專利名稱：一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其涉及多肽的制備及初步分離技術。
背景技術：
月太，iii^^j ACE φ M Ii (Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides, ACEIP)是一類能夠降低人體血壓的小分子肽，它是血管緊張素轉換酶 (Angiotensin-converting Enzyme, ACE)的抑制劑，可通過抑制血管緊張素I向血管緊張素II轉換以及阻止ACE降解緩激肽而起到降低血壓的作用。盡管目前的多種化學合成肽類可以抑制ACE活性，但都有一定的副作用，且由于他們的作用時間不長，停藥后會使血壓反彈，而大量的實驗證明乳蛋白來源的ACE抑制肽具有較高的體內降壓作用，主要集中在小分子的肽類。1979年Oshima等最早報道食品蛋白源ACE抑制肽是由細菌膠原酶降解明膠獲得的六條活性肽，并證實抑制ACE活性的肽分子量主要集中在1500u以下。1982 年Maruyamas第一次從牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解液中分離出具有ACE抑制作用的十二肽、七肽、六肽和五肽。目前酶法制備乳源蛋白降血壓肽的方法包括直接酶解法和利用微生物間接酶解法，直接酶解又可分為單酶水解和復合酶水解。Nakamura、Yamamoto和 Abubakar等采用微生物間接酶解法從酸牛乳、干酪乳清中得到了具ACE抑制作用的降血壓肽;Aubois、拉爾夫、羅永康、毛學英等通過蛋白酶水解乳清蛋白的得到了具ACE抑制作用的降壓肽。從目前已有的相關文獻報道發現，水解乳清蛋白制備降血壓肽主要使用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，均為單酶或雙酶水解法，上述方法得到的降血壓肽的分子量主要集中在1500u左右。本發明模擬人體胃腸道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶單酶和復合酶三酶兩步水解法制備乳清蛋白降血壓肽，較單酶或雙酶水解法得到的降血壓肽分子量更小、體內吸收更容易。
發明內容
本發明的目的是提供一種以乳清蛋白為原料生產降血壓肽的方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用三酶兩步水解法獲得具有高ACE抑制活性，且易于體內吸收的小分子降血壓肽。本發明是這樣實現的，一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，包括如下步驟
(1)乳清蛋白為原料，加水配制成質量濃度為19Γ3%的乳清蛋白懸濁液，85°C 90°C 保持IOmin使乳清蛋白變性，冷卻至室溫后調節pH=l. 5 2. 0，水解溫度為35°C 40°C，每Ig 乳清蛋白加胃蛋白酶25000擴35000U，水解時間為廣3h ；
(2)酶解結束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心；
(3)取步驟(2)所得上清液，調節pH=7.5^8. 0，水解溫度為45°C ^50°C，每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000U 20000U，水解時間為4 6h ；
(4)酶解結束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，上清液真空濃縮后冷凍干燥得乳清蛋白降血壓肽粗品；
(5)取步驟⑷的乳清蛋白降血壓肽粗品，配制20mg/ml的多肽溶液IOOmL,加入30g 的DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態吸附3 5h，依次用25%、50%、75%、100%乙醇洗脫廣3h，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；
(6)取步驟(5)中的質量百分比濃度為75%的乙醇溶液洗脫組分，利用S印hadex G-IO凝膠層析進一步分離，超純水lmL/min的流速進行洗脫，收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得粉末狀乳清蛋白降血壓肽。本發明所具有的優點
(1)本發明提出了一種制備乳清蛋白降血壓肽的新方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用三酶兩步水解法。此法安全、無毒副作用，工藝簡單易行，便于工業化生產。(2)本發明制備的降血壓肽分子量分布在IOOOu以下、主要集中在600u左右，易于體內吸收，且具高ACE抑制活性。(3)本發明制備的降血壓肽來源于牛乳蛋白，因此具有安全、無毒副作用，對正常血壓無作用等特點，可用于制備降血壓藥物和食品。
具體實施例方式
實施例1
本發明所述一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，以乳清蛋白為原料，每1. 5g乳清蛋白加水100mL，85°C 90°C保持IOmin使乳清蛋白變性，冷卻至室溫后調節pH=l. 8，水解溫度為37°C，每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶29000U，水解2h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶， 冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液調節pH=7. 8，水解溫度為48°C，每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶15000U和胰凝乳蛋白酶15000U，水解5h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液真空濃縮后冷凍干燥得白色或淡黃色的粉末狀乳清蛋白降血壓肽粗品。取乳清蛋白降血壓肽粗產品配制20mg/ml的多肽溶液，每IOOmL溶液加30g DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態吸附4h，依次用25%、50%、75%、100%乙醇洗脫2h，收集并濃縮75%的洗脫組分。質量百分比濃度為75%的乙醇洗脫組分利用S印hadex G-IO凝膠層析進一步分離，超純水lmL/min的流速洗脫，收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得乳清蛋白降血壓肽產品。實施例2
與實施例1類似，其區別在于每3g乳清蛋白加水100mL，pH=2. 0，每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶35000U，水解時間為3h。
權利要求
1.一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征在于其步驟為(1)乳清蛋白懸濁液在85、0°c條件下保持IOmin變性，冷卻至室溫，調節PH后加入胃蛋白酶，反應廣3h后滅酶，冷卻后離心取上清液；(2 )取步驟(1)所得上清液調節pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應4 6h后滅酶， 冷卻后離心取上清液；(3)取步驟(2)所得上清液，真空濃縮后冷凍干燥得到白色或淡黃色的乳清蛋白降血壓肽粗品；(4)取步驟(3)所得乳清蛋白降血壓肽粗品用DA201-C大孔吸附樹脂吸附，然后乙醇梯度洗脫，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；(5)取步驟(4)所得到的75%的乙醇洗脫組分利用葡聚糖S印hadexG-IO凝膠層析分離得到乳清蛋白降血壓肽。
2.根據權利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)中乳清蛋白懸濁液質量濃度為1% 3%，加酶量為每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶25000擴35000U， PH= 1. 5 2. 0，水解溫度為350C 40°C。
3.根據權利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(2) 中加酶量為每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000擴20000U， pH=7. 5 8. 0，水解溫度為450C 50°C。
4.根據權利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)和 (2)中滅酶條件為8(T90°C保持lOmin，冷卻至室溫后4000r/min離心。
5.根據權利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中取乳清蛋白降血壓肽粗品溶于水中，加入DA201-C大孔吸附樹脂下靜態吸附;T5h，依次用體積分數為25%、50%、75%、100%的乙醇洗脫廣3h，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分，實現乳清蛋白降血壓肽的初步分離。
6.根據權利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中將質量百分比濃度為75%的乙醇溶液洗脫組分通過S印hadex G-IO凝膠層析進一步分離， 收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥獲得粉末狀乳清蛋白降血壓肽。
全文摘要
一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，屬于生物技術領域。步驟乳清蛋白懸濁液在85~90℃條件下保持10min變性，冷卻至室溫，調節pH后加入胃蛋白酶，反應1~3h后滅酶，冷卻后離心取上清液；調節pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應4~6h后滅酶，冷卻后離心取上清液；真空濃縮后冷凍干燥得到白色或淡黃色的乳清蛋白降血壓肽粗品；用DA201-C大孔吸附樹脂吸附，然后乙醇梯度洗脫，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；利用葡聚糖SephadexG-10凝膠層析分離得到乳清蛋白降血壓肽。優點安全、無毒副作用，工藝簡單，便于工業化生產；易于體內吸收，具高ACE抑制活性；具有安全、無毒副作用，對正常血壓無作用等特點，可用于制備降血壓藥物和食品。
文檔編號C12P21/06GK102329845SQ20111029453
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者呂兵, 王建峰, 王桂春, 陸劍平 申請人:常熟市金城食品添加劑有限公司