一株具有降解bde-47能力的側孢芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌，本發明涉及一株側孢芽孢桿菌。本發明提供了一株芽孢桿菌，對BDE-47具有降解能力。本發明的一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌為側孢芽孢桿菌（Bacillus?laterospora）4-1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC?No.8616。本發明克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學法成本高、易造成二次污染的缺陷。
【專利說明】一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一株側孢芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]含BDE-47 土壤屬于極難處理的土壤之一。目前，對此類污染土壤一般采用紫外光解法、物理化法等技術處理，但由于這些方法存在成本高、易造成二次污染等缺點，所以難以在實際中應用。
[0003]極端環境微生物具有獨特的基因類型，可以在極端環境下生存、繁衍。降解微生物是能在污染環境下生長、繁衍的一類極端微生物，因其特殊的生理機能，具有巨大的研究價值和實際應用價值。降解微生物在污染環境治理方面顯示出巨大的開發潛力。
【發明內容】
[0004]本發明提供了一株芽孢桿菌，對BDE-47具有降解能力。
[0005]本發明的一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌，它為側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0.8616。
[0006]本發明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1屬于革蘭氏陽性好氧桿菌,側孢芽孢桿菌長短多變，長為19 μ m~22 μ m,寬為6 μ m~9 μ m,有鞭毛；在固體培養基上生長菌落為紅褐色，表面濕潤，邊緣不整齊，最適生長溫度為30°C~37°C，最適生長pH為8~10。
[0007]本發明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4_1可利用在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖為唯一碳源的培養基上均能生長。
[0008]本發明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4_l接觸酶陽性、甲基紅實驗陽性、尿素反應陽性、吲哚實驗陽性、氧化酶陰性性、淀粉水解陰性、苯丙氨酸脫氫酶陰性、伏普實驗陰性、檸檬酸鹽反應陰性。
[0009]本發明側抱芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1通過16S rRNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是Bacillus aerius菌,相似性為99%,結合細菌形態特征、生長條件及生理生化鑒定結果，確定側孢芽孢桿菌為Bacillus sp.屬的一個新菌種，命名為側孢芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,側抱芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1 為側孢芽孢桿菌模式菌株。
[0010]本發明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1具有處理BDE-47污染土壤的功能，BDE-47污染土壤中污染物去除率較高、費用低、不造成二次污染，本發明側孢芽孢桿菌為生物處理BDE-47污染土壤及極端微生物的研究奠定了物質基礎。
[0011]本發明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4_l,它屬于芽孢桿菌屬(Bacilluslaterospora),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0.8616。[0012]本發明的有益效果:
[0013]1、本發明提供了一株BDE-47降解菌株，并應用于BDE-47污染土壤的生物強化處理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0014]2、本發明微生物好氧降解法中，采用微生物在處理BDE-47 (土壤持久性有機污染物)污染土壤時具有很大的優勢，污染物濃度在100 μ g/L時，微生物仍然具有較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47污染土壤處理效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是本發明側孢芽孢桿菌1000倍的革蘭氏染色圖；
[0016]圖2是本發明側孢芽孢桿菌15000倍的原子力顯微鏡觀察圖；
[0017]圖3是本發明側孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列構建的NJ系統發育樹圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0019]【具體實施方式】一:本實施方式一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌,它為側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為 CGMCC N0.8616。
[0020]本實施方式側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1屬于革蘭氏陽性好氧桿菌，側孢芽孢桿菌長短多變，長為19 μ m~22 μ m,寬為6 μ m~9 μ m,有鞭毛(如圖2所示)；在固體培養基上生長菌落為紅褐色，表面濕潤，邊緣不整齊(如圖1所示)，最適生長溫度為30°C~37°C，最適生長pH為8~10。
[0021]本實施方式側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4_1在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖為唯一碳源的培養基上均能生長。
[0022]參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統鑒定手冊》對側孢芽孢桿菌進行生理生化鑒定:側孢芽孢桿菌接觸酶陽性、甲基紅實驗陽性、尿素反應陽性、吲哚實驗陽性、氧化酶陰性性、淀粉水解陰性、苯丙氨酸脫氫酶陰性、伏普實驗陰性、檸檬酸鹽反應陰性。
[0023]本實施方式側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1能夠在BDE-47濃度為100 μ g/L, pH為8~10的環境中生長。
[0024]本實施方式的有益效果:
[0025]1、本實施方式提供了一株BDE-47降解菌株，并應用于BDE-47污染土壤的生物強化處理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0026]2、本實施方式微生物好氧降解法中，采用微生物在處理BDE-47 (土壤持久性有機污染物)污染土壤時具有很大的優勢，污染物濃度在100 μ g/L時，微生物仍然具有較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47污染土壤處理效果。
[0027]【具體實施方式】二:本實施方式的側孢芽孢桿菌是從浙江省臺州市路橋區峰江鎮白楓岙村電子垃圾拆解處土壤中篩選得到的。篩選按以下步驟進行:一、取電子垃圾拆解處土壤IOg置于90mL滅菌無機鹽液體培養基中，于35°C，120r/min震蕩培養4h，靜置2h，取上清液10mL，置于90mL以BDE-47為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，整個反應體系的BDE-47終濃度為100 μ g/L ;二、然后在35°C，120r/min條件下震蕩培養8~10天；8~10天后，取IOmL菌液置于90mL以BDE-47為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，整個反應體系的BDE-47終濃度為100μ g/L ;三、重復步驟二的操作過程3次；四、應用稀釋涂布平板法、四區劃線和一區劃線純化培養，即可得到具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌。
[0028]本實施方式中每升無機鹽液體培養基含3.5g Na2HPO4.2H20、Ig KH2PO4,
0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3) 2.4Η20 和余量的去離子水。本實施方式中每升固體培養基含IOg蛋白胨、5g酵母浸膏、lOgNaCl、15~20g瓊脂和余量的去離子水，并調節培養基pH至7~7.5，均在121°C下滅菌20min。[0029]參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統鑒定手冊》對篩選得到的BDE-47降解菌株進行生理生化鑒定，通過16S rRNA的擴增、測序及同源性比較鑒定篩選得到的降解菌株，按以下步驟進行:用細菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選得到的降解菌株的總DNA，并用通用引物進行PCR擴增，16S rRNA序列的上游引物BlOlF:5 ' -TGGCGGACGGGTGAGTAA-3 '、下游引物 BA534R:5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '。PCR 反應體系為25 μ L:上游引物和下游引物各0.5μ L, DNA提取液lyL，2XMasterMixl2.5yL和剩余的雙蒸水。PCR反應程序為:95°C下預變性5min，94°C下變性40s，57°C下退火40s，72°C下延伸40s。30個循環，最后在72°C下延伸8min。將所得PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，委托北京博邁德科技發展有限公司進行PCR產物的純化及16S rRNA測序。
[0030]本實施方式篩選得到的側孢芽孢桿菌的16S rRNA序列長度為1000bp (如序列表Seq ID No:1所示),其序列提交至GenBank,以確定菌株的種屬關系。同源性分析結果表明，該序列與空氣芽孢桿菌(Bacillus aerius)菌的16SrRNA序列的同源性最高，保守區相似性為99%，結合細菌形態特征、生長條件和生理生化鑒定結果，發現兩者間存在明顯區別，與本屬其它菌種的區別更為明顯，確定側孢芽孢桿菌屬于一個新菌種，命名為側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4-1。根據側孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA4軟件鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建的NJ系統發育樹，側孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列構建的NJ系統發育樹圖如圖3所示。
[0031]PCR引物購買自北京博邁德科技發展有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自于北京博邁德科技發展有限公司，其他試劑購自于北京生工生物工程有限公司。
[0032]對本實施方式的側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1進行功能驗證:
[0033]側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1處理污染物BDE-47,具體如下:反應體系中BDE-47濃度為50 μ g/L,處理8天，BDE-47的去除率為95%。實驗證明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1具有強化處理污染物BDE-47的功能,可以明顯去除污染物，而且無需添加其它化學制劑，大幅度降低了處理成本，避免了二次污染。
[0034]另外，在反應體系中BDE-47濃度為100 μ g/L，處理8天，BDE-47的去除率為47.5%。表明側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1在高濃度的BDE-47下，仍然具較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47處理 效果。
【權利要求】
1.一株具有降解BDE-47能力的側孢芽孢桿菌，其特征在于它為側孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0 .8616。
【文檔編號】C12R1/07GK103740626SQ201410040222
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】王繼華, 關健飛, 劉翔, 楊雪辰, 龔雪, 張珊珊, 朱丹 申請人:哈爾濱師范大學