專利名稱：制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種制種玉米病害診斷技術和病原鑒定，尤其涉及制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法。
背景技術：
甘肅省以獨特的自然條件已成為全國玉米制種大省，隨玉米種質資源的廣泛引進，新的自交系和雜交種不斷問世，危害玉米生產的新病害不斷涌現。病害的發生已成為制約著玉米的生產、造成產量降低、品質下降的關鍵。為此，根據地域特點，加強玉米新病害的研究尤為重要。近幾年來，發生在河西走廊制種玉米新病害——玉米裂軸病已成為玉米制種業的嚴重制約因素，而且還會嚴重威脅全國玉米的安全生產。玉米裂軸病[Nigrospora oryzae(Berk. et Br.)Petch.]是甘肅省自交系、雜交種玉米發現的新病害，目前對該玉米裂軸病的防治尚無良策，而對癥狀表現、病原菌鑒定等研究國內尚處空白。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快捷、方便的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法。為解決上述問題，本發明所述的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現和病征表現，判定——當玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內側有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時，即判定為果穗發霉；當脫去玉米籽粒的穗軸發軟，剖開所述穗軸后其內側表面出現黑色霉狀物，顯微鏡檢測為病菌菌絲體和分生孢子時，即判定為穗軸發霉；當玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無光澤；或籽粒為糠粒，果穗開裂時，即判定為籽料秕瘦；當玉米果穗開裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質，顯微鏡檢測為黑色分生孢子時，即判定為籽料粉化；當玉米葉片正反面可見黑色煤污狀的斑點，隨斑點擴大，病斑邊緣出現黃色暈圈時，即判定為葉片污斑；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發分離將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段， 用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養皿內，蓋上皿蓋，在 20 25°C保溫保濕培養Mh，觀察有無菌體生長若有菌絲出現，繼續培養2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為 13. 4 17. 8 μ m 時，即判定為稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch.；若無菌體生長，則采用下述方法進行判定a、組織分離將新發病株或新收玉米種子在無菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培養箱中培養5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落；其中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基是指每IOOOml培養基含200g馬鈴薯、20g瓊脂、20g 葡萄糖的培養基；b、病原菌的純化挑取所述步驟a所得的單個菌落，轉接于瓊脂平板上培養，待長出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個分生孢子于斜面所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA 培養基)上，獲得單孢培養物；C、致病性測定將所述步驟b所得的單孢培養物用無菌水清洗后，用無菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中，在壓力為1.5磅士0.01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無菌麥粒；在無菌條件下，將孢子懸浮液接種于無菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養箱中培養 7 IOd后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項穴接所述麥粒接菌體4g ；同時，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對照，分不同生育期測定發病癥狀，若發病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌；d、病原菌種類的鑒定依據培養性狀和顯微鏡檢測、致病性測定結果，即判定為稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。所述步驟中的無菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下滅菌 30分鐘的水。本發明與現有技術相比具有以下優點1、由于本發明采用田間癥狀觀察，觀察時期和方式系統，識別關鍵性特征明顯，克服了以往采用一個生育期表現的特征診斷病害而造成誤診的現象，因此，田間癥狀診斷方法準確、系統。2、由于本發明采用誘發保溫培養和組織分離技術，需要時間短，方法簡單，易于操作，且能準確的分離得到引起病害的病原菌，分離率較高，因此，病原菌診斷方法簡單易操作、快速且準確。3、由于本發明采用麥粒接種體接種，接種材料易獲得、易于消毒滅菌、消毒滅菌徹底，接種效率較高，因此為種子帶菌檢驗、土壤帶檢驗、病株殘體組織檢驗提供了較好檢驗方法。
具體實施方式
制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現和病征表現，判定——當玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內側有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時，即判定為果穗發霉。當脫去玉米籽粒的穗軸發軟，剖開所述穗軸后其內側表面出現黑色霉狀物，顯微鏡檢測為病菌菌絲體和分生孢子時，即判定為穗軸發霉。當玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無光澤；或籽粒為糠粒，果穗開裂時，即判定為籽料秕瘦。當玉米果穗開裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質，顯微鏡檢測為黑色分生孢子時，即判定為籽料粉化。當玉米葉片正反面可見黑色煤污狀的斑點，隨斑點擴大，病斑邊緣出現黃色暈圈時，即判定為葉片污斑。(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發分離將步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養皿內，蓋上皿蓋，在20 25°C保溫保濕培養Mh，觀察有無菌體生長若有菌絲出現，繼續培養2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為 13. 4 17. 8μπι 時，即判定為稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br.)Petch·。若無菌體生長，則采用下述方法進行判定a、組織分離將新發病株或新收玉米種子在無菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培養箱中培養5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落。其中無菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下的高壓滅菌鍋中滅菌30分鐘的水。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)是指每IOOOml培養基含200g馬鈴薯、20g 瓊脂、20g葡萄糖的培養基。b、病原菌的純化挑取步驟a所得的單個菌落，轉接于瓊脂平板上培養，待長出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個分生孢子于斜面馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基) 上，獲得單孢培養物。C、致病性測定將所述步驟b所得的單孢培養物用無菌水清洗后，用無菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中，在壓力為1.5磅士0.01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無菌麥粒；在無菌條件下，將孢子懸浮液接種于無菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養箱中培養 7 IOd后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項穴接所述麥粒接菌體4g;同時，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對照，分不同生育期測定發病癥狀，若發病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌。 d、病原菌種類的鑒定依據培養性狀和顯微鏡檢測、致病性測定結果，即判定為稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。
權利要求
1.制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現和病征表現，判定——當玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內側有黑色粉末，且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時，即判定為果穗發霉；當脫去玉米籽粒的穗軸發軟，剖開所述穗軸后其內側表面出現黑色霉狀物，顯微鏡檢測為病菌菌絲體和分生孢子時，即判定為穗軸發霉；當玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無光澤；或籽粒為糠粒，果穗開裂時，即判定為籽料秕瘦；當玉米果穗開裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質，顯微鏡檢測為黑色分生孢子時， 即判定為籽料粉化；當玉米葉片正反面可見黑色煤污狀的斑點，隨斑點擴大，病斑邊緣出現黃色暈圈時，即判定為葉片污斑；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發分離將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養皿內，蓋上皿蓋，在20 25°C保溫保濕培養Mh，觀察有無菌體生長若有菌絲出現，繼續培養2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m， 頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為13. 4 17. 8μπι時，即判定為稻黑孢菌；若無菌體生長，則采用下述方法進行判定a、組織分離將新發病株或新收玉米種子在無菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C光照培養箱中培養5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落；其中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基是指每IOOOml培養基含200g馬鈴薯、20g瓊脂、20g葡萄糖的培養基；b、病原菌的純化挑取所述步驟a所得的單個菌落，轉接于瓊脂平板上培養，待長出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個分生孢子于斜面所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，獲得單孢培養物；c、致病性測定將所述步驟b所得的單孢培養物用無菌水清洗后，用無菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中， 在壓力為1. 5磅士0. 01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無菌麥粒；在無菌條件下，將孢子懸浮液接種于無菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養箱中培養7 IOd 后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項穴接所述麥粒接菌體4g ； 同時，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對照，分不同生育期測定發病癥狀，若發病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌； d、病原菌種類的鑒定依據培養性狀和顯微鏡檢測、致病性測定結果，即判定為稻黑孢菌。
2.如權利要求1所述的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，其特征在于所述步驟 (2) c中的無菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下滅菌30分鐘的水。
全文摘要
本發明涉及一種制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，該方法包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現和病征表現來進行判定；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒采用保濕誘發分離的方式來進行判定。本發明簡單易操作、快速且準確，克服了以往采用一個生育期表現的特征診斷病害而造成誤診的現象。
文檔編號C12Q1/04GK102321727SQ20111028941
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月24日 優先權日2011年9月24日
發明者閆治斌, 雷玉明 申請人:甘肅省敦煌種業股份有限公司玉門市種子公司