一種由側孢芽孢桿菌制備的微生物肥料及其制備方法

專利名稱：一種由側孢芽孢桿菌制備的微生物肥料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種由新的側孢芽孢桿菌制備的微生物肥料以及其制備方法，屬于微生物肥料領域。
背景技術：
我國人口多、耕地少，且隨著人口增長、工業和城市的發展耕地逐年遞減。為此，我國增加農產品產量的唯一可行途徑是提高單位面積產量。才能滿足工業發展和人口增加對農產品的需求，化肥也就順理成章的得到了廣泛應用。長期以來不合理使用化學肥料帶來的土壤板結、地力下降、生態破壞、環境污染以及農副產品品質下降問題，已經受到國家有關部門和農業科技界的高度重視。近幾十年來，我國一直努力探索合理施肥、克服化肥的弊端及提高化肥利用率的有效途徑。農業肥料包括化學肥料和生物肥料，是我國農業生產不可替代的重要生產資料。 其中，生物肥料作為農業生物工程學科的重要分支和土壤肥料學的重要組成部分，近十年無論在基礎研究和應用研究方面都得到了迅速發展。近幾年來我國微生物肥料發展很快， 有多家企業從事生產經營，品種不斷增加，同時也有一些國外產品打入國內市場。由于菌種等原因，目前市場的產品質量參差不齊，生產應用上出現了一些問題。據最近幾年農業部監督抽查、跟蹤抽查，國家統檢的情況看，抽查合格率不到60%，產品質量問題主要是有效菌數不達標，保質期過短。微生物肥料中有效活菌數是產品質量的重要指標，有效活菌數不達標，產品質量就得不到保證，反映出來的是應用效果不穩定，其中原因主要是菌種問題，菌種在制備為微生物菌種劑后，在保藏過程中的存活能力下降，存活時間變短。這個問題實際上是由于這些微生物菌種劑所使用的菌種要么不能產生芽孢，要么產生芽孢的能力比較弱，或者產生的芽孢萌發能力差，不能很好渡過微生物菌種劑生產過程中的脅迫條件和庫存、保藏過程，在生產使用過程中表現為菌種活性下降，生產性能減弱，繁殖速度變慢，抗逆性差。因此，菌種問題一直困擾我國微生物肥料的生產和發展。

發明內容
為了解決現有微生物肥料中菌種存活能力低、有效活菌數不達標、保質期過短，從而產品質量較差、應用效果不穩定等問題，本發明的目的是提供一種由新的微生物菌制備而成的微生物肥料及其制備方法。本發明中提到的百分比和比例均是指重量百分比和重量比例。為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案
一種微生物肥料，其特征在于該肥料由新的側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus), 保藏號為CGMCC No. 5090的微生物菌種劑與常規化肥或有機載體混合而成。具體的，該菌種被命名為“新側芽孢桿菌1號”，該菌種分離自高產農田，并經馴化，長期以來性狀穩定。新側芽孢桿菌1號菌株在2010年7月22日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5090，生物學命名Bacillus laterosporus，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。該菌種的生物學特性為菌體桿狀，屬于芽孢桿菌屬，其細胞大小為0. 15 0. 18 X 215 510um，革蘭氏染色陽性，可變為陰性，芽孢為橢圓形，側生、中生或近中生，孢囊膨大，游離芽孢一邊比另一邊厚(獨木舟形)。能利用多種氮源、碳源，生長溫度20-55°C，最佳生長溫度37°C，最適PH7. 2。在不良條件下，菌體轉化產生芽孢，芽孢對不良環境抗逆性強， 可耐受100°C高溫20分鐘和干燥等惡劣條件。所述的側孢芽孢桿菌微生物菌種劑由如下方法制備而成
一、菌種保藏及活化培養
菌種以劃線培養的方式在新1培養基(斜面培養基)上保藏，短期保藏條件為4°C，每2 月活化1次；長期保藏條件為-20°C，每6個月活化1次。二、微生物培養
1、采用本發明提供的方法進行微生物培養
1)自保存斜面取種后，劃線接入斜面培養基(新1培養基)，30—38°C培養箱靜置黑暗條件下培養36小時；
2)用無菌水沖洗斜面，形成菌懸液；
3)將1體積菌懸液接入約20體積的新1液體培養基中，30—38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；
4)將步驟3)得到的菌懸液加入到約5-10倍體積的新2培養基中，30—38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；
5)將步驟4)得到的菌懸液加入到約50-100倍體積的新3培養基中，35-38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；
6)將步驟5)得到的菌懸液加入到約5-10倍體積的新4培養基中，35-38°C培養有氧培養至菌體濃度為IO9個/ml數量級。2、采用傳統微生物發酵生產方法進行微生物培養
培養基淀粉10%，豆餅粉10%，磷酸氫二鉀0. 2%，硫酸銨0. 1%，硫酸鎂0. 05%,氯化鐵 0. 001%，碳酸鈣 0. 01%，酵母膏 0. 01%, PH7. 2-7. 4。將菌種活化后接入IOOOml上述培養基中，三角瓶搖瓶160RPM，30—38°C培養16小時，然后按1%接種量接種到200L種子發酵罐中(仍為同種培養基)，通氣，30—38°C培養16 小時，再按10%接種量接到2000L發酵罐中(仍為同種培養基)，30— 38°C培養20小時后升溫至40—45°C在培養10小時，待80%菌體產生芽孢后停止發酵。三、微生物菌種劑的生產
將優質草炭粉(市售)進行干熱滅菌后冷卻，根據想要得到微生物菌種劑中微生物的含量加入到發酵結束(傳統微生物發酵生產方法的或本發明提供的生產方法的)得到的發酵液中，進行充分攪拌，用造粒機造粒，低溫烘干獲得微生物菌種劑。本發明中所使用到的培養基有
新1號培養基(斜面培養基):蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏5g/L，瓊脂1. 5%_2. 0%， PH 調至 6. 5-7. 8。新1號液體培養基該培養基不含瓊脂，其他成分和含量與新1培養基相同，PH調至 6. 5-7.8。新2號培養基淀粉5g/L，蔗糖lg/L，酵母浸出汁0. 2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/ L，硫酸銨lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 2g/L,氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8。新3號培養基淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0. lg/L,蛋白胨0. 5g/L，豆餅粉 10g/L，硫酸銨lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8。新4號培養基淀粉10g/L，蔗糖2. 5g/L，酵母浸出汁0. lg/L,蛋白胨0. 5g/L，豆餅粉5g/L，硫酸銨lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8。以上所有培養基均在使用前經高壓蒸汽滅菌(121°C，1. lkg/cm3，30分鐘)，冷卻。本發明還可采用傳統的微生物菌種劑生產中用到的培養基和培養方法制備微生物菌種劑。傳統的微生物菌種劑生產中用到的培養基和培養方法在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌種目錄中有詳細的描述。具體地，草炭粉與發酵液的混合重量比例為2 - 10 :1，優選的，混合比例為3 — 5 1，更優選的，混合比例為4:1。具體地，所采用的普通化肥為常規氮、磷、鉀肥料，微生物菌種劑與普通化肥的混合重量比例為1 :5 - 15，優選的，混合比例為1 :8 - 10。所采用的有機載體可以是本領域常用的有機肥，可采用雞糞、粉碎玉米芯、粉碎秸稈、煤渣等。具體可采用雞糞、粉碎玉米芯、 煤渣，三者混合比例為1 :1 一 5 :1 — 6，優選三者混合比例為1 :2 :3。微生物菌種劑與有機載體的混合重量比例為1 :5 - 15，優選的，混合比例為1 :7 - 10，更優選的1 :9。有益的效果
使用本發明所提供的菌種生產的微生物菌種劑有較高的有效菌數和較長的保質期，所制備的微生物肥料除了上述優點外，增產效果明顯。在本菌種使用傳統發酵方式進行發酵生產的菌種劑，入庫時進行有效菌數檢測， 其結果明顯優于市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3. 3倍。解決了菌種數不達標的問題。在本菌種使用本發明提供的發酵方式進行發酵生產的菌種劑入庫時進行有效菌數檢測，其結果明顯優于市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的4 倍。也解決了菌種數不達標的問題。本菌種使用傳統發酵方式進行發酵生產的菌種劑在倉庫中保存2年后，進行有效菌數檢測，其結果明顯優于市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3 倍。解決了保質期短的問題。本菌種使用本發明提供的發酵方式進行發酵生產的菌種劑在倉庫中保存2年后， 進行有效菌數檢測，其結果明顯優于市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3. 6倍。解決了保質期短的問題。
具體實施例方式實施例1利用傳統方法對新側1號進行發酵制備微生物菌種劑
培養基淀粉3%，豆餅粉1%，蛋白胨0. 1%，硫酸銨0. 2%，磷酸氫二鉀0. 2%，酵母粉0. 1%， 碳酸鈣 0. 01%, PH7. 2-7. 4。
將菌種活化后接入IOOOml上述培養基中，三角瓶搖瓶160RPM 37°C培養16小時， 然后按1%接種量接種到200L種子發酵罐中(仍為同種培養基)，通氣，37°C培養16小時，再按10%接種量接到2000L發酵罐中(仍為同種培養基)，37°C培養20小時后升溫至42°C在培養10小時，待80%菌體產生芽孢后停止發酵。檢測菌體濃度，達到109，然后按1 :4的重量百分比與進行干熱滅菌后冷卻的優質草炭粉(市售)混合，再進行造粒，低溫烘干成為微生物菌種劑。實施例2 利用本發明提供的方法對新側1號進行發酵制備微生物菌種劑
先對菌種進行活化，再用5ml無菌水沖洗斜面，形成菌懸液，菌懸液接入500ml三角瓶， 該三角瓶含IOOml新1液體培養基，使用搖床培養18小時，培養條件為37°C，180-200rpm， 檢測菌體濃度，在濃度達到IO8數量級，進行下一步；
將500ml三角瓶中的IOOml菌液轉接入2000ml三角瓶中，該三角瓶含700ml新2培養基，使用搖床培養20小時，培養條件為37°C，180-200rpm ；檢測菌體濃度，在濃度達到IO8數量級，進行下一步；
將2000ml三角瓶中的菌液接入Im3發酵罐中，接入量為6升，該發酵罐中含有500L新 3培養基，發酵條件為溫度36-38°C，罐壓0. 5kg/cm,通氣量20m3/h，培養8小時；檢測菌體濃度，在濃度達到IO8數量級，進行下一步；
將Im3發酵罐中的菌液接入5m3發酵罐，接入量為500升，該發酵罐含有3m3新4培養基，發酵條件為溫度36-38°C，罐壓0. ^g/cm，通氣量120m3/h，培養15小時。檢測菌體濃度，在濃度達到IO9數量級，停止發酵。然后按1 :4的比例與進行干熱滅菌后冷卻的優質草炭粉(市售)混合，再進行造粒，低溫烘干成為微生物菌種劑。實施例3對利用傳統方法制備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測
按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克 (庫存半個月)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20—100個/ml，然后移取Iml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新1培養基(斜面培養基)，充分混合后凝固，在37°C保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重復三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20—100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用傳統方法制備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測，檢測結果為 6. 6*108個/克，為國家標準的3. 3倍(國家標準為2. 0*108個/克)。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題。實施例4對利用本發明提供的方法制備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測
按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克 (庫存半個月)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20—100個/ml，然后移取Iml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新1培養基(斜面培養基)，充分混合后凝固，在37°C保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重復三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20—100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用本發明提供的方法制備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測，檢測結果為8*108個/克，為國家標準的4倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題。
實施例5對利用傳統方法制備的微生物菌種劑在長時間庫存的條件下進行菌數檢測
按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克 (庫存兩年)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20—100個/ml，然后移取Iml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新1培養基(斜面培養基)，充分混合后凝固，在37°C保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重復三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20—100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用傳統方法制備的微生物菌種劑在長時間庫存(兩年)的條件下進行菌數檢測，檢測結果為 6*108個/克，為國家標準的3倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題和保藏期太短的問題。實施例6對利用本發明提供的方法制備的微生物菌種劑在長時間庫存的條件下進行菌數檢測
按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克 (庫存兩年)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20—100個/ml，然后移取Iml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新1培養基(斜面培養基)，充分混合后凝固，在37°C保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重復三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20—100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用本發明提供的方法制備的微生物菌種劑在長時間庫存(兩年)的條件下進行菌數檢測，檢測結果為7. 2*108個/克，為國家標準的3. 6倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題和保藏期太短的問題。實施例7未長期庫存的微生物菌種劑與肥料混合后使用的效果
將雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1 :2 3重量比混合均勻，調整含水量為30%，在溫度大于 300C的條件下堆積7—10天，把庫存半個月的微生物菌種劑與之以1 :9的重量比混合，制成微生物肥料。將制成的微生物肥料在不同作物上進行與基質肥以及等價常規肥比較的小區肥效實驗，每個小區面積0. 16畝，實驗設3個重復。實驗時每畝施微生物肥料25公斤；基質肥(經由雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1 :2 3重量百分比混合均勻，調整含水量為30%后，在溫度大于30°C的條件下堆積7—10天制成)每畝施25公斤；等價常規肥(磷酸二氨尿素氯化鉀為3 :3:2混合)每畝施25公斤。均作為基肥，一次施完，不追加。空白對照不施肥。實驗結果如下(數據均為各肥料相對于空白對照的增產百分比)
權利要求
1.一種微生物肥料，其特征在于該肥料由側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)，保藏號為CGMCC No. 5090的微生物菌種劑與常規化肥或有機載體混合而成；所述的側孢芽孢桿菌微生物菌種劑由如下方法制備而成1)將CGMCCNo. 5090菌株劃線接入斜面培養基(新1培養基)，30— 38°C培養箱靜置黑暗條件下培養36小時；2)用無菌水沖洗斜面，形成菌懸液；3)將1體積菌懸液接入20體積的新1液體培養基中，30—38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；4)將步驟3)得到的菌懸液加入到5-10倍體積的新2培養基中，30—38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；5)將步驟4)得到的菌懸液加入到50-100倍體積的新3培養基中，35-38°C有氧培養至菌體濃度為IO8個/ml數量級；6)將步驟5)得到的菌懸液加入到5-10倍體積的新4培養基中，35-38°C培養有氧培養至菌體濃度為IO9個/ml數量級，停止發酵；然后按1 :3 — 5的比例與草炭土混合，造粒，低溫烘干獲得微生物菌種劑；其中上述培養基為新1號培養基(斜面培養基):蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏5g/ L,瓊脂 1. 5%-2. 0%, PH 調至 6. 5-7. 8，新1號液體培養基該培養基不含瓊脂，其他成分和含量與新1培養基相同，PH調至 6. 5-7. 8，新2號培養基淀粉5g/L，蔗糖lg/L，酵母浸出汁0. 2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L， 硫酸銨lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 2g/L,氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8，新3號培養基淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0. lg/L,蛋白胨0. 5g/L，豆餅粉IOg/ L，硫酸銨lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8，新4號培養基淀粉10g/L,蔗糖2. 5g/L，酵母浸出汁0. lg/L,蛋白胨0. 5g/L，豆餅粉 5g/L,硫酸銨lg/L,磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6. 5-7. 8 ；所述的常規化肥為氮肥、磷肥和/或鉀肥，微生物菌種劑與普通化肥的混合重量比例為1 :5 — 15 ；所述的有機載體為雞糞、粉碎玉米芯及煤渣，三者混合重量比例為1 :1 一 5 1 - 6，微生物菌種劑與有機載體的混合重量比例為1 :5 - 15。
2.根據權利要求1所述的微生物肥料，其中微生物菌種劑與普通化肥的混合重量比例為 1 :8 — 10。
3.根據權利要求1所述的微生物肥料，其中微生物菌種劑與有機載體的混合重量比例為1 :9 ；有機載體雞糞、粉碎玉米芯和煤渣三者混合重量比例為1 :2 :3。
4.一種微生物肥料，其特征在于該肥料由側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)，保藏號為CGMCC No. 5090的微生物菌種劑與常規化肥或有機載體混合而成；所述的側孢芽孢桿菌微生物菌種劑由如下方法制備而成將CGMCC No. 5090菌株活化后接入1000ml培養基淀粉10%，豆餅粉10%，磷酸氫二鉀 0. 2%，硫酸銨0. 1%，硫酸鎂0. 05%,氯化鐵0. 001%,碳酸鈣0. 01%,酵母膏0. 01%, PH7. 2-7. 4 中，三角瓶搖瓶160RPM，30— 38°C培養16小時，然后按1%接種量接種到200L種子發酵罐中(仍為上述同種培養基)，通氣，30—38°C培養16小時，再按10%接種量接到2000L發酵罐中(仍為上述同種培養基)，30—38°C培養20小時后升溫至40—45°C在培養10小時，待80% 菌體產生芽孢后停止發酵；然后按1 :2 — 10的比例與草炭土混合，造粒，低溫烘干獲得微生物菌種劑；所述的常規化肥為氮肥、磷肥和/或鉀肥，微生物菌種劑與普通化肥的混合重量比例為1 :5 — 15 ；所述的有機載體為雞糞、粉碎玉米芯及煤渣，三者混合重量比例為1 1 - 5 1 - 6，微生物菌種劑與有機載體的混合重量比例為1 :5 - 15。
5.根據權利要求4所述的微生物肥料，其中微生物菌種劑與普通化肥的混合重量比例為 1 :8 — 10。
6.根據權利要求4所述的微生物肥料，其中微生物菌種劑與有機載體的混合重量比例為1 :9 ；有機載體雞糞、粉碎玉米芯和煤渣三者混合重量比例為1 :2 :3。
全文摘要
本發明涉及一種微生物肥料及其制備方法，該微生物肥料包括一種新的側孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)，保藏號為CGMCCNo.5090。使用本發明所提供的菌種生產的微生物肥料劑有較高的有效菌數和較長的保質期。
文檔編號C12R1/07GK102424626SQ20111026043
公開日2012年4月25日 申請日期2011年9月5日 優先權日2011年9月5日
發明者王莉, 麻林濤 申請人:王莉, 麻林濤