專利名稱：：一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及干細胞領域，特別涉及一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法。
背景技術：
：根據細胞發育進程可將干細胞分為成體干細胞(adultstemcells)和胚胎干細胞(embryonicstemcells),根據干細胞的分化潛能等特點,可將干細胞可分為全能干細胞(totipotentstemcells)、多倉泛干細胞(pluripotent/multipotentstemcells)、專倉泛干細胞(unipotentstemcells)和終末分化細胞。全能干細胞可以分化形成人體所具有的全部細胞、或發育形成新的個體，是指在早期胚胎發育過程中的受精卵及受精卵進一步分裂形成2個、4個或8個卵裂球時期的細胞。多能干細胞(英文表述為pluripotentstemcells)可以分化形成人體所具有的全部細胞、但不能發育形成新的個體，主要存在于胚胎之中。在早期胚胎發育過程中，受精卵進一步分裂形成的桑椹胚，桑椹胚再進一步分化形成胚泡；胚泡的成胚體細胞，及在此階段以前的細胞，只要提取一個細胞，都可以可以分化形成人體所具有的全部細胞。另一概念上的多能干細胞(英文表述為multipotentstemcells)已經是上述細胞的發育更晚時期了，如各胚層的細胞、及造血干細胞。這些細胞可以分化成很多種細胞，如造血干細胞可以分化成各種白細胞、紅細胞、血小板等。單能干細胞或專能干細胞，只能分化成一種細胞，或者是分化成關系比較密切的兩種細胞(在特殊條件下也可以發生橫向分化)。單能干細胞存在非常廣泛，在大部分組織器官都有存在。胚胎干細胞(embryonicstemcells,EScells)是一種來源于早期胚胎、能在體外長期傳代培養、維持正常核型、具有自我更新和分化發育為3個胚層組織細胞潛能的多能性細胞。1981年英國Evans等人建立起第一個小鼠的用生化胚胎干細胞株。此后，科學家又相繼建立了豬、牛、綿羊、山羊、兔、水貂、倉鼠、恒河猴、狨等ES細胞系。為研究細胞分化、動物發育、建立相關研究模型、闡明基因功能等開辟了廣闊的研究空間。1998年，美國威斯康星大學Thomson教授，在征得胚胎所有者同意后，從做試管嬰兒剩余的胚胎中分離出胚胎干細胞，并在體外培養成功。同年，美國約翰-霍普金斯大學的Gearhart教授等人從早期(約6周)流產胚胎的卵巢和睪丸組織中分離出原始生殖干細胞，并建立了胚胎生殖干細胞系。隨著同源重組技術在小鼠等哺乳動物遺傳修飾動物模型中的廣泛應用、哺乳動物體細胞核移植技術的建立和日益完善、ES細胞在體外定向分化手段的日益多樣化和成熟，使得ES細胞在多個領域，如細胞治療、組織工程等方面展示了巨大潛力，被認為是細胞移植替代治療的未來的希望。2006年，Yamanaka等系統研究小鼠和人ESCs多潛能性相關因子時發現4個轉錄因子0ct4,Sox2,Klf4,c-Myc,將這四個因子導入鼠成纖維細胞后,成纖維細胞重編程形成ESCs類似的多能干細胞,被稱為誘導多能干細胞(mouseinducedPluripotentStemcells,miPSCs)。2007年Yamanaka和Yu等分別獨立建立了人iPS細胞系(humaniPSCs,hiPSCs)。這一研究成果被譽為生命科學新的里程碑，它不僅為研究多能性的調控機制帶來了觀念上的創新和提供了新的研究模型，更為解決目前干細胞移植治療中最大難點之-移植后的免疫排異問題-開辟了新的途徑。iPSCs細胞在形態、多能性維持和分化潛能上與ESCs—致，且克服了ESCs不可避免的倫理學爭議和異體細胞移植排斥等問題。因此，hiPSCs已逐漸代替hESCs成為未來臨床轉化醫學重要的細胞來源。近幾年來，研究者們陸續從多種細胞類型中重編程獲得hiPSCs細，如皮膚成纖維細胞、骨髓間充質干細胞、肝臟細胞和胃上皮細胞、神經前體細胞、胰島細胞、人皮膚和毛囊角質形成細胞、脂肪干細胞、羊水來源細胞、血液前體細胞、神經干細胞、臍帶血干細胞、臍帶華通膠和羊膜來源細胞、外周血T淋巴細胞等。這種通過活檢或其他借助外科手段獲取種子細胞制備患者特異性的iPS有望克服胚胎干細胞治療中所帶來的免疫排斥和深層的倫理學問題。上述不同的體細胞在hiPSCs重編程過程中有著不同的特點，并且上述方法在獲取所需要的種子細胞過程當中，因為要借助于活檢或抽血等手段，將會對患者造成一定程度上的損傷，所以需要一種新的微創或無創的方法獲取種子細胞，并且這種種子細胞能高效率地被再程序化為iPS細胞。
發明內容針對
背景技術：
中的問題，本發明提供以下技術方案—種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其具體步驟為A、將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留O.2-0.3cm左右毛發根，75%酒精消毒IOmin；B、用清潔眉鑷快速將發根拔出，并快速置入無菌的PBS中漂洗；C、將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；D、每天觀察毛發的生長情況，I周后每3-4天換液一次；E、逆轉錄病毒包裝采用試劑Fugene6和PLATA細胞進行逆轉錄病毒的包裝，分別利用pMX-h0ct4、pMX-hSox2、pMX_hKlf4和pMX-hc_Myc包裝出四種逆轉錄病毒；F、通過逆轉錄病毒感染毛囊干細胞，促使其表達外源的人類0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因，誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；G、毛囊干細胞來源的iPS細胞維持培養及鑒定。作為本發明的優選技術方案，，所述步驟A中小剪刀、鑷子及棉球臨用前滅菌，最好準備一間無菌間，或經紫外滅菌的房間，或病人家中(臨時用70%的乙醇噴灑整個房間)；如采集頭發者，剪去耳后2cmX2cm大小面積的長發，僅留2-3毫米長的毛發，用70%的乙醇棉球擦除被剪毛發部分及周邊部分IOXlOcm大小面積，五min后再用70%的乙醇棉球擦一次。作為本發明的優選技術方案，，培養所述步驟C中的毛囊干細胞培養基為含1%B27、10ng/mLbFGF和50ng/mLEGF的DMEM/F12。作為本發明的優選技術方案，，所述步驟E中轉染前2天，準備4個IOOmm培養皿，各接種2X106個PLATA細胞；轉染當天，4個IOOmm培養皿的PLAT-A細胞匯合度達到70%，符合轉染所需細胞數量要求；取4個EP管，每個加300ulOPT1-MEM和27ulFugene6，輕輕彈勻，室溫孵育5min;pMX_h0ct4、pMX_hSox2、pMX_hKlf4和pMX-hc-Myc各9μg分別加至上述4個EP管內，充分混勻后，室溫孵育15min;將上述4個EP管內混合液分別加至4個IOOmm培養皿，輕輕搖勻培養皿后，放置在37°C，5%C02的溫箱進行培養；轉染24h后，4個培養皿進行換液，各加IOmL不含雙抗的PLATA基本培養基；轉染48h后，收集4個含轉錄因子病毒上清至一個50mL離心管，混勻，約36mL;收集上述病毒后用于感染毛囊干細胞。作為本發明的優選技術方案，，所述步驟F中用1:1:1:1的上述四種混合逆轉錄病毒感染提前24h準備的細胞總數為O.5-1x105的成纖維細胞，并選用10ng/mLPolybrene增加感染效率；8小時后換成新鮮培養液，24小時后重復一次。最后一次重復24小時后轉移感染后細胞到MEFs，24小時后換成iPS培養液，之后每天更換培液，觀察細胞形態變化并記錄第一個克隆出現時間，直到第二十天克隆足夠大時挑克隆擴大培養。作為本發明的優選技術方案，所述步驟G中在原代iPS克隆足夠大或iPS克隆生長接近匯合之前傳代，一般57天傳代一次；可采用兩種傳代方法機械法，主要用于早期iPS克隆挑選及傳代在體視顯微鏡下，用注射器針頭將iPS克隆與飼養層細胞剝離，并切割為數塊；用200uL槍頭輕輕將其逆向鏟離飼養層和培養皿底，并轉種到新的飼養層上，移入培養箱內培養；次日大部分iPS克隆貼壁，隨后每日換液并觀察；消化法加入含Img/mLCollageIV和lmg/mLDispase的培養液置于培養箱中消化10_15min;收集iPS克隆并離心，沉淀用iPS培養液重懸后再次離心；iPS克隆的沉淀用iPS培養液重懸，并輕輕吹吸成50100個細胞的小團塊，按1:31:5分種至新的飼養層上，培養箱中繼續培養；定時觀察和換液。本發明所述檢測方法及檢測試劑盒所帶來的有益效果是1、提供了一種人頭發、胡髭、腋毛及陰毛來源的毛囊干細胞擴增制備方法。2、提供了頭發、胡髭、腋毛及陰毛來源的毛囊干細胞培養基；3、提供了毛囊干細胞重編程為誘導多能干細胞的方法；4、本發明提供的方法僅需要采集低至單根毛發，無需對個體進行組織活檢或抽取血液，極大的減少了人的痛苦；5、采集毛囊時僅需用消毒劑處理五min后直接拔取，過程簡單；6、單根毛囊經二周的培養可得到O.5-lxlO5毛囊干細胞數，細胞量足夠為重編程為誘導全能干細胞提供充足的細胞來源，同時為皮膚缺損的快速修復、毛囊干細胞的生長與發生的分子機理研究、表觀遺傳學研究和誘導多能干細胞提供充足的種子細胞來源。附圖簡述圖1顯示懸浮培養的從一根人毛發上生長出來的毛囊干細胞球(放大倍數20x)。圖2顯示一個從毛囊干細胞再程序化而來的誘導多能干細胞克隆(放大倍數IOx)。具體實施方式下面對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。實施例中，下述縮略語表示如下的意義，未加定義的縮略語使用其通常可接受的定義PBS=磷酸緩沖液；DMEM/F12=DMEM與F12為1:1混合細胞培養基；cm=厘米；bFGF=堿性成纖維細胞生長因子；EGF=表皮細胞生長因子；HBSS=Hank’s平衡鹽溶液；。。==攝氏度；min=min；mL=毫升；μL=微升。第一部分毛囊干細胞采集1、試劑及儀器①70%乙醇；②PBS；DMEM/F12；④IOOx青/鏈霉素儲備液；⑤棉球；⑥帶噴嘴的500毫升塑料瓶；⑦24孔培養板；⑧小剪刀一把；⑨眉毛鑷子一把。2、頭發毛囊的采集①小剪刀、眉毛鑷子及棉球臨用前滅菌，無菌條件下24孔培養板每孔加200uLDMEM/F12及2uLIOOx青/鏈霉素儲備液；②準備一間無菌間，或經紫外滅菌的房間，或病人家中(臨時用70%的乙醇噴灑整個房間)；「SI③被采集毛囊者換無菌衣服或衣服噴70%的乙醇進入無菌間和經紫外滅菌的房丨日J;④采集頭發者剪去耳后2cmX2cm大小面積的長發，僅留2_3毫米長的毛發；⑤用70%的乙醇棉球擦除被剪毛發部分及周邊部分IOXlOcm大小面積；⑥五min后再用70%的乙醇棉球擦一次；⑦十min后手術者無菌條件下持眉毛鑷子采集毛根5至10根，無菌條件下放入24孔培養板中；⑧一小時內送回實驗室中，無條件者可在24小時內4度冷減保存送回實驗室。第二部分毛囊干細胞培養及傳代1、毛囊干細胞的培養試劑及儀器①DMEM/F12液體培養基(Invitrogen,Cat.no.11330-32)；②B27添加劑；③bFGF細胞因子；④EGF表皮生長因子；⑤100X雙抗；PBS；(7)HBSS(Invitrogen,Cat.no.14170-088)；⑧Dispase酶(bectonDickinson,S.A.,cat.no.354235)；⑨TrypLEExpressStableTrypsinReplacement(Invitrogen,Cat.no.12604-039)；⑩C02培養箱；(Q)超凈工作臺；@培養瓶。2、毛囊干細胞培養①毛囊干細胞培養基的配置DMEM/F12，2%B27，20ng/mlbFGF,20ng/mlEGF,1%雙抗；②每孔加入ImlPBS漂洗毛發一次；③每孔加入2ml毛囊干細胞培養基；④置37°C、5%C02培養箱中培養，每3天換液一次，共二周。3、毛囊干細胞消化與傳代①將毛囊干細胞用PBS漂洗一次，加O.5mlHBSS配置的Dispase消化液(500U/ml),視毛囊干細胞團大小,4度消化1—5小時；②將Dispase消化液吸凈，加入O.5ml的TrypLEExpressStableTrypsinReplacement,37度消化20min；③用10%的血清中和，再用200ul的槍頭吹打至單細胞；·④轉移至1.5ml滅菌的Ep管中，300xg離心5min；⑤單個的毛囊干細胞重新種植在有或無MEF的6孔培養皿(先用Matrigel包埋皿底)中傳代。第三部分毛囊干細胞重編程為誘導全能干細胞(iPS)1、試劑準備①pMSCV逆轉錄病毒質粒(含Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc和GFP表達序列，Addgene)；②FuGENE6轉染試劑(RocheAppliedScience,cat.no.1181509001)；③EpiLife。2、pMSCV逆轉錄病毒的擴增①解凍一管293細胞，擴增培養至IOcm直徑的培養皿中至80%的融合，加入27ul的FuGENE6/9ug的pMSCV逆轉錄病毒質粒DNA于培養液中(極慢的加入);②置37°C、5%C02培養箱中培養24小時；③加新鮮的培養基10ml，置32°C、5%C02培養箱中再培養24小時；④采集病毒上清液，并加人新的DMEM培養基；⑤病毒上清液用O.45ulPVDF濾膜過濾，并加入lulpolybrene(10mg/ml)/ml作助轉劑。3、pMSCV逆轉錄病毒的轉染①當種植在有或無MEF培養皿(先用Matrigel包埋皿底)中毛囊干細胞當達到30%的融合時，加入新鮮的病毒上清液(已用0.45ulPVDF濾膜過濾，并加入Iulpolybrene(10mg/ml)/ml作助轉劑)Iml(6孔皿),32°CIOmin；②將6孔皿離心，650xg，32°C45min；③離心后將6孔皿置32°C、5%C02培養箱中培養20min；④移除含病毒質粒的液體，用PBS洗二次，加入新的EpiLif；e⑤24小時后，按上述①④方法重復感染病毒一次；⑥再培養2448小時后，將被感染的細胞轉移到新的MEF培養皿中；⑦以后每二天換液一次，4-5天后應該可以可見小克隆團，1428天后應該可以可見大克隆團；⑧挑出5-7個典型的克隆團進行鑒定并傳代。以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域的技術人員在本發明所揭露的技術范圍內，可不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。權利要求1.一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其特征在于，其具體步驟為A、將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留O.2-0.3cm左右毛發根，75%酒精消毒IOmin；B、用清潔眉鑷快速將發根拔出，并快速置入無菌的PBS中漂洗；C、將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；D、每天觀察毛發的生長情況，I周后每3-4天換液一次；E、逆轉錄病毒包裝采用試劑Fugene6和PLATA細胞進行逆轉錄病毒的包裝，分別利用pMX-h0ct4、pMX-hSox2、pMX_hKlf4和pMX-hc-Myc包裝出四種逆轉錄病毒；F、通過逆轉錄病毒感染毛囊干細胞，促使其表達外源的人類0ct4、SoX2、Klf4和c-Myc基因，誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；2.根據權利要求1所述的一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其特征在于，所述步驟A中小剪刀、鑷子及棉球臨用前滅菌，最好準備一間無菌間，或經紫外滅菌的房間，或病人家中(臨時用70%的乙醇噴灑整個房間)；如采集頭發者，剪去耳后2cmX2cm大小面積的長發，僅留2_3毫米長的毛發，用70%的乙醇棉球擦除被剪毛發部分及周邊部分10XIOcm大小面積，5min后再用70%的乙醇棉球擦一次。3.根據權利要求1所述的一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其特征在于，培養所述步驟C中的毛囊干細胞培養基為含1%B27、10ng/mLbFGF和50ng/mLEGF的DMEM/F12。全文摘要本發明涉及一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其具體步驟為將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留0.2-0.3cm左右毛發根，75％酒精消毒10min；漂洗；將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；1周后每3-4天換液一次；E、逆轉錄病毒包裝；誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；毛囊干細胞來源的iPS細胞維持培養及鑒定。本發明過程簡單；無需蛋白酶消化成單細胞；擴增的毛囊干細胞中β-整合素和角蛋白-19陽性率達90％以上；為皮膚缺損的快速修復、毛囊干細胞的生長與發生的分子機理研究、表觀遺傳學研究和重編程為誘導多能干細胞提供充足的種子細胞來源。文檔編號C12N5/10GK102994447SQ20111026890公開日2013年3月27日申請日期2011年9月13日優先權日2011年9月13日發明者諶兵來,高擎,曾橋申請人:諶兵來,高擎,曾橋