專利名稱：一種一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞分離培養領域，具體涉及一種一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法。
背景技術：
精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳類動物雄性成體內唯一可將遺傳信息傳遞給下一代的干細胞，它具有多潛能性，能被誘導分化成多種類型的細胞， 在一定情況下它還能生成擬胚體，是一種天然不用轉基因就能得到IPS細胞良好材料，而且它生成精子，完成基因的傳遞，伴隨著轉基因技術的興起，它成為一種新的轉基因途徑。精子發生是一個復雜的過程，是維持雄性生殖能力和生命延續的前提。深入了解精子發生的分子和細胞機理，保護瀕危動物物種以及治療人類因化療和放療引起的內源性 SSCs損傷和恢復男性生育能力。精原干細胞技術與動物選種工作相結合，將會大規模的生產出優良家畜。SSCs具有多潛能性并分化為來源于三胚層的多種組織細胞，精原干細胞為今后細胞替代療法和組織器官移植的來源成為可能。其在組織工程、細胞移植、基因治療等領域的運用提供了研究基礎，對臨床醫學有較大應用價值。精原干細胞不僅對生物學、生物學技術、醫學和發育學等方面的研究具有特殊的價值，使其成為近年來國內外的研究熱點。目前研究主要SSCs的分離方法主要集中在機械法和兩步酶法消化；而純化方法主要有差速貼壁法，percoll密度梯度離心法，自然重力沉降法，流式細胞術分選以及免疫磁珠等分選等方法，各種方法都存在著優缺點，根據需要來選擇。
發明內容
本發明的目的在于根據現有的細胞分離培養中存在的不足，提供一種獲得細胞容易，培養時間短，細胞增殖快、狀態好且操作簡便，實驗成本低的分離培養豬精原干細胞的方法。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法，包括如下步驟
(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，去除血污；
(2)去掉睪丸白膜和結締組織，將剩下的睪丸組織剪成小塊，轉移到培養皿中；
(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吹打，靜置，待睪丸組織沉到底部后，棄上清；
(4)重復步驟(3)2 3次；
(5)加入10倍體積的膠原酶消化，于37！的水浴鍋100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到組織塊；
(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm離心5 min，棄上清，收集底部細胞；
(7)用差異貼壁培養基重懸細胞，調整細胞濃度為5XIO6個/ml，接種到事先用0. 1 %
3明膠包被的培養瓶中，在無菌培養箱中培養。作為一種優選方案，上述方法中，所述細胞培養箱的培養條件為37 5 % CO2,飽和濕度。通過MTT法對比三種培養基，DMEM、DMEM-Fl2, α -MEM以及血清濃度5 %，10 %，15 %三種濃度培養效果，得出了 DMEM、15 %血清濃度最為適合豬SSCs的增殖培養。根據文獻報道，添加非必需氨基酸；β -巰基乙醇，L-谷氨酰胺等是培養細胞基礎，起到了營養，抗氧化和能量物質的作用。如表一所示
表1不同培養基和血清濃度對豬SSCs增殖率的影響
權利要求
1.一種一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，去除血污；(2)去掉睪丸白膜和結締組織，將剩下的睪丸組織剪成小塊，轉移到培養皿中；(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吹打，靜置，待睪丸組織沉到底部后，棄上清；(4)重復步驟(3)2 3次；(5)加入10倍體積的膠原酶消化，于37！的水浴鍋100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到組織塊；(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm離心5 min，棄上清，收集底部細胞；(7)用差異貼壁培養基重懸細胞，調整細胞濃度為5XIO6個/ml，接種到事先用0. 1 % 明膠包被的培養瓶中，在無菌培養箱中培養。
2.根據權利要求1所述的一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于所述細胞培養箱的培養條件為37 5 % CO2，飽和濕度。
3.根據權利要求1所述的一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于所述用于培養細胞的培養液主要成分為=DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巰基乙醇55 μ Μ，胎牛血清15%。
全文摘要
本發明公開了一種一步酶法分離培養豬精原干細胞的方法以及培養體系。本發明方法通過采用一步酶法來分離消化豬精原干細胞，替代目前主要采用的兩步酶消化方法，該方法獲得細胞容易，培養時間短，細胞增殖快、狀態好。通過本發明方法，解決了目前精原干細胞分離難、數量少、增殖慢、培養要求高的問題，為快速獲取大量豬精原干細胞提供了一種新的方法。而且本方法操作簡便，實驗成本低，降低了實驗失敗的風險，易于推廣應用。
文檔編號C12N5/076GK102417893SQ20111027292
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者張守全, 白銀山 申請人:華南農業大學