同樣酶切處理。酶切回收的MEV-VP2目的片段與酶切后的轉移載體PVL1393連接。重組質粒經酶切和基因測序進行鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為PVL1393-MEV-VP2。3、家蠶核多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制備按GIBCO公司產品說明配制培養基，在27°C下培養家蠶細胞BmN。用家蠶核多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJS感染對數生長期的蠶細胞BmN，感染復數為1，3 4天后收集病毒感染液，離心(5000rpmX IOmin)，除去沉淀，上清用25000rpm離心1小時，除上清，用Iml 病毒 DNA 抽提液(1000ml 中含 Tris 12. lg, EDTA 33. 6g, KCl 14. Ig, ρΗ7· 5)懸浮病毒粒子沉淀，抽提病毒DNA，放4°C保存備用。4、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(MEV-VP2)的構建和獲得接種大約IXlO6細胞于15cm2培養瓶中，細胞貼壁后，除去含胎牛血清(FBS)培養基，用不含FBS的培養基洗三次，加1. 5ml無FBS培養基。向一滅菌管中依次加入1 μ g家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8DNA, 2 μ g桿狀病毒轉移載體pVL1393_MEV_VP2DNA和5ul脂質體，用無菌雙蒸水補足體積到60 μ 1，輕輕混勻，靜置15min后，逐滴加入到培養瓶中進行共轉染。27°C培養4小時后補加1. 5ml無血清培養基和300 μ IFBS0 27°C恒溫培養4 5 天，收集上清液用于重組病毒rBmNPV(MEV-VP2)的篩選。將不含有多角體的空斑挑選出來， 經過2 3輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(MEV-VP2)。將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV (MEV-VP2)感染正常生長的BmN細胞，培養3天后收集上清液，上清中即含有大量的重組病毒rBmNPV(MEV-VP2)。利用PCR方法分析外源基因整合，寡核苷酸引物為MEV-VP2-F 5' -GCGGATCCAACATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3‘ (BamHI)MEV-VP2-R 5' -GCTCTAGATTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3‘ (Xba I)。
PCR產物電泳分析，結果證明獲得了重組病毒。5、MEV_VP2在家蠶蛹和蠶體中高效表汰所用的家蠶蛹為高表達品種為JY1。JYl品種家蠶飼養按呂鴻聲主編的《中國養蠶學》(上海科學技術出版社，1991)的常規方法進行。餉食后48h選擇平均體重相同的家蠶及結繭七天后平均體重相同的15粒蠶蛹，每頭蠶蛹和蠶接種約1. OX 105rBmNPV (MEV-VP2)， 4-5天后收集發病蠶血及蠶蛹，-20°C凍存用于檢測。6、MEV_VP2病毒樣顆粒的初步純化將含表達有MEV-VP2的蠶蛹用預冷的PBS (料液比為1 9)在勻漿器中研磨后， 超聲破碎，12000rpm離心以去除碎片，上清用0. 45 μ m濾器過濾。在30%蔗糖溶液中， 1. 5X IO5g超高速離心3小時。用含0. IM NaCl的Tris-HCL(PH7. 0)的溶液把沉淀復溶到原體積，即得到病毒樣粒子，純度可達85%以上。7、表達產物的檢測(I)ELISA 及 Western blotting 檢測ELISA方法檢測MEV-VP2抗原蛋白在蠶血(和蠶蛹)中表達量的高低，包被液作為空白對照，以正常蠶血(和蠶蛹)作為陰性對照，原核表達的MEV-VP2蛋白免疫新西蘭大白兔之后的兔血清為一抗，HRP標記的羊抗兔抗體為二抗。將發病蠶血(和蠶蛹)用包被液做梯度稀釋，從50X兩倍倍比稀釋到6400倍，各取100 μ L包被到酶標板上。結果如表1， 表明MEV-VP2基因在家蠶中表達量高，在3200倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應。表1 ELISA檢測家蠶生物反應器表達的VP2蛋白
稀釋度1 501 1001 2001 4001 8001 16001 32001 6400表達抗原(蠶血)1.3371.2020.9520.7030.5820.4680.3160.284陰性對照(蠶血)0.4010.350.310.270.2610.2560.2510.24表達抗原(蠶蛹)1.2171.1230.9920.7520.590.4530.3430.28陰性對照(蠶蛹)0.5230.4120.3320.290.2710.2760.2610.255空白對照0.213Western blotting結果表明在重組病毒感染后家蠶血淋巴及蠶蛹樣品中可檢測到65kD左右的特異性條帶。(2)蠶蛹表達MEV-VP2抗原的血凝實驗檢測取豬紅細胞于阿氏液中保存，用20被體積的生理鹽水洗滌紅細胞三次，最后將紅細胞用生理鹽水配成懸液。在U形板的每空加入滅菌的生理鹽水50ul ；取50 μ 1稀釋 50倍的蠶蛹樣品加入第1孔內，混勻后，吸取50 μ 1后加入到第二孔中，如此連續稀釋至適當比例，最后一孔吸取50μ 1液體棄掉；另取兩孔為生理鹽水對照，陰性蠶血按相同方法稀釋。每孔加入50 μ 1 豬紅細胞懸液，混勻后，4°C下反應45分鐘，待對照的紅細胞完全沉積后觀察結果。實驗結果顯示蠶血及蠶蛹表達產物的病毒粒子經初步純化后的樣品稀釋到 25600倍時仍為陽性。
8、云M勿免斿·減謎縫牛戶·選取血凝抑制抗體效價(HI) ^ 1 4的3 4月齡健康水貂為實驗對象。取5 只進行注射免疫(粗純化的5微克VP2抗原與等體積的油佐劑混合后皮下肌肉注射，Iml/ 只)，5只進行口服免疫(粗純化的VP2抗原與等體積的含30%脂肪酸和10%蜂膠的乳化劑混合混合，經超聲波乳化后灌喂)，5只進行MEV病毒細胞滅活疫苗免疫(陽性對照)，5只不免疫(陰性對照)。免疫21天后取血，進行ELISA抗體效價檢測，注射和口服均產生針對 VP2蛋白的抗體，注射組效價可達3200倍以上，口服組效價也達到近1600倍，對照組均沒有檢測到抗體。取血后進行強毒攻擊實驗，并每天收取糞便進行檢測。實驗組注射和口服抗原的水貂均沒有出現發病跡象，所有糞便樣品中均不存在MEV病毒粒子，而對照組攻毒后第4 天開始出現厭食、嘔吐，初期排稀便，之后出現套管樣便和血便，體溫升高40°C左右，表現典型的水貂病毒性腸炎癥狀，攻毒后1周內全部死亡。剖檢水貂尸體發現脫水、消瘦，腸道充血。測定接毒后的試驗水貂糞便，從第三天開始檢測到MEV病毒并逐漸增多，其HA滴度均在1 512以上。實驗結果顯示用家蠶生物反應器表達的水貂腸炎細小病毒VP2組裝的病毒空衣殼抗原粒子無論注射還是口服，均能使水貂體內產生保護抗體，避免受到病毒攻擊。實施例2、水貂腸炎細小病毒VP2基因經密碼子優化后的序列VP2-0在家蠶生物反應器中的可溶性表達及表達產物的檢測UMEV-VP2基因序列的優化及鑒定對實施例1測得的水貂腸炎細小病毒VP2基因原始序列根據家蠶密碼子偏好性進行密碼子優化，不改變氨基酸序列，優化后序列VP2-0如SEQ ID NO :2所示，原始序列中含有串聯的稀有密碼子，這減少了翻譯序列或者甚至解除翻譯裝置，優化后序列CAI值由 0. 85提高為0. 89，調整了 GC含量及不宜峰以延長mRNA的半衰期，GC含量由35. 21%調整為48. 83%，那些影響mRNA穩定性及其與核糖體結合的莖環結構被破壞，直接合成優化后的序列VP2-0克隆到載體pUC57上，兩端分別帶有BamHI、XbaI酶切位點，經測序得SEQ ID No. 2和翻譯后得SEQ ID No. 3。2、桿狀病毒轉移載體PVL1393-MEV-VP2-0的構建按實施例1的方法，將鑒定正確的重組質粒pUC57-MEV-VP2-0用BamH I和 Xba I雙酶切，電泳回收目的片段，與PVL1393載體在T4連接酶的作用下進行連接，轉化大腸桿菌感受態細胞后，提取質粒進行酶切及測序鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為 PVL1393-MEV-VP2-0。3、家蠶核多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制備同實施例1。4、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(MEV-VP2-0)的構建和獲得接種適量細胞(約70 80% )于35mm小平皿中，細胞貼壁后，吸去培養基，將共轉染上清進行不同濃度稀釋，取Iml共轉染液加到貼壁細胞中，分布均勻。27°C感染1小時后，吸去感染液，將2%低融點瓊脂糖凝膠于60°C水浴中融化，冷至40°C與40°C預熱的 2XTC-100培養基(含20% FBS)混合均勻，每平皿加4ml膠，待凝固后用Parafilm封口， 27°C倒置培養3 5天，顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來，重復以上步驟，經過2 3輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(MEV-VP2-0)。將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV (MEV-VP2-0)感染正常生長的BmN細胞，培養3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV (MEV-VP2-0)。利用PCR方法分析外源基因整合，寡核苷酸引物為按優化的VP2-0基因序列內部設計兩條鑒定序列VP2-0-F 5' -AACAGGAGATATTCAACGTAGTG-3‘；VP2-0-R 5' -GTATGTGTTGAAGATGTTCGTG-3‘。PCR結果證明獲得了重組病毒。5、MEV-VP2-0在家蠶蛹和蠶體中高效表汰所用的家蠶蛹為高表達品種為JY1。JYl品種家蠶飼養按呂鴻聲主編的《中國養蠶學》(上海科學技術出版社，1991)的常規方法進行。餉食后48h選擇平均體重相同的家蠶及結繭七天后平均體重相同的15粒蠶蛹，每頭蠶蛹和蠶接種約1. OX 105rBmNPV (MEV-VP2-0)， 4-5天后收集發病蠶蛹和取蠶血，-20°C凍存以進行雙抗體夾心ELISA法檢測。6、MEV-VP2-0病毒樣顆粒的初步純化。方法同實施例1。7、水貂腸炎細小病毒檢測抗體的制備在MEV-VP2-0基因內部設計一對引物，擴增241_1290bp共1050bp長的序列，擴增氨基酸位點為81-430。引物如下MEV-F 5' -CGGGATCCAGGGTGGTTGTCAACAATATGG-3‘，(BamH I)MEV-R 5' -CAAGCTTCTAGAGGACGTTGTCATTGGTAAC-3‘，(HindIII)(1)重組質粒pMD-18T-MEV的構建以質粒pUC57-MEV-VP2-0為模板，PCR擴增目的片段，PCR純化產物與克隆載體 PMD-18T連接，得到重組質粒pMD-18T-MEV。連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑斑培養進行重組質粒的鑒定，細胞破碎法快速鑒定后挑取質粒帶退后的菌株，堿裂解法提取重組質粒用Bam Hi/Hind III進行雙酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的重組菌菌液送北京三博遠志生物技術有限公司進行DNA測序。結果表明重組質粒PMD-18T-MEV中的目的序列與先前質粒序列一致，沒有發生移碼突變并含有設計的酶切位點。(2)重組質粒pET-28a-MEV的構建測序正確的重組質粒pMD-18T-MEV經Bam Hi/Hind III雙酶切消化后，回收目的片段，將其連接到已被Bam Hi/Hind III雙酶切消化的表達載體pET_28a上，連接產物轉化 ToplO感受態細胞，挑斑后先進行細胞破碎法快速鑒定，而后堿法少量快速抽提重組質粒 pET-28a-MEV，用Bam Hi/Hind III雙酶切鑒定。結果顯示目的片段已成功插入pET_28a的多克隆位點。(3)重組質粒pET-28a_MEV在大腸桿菌中誘導表達酶切正確的上述重組質粒pET-28a_MEV轉化BL21感受態細胞，IPTG誘導4h后收集菌液，用SDS-PAGE電泳分析表達情況，結果顯示與未誘導對照相比，出現明顯表達條帶。 經超聲破碎后，SDS-PAGE電泳分析顯示表達的融合蛋白以包涵體形式存在。(4)融合蛋白的純化及其抗體的制備挑取成功重組的表達菌株單菌落振蕩培養后進行大量誘導表達，采用處理包涵體蛋白的相關溶液與方法將包涵體溶解后，用M+-NTA樹脂層析柱純化蛋白，分別用脲 NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5個梯度洗脫，收集穿透液、洗脫液，每管收集一個NTA體積，SDS-PAGE分析目標蛋白在洗脫液中的分布情況。結果顯示脲NTA-100進行洗脫時，洗脫峰最大且條帶單一。用滅菌小刀割下純化條帶蛋白，并切成Imm3 的小膠塊，進行質譜分析，方法為二級質譜的數據庫搜索鑒定法，結果顯示，樣品蛋白序列檢測覆蓋率39. 75%，有7段連續6個氨基酸以上的匹配，所以能夠確定純化蛋白就是目標基因的表達產物。將純化的蛋白經超濾管濃縮至濃度大于lmg/ml，取至少3mg的融合蛋白進行SDS-PAGE后，割下目的條帶，把膠粒磨碎后送于中科院動物實驗中心，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。(5)多克隆抗體效價檢測4次免疫后獲得多克隆抗體，用純化的融合蛋白作包被抗原，用PBS稀釋不同倍數 100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200 的多克隆抗血清作一抗，間接 ELISA檢測法測抗體效價，免疫前血清作陰性對照，測量0D492。(陽性-空白)/(陰性-空白)> 2. 1，即為陽性。結果顯示自制的抗體在抗原蛋白濃度為10yg/ml時抗體的效價可達 1 3200。8、表汰產物的檢測(I)ELISA 及 Western blotting 檢測方法同實施例1，實驗結果如表2，表明優化后的MEV-VP2-0基因在家蠶(血和蛹) 中的表達量比未優化的MEV-VP2基因高出2-3倍，在6400倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應。表2 ELISA檢測家蠶生物反應器中表達的MEV-VP2-0
權利要求
1.一種水貂腸炎細小病毒VP2優化基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示ο
2.一種重組桿狀病毒，其特征在于，通過使用包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或權利要求1所述優化基因的桿狀病毒轉移載體DNA與桿狀病毒DNA進行重組或轉座反應后而獲得。
3.根據權利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒為包含水貂腸炎細小病毒VP2基因的重組家蠶核型多角體病毒BmNPV，或包含權利要求1所述優化基因的重組家蠶核型多角體病毒BmNPV。
4.一種制備水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的昆蟲生物反應器，其特征在于，通過使用表達水貂腸炎細小病毒VP2基因或權利要求1所述優化基因的重組桿狀病毒感染昆蟲宿主獲得。
5.一種水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)構建包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或權利要求1所述優化基因的桿狀病毒轉移載體；2)將構建得到的轉移表達載體與桿狀病毒進行共轉染，獲得重組桿狀病毒；3)將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主細胞；4)培養被感染的昆蟲宿主，表達相應的水貂腸炎細小病毒VP2蛋白組裝的空衣殼抗原顆粒，收獲并純化所表達的抗原。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、 HaNPV,HzNPV,LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV,SIMNPV,SeMNPV 或 SpltNPV，優選為家蠶核型多角體病毒BmNPV0
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主選自鱗翅目昆蟲，優選為家香(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟香 (Dictyoplca japanica)、樗香(Philosamia cynthia pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、 曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾 (Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲 (Heliothis zea)(Heliothis assulta) Λ^^^ (Heliothis virescens) 粘蟲(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)，更優選為家香。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲宿主是家蠶幼蟲和蛹，將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞或穿刺接種1-5 齡的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿。
9.根據權利要求5 8任一項所述的方法制備的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原。
10.權利要求9所述水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原作為水貂病毒性腸炎疫苗的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原粒子的制備方法。根據本發明的水貂腸炎細小病毒空衣殼抗原的制備方法包括以下步驟1)構建包含水貂腸炎細小病毒VP2基因或優化基因的桿狀病毒轉移載體，其中，是按家蠶的密碼子頻率進行密碼子優化；2)將構建得到的轉移表達載體與桿狀病毒DNA進行共轉染，以發生同源重組或轉座，獲得重組桿狀病毒；3)將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主細胞；4)培養被感染的昆蟲宿主，表達相應的水貂腸炎細小病毒VP2蛋白組裝的空衣殼抗原顆粒，收獲并純化所表達的抗原。本發明方法可以大幅度降低水貂腸炎細小病毒VP2抗原的生產成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優點。
文檔編號C12N7/01GK102321634SQ201110254418
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者張志芳, 易詠竹, 李軼女, 江峰, 沈桂芳, 王國增, 王樹坤 申請人:中國農業科學院生物技術研究所