專利名稱：一種同序引物置換的核酸擴增技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學及分子診斷領域的核酸擴增技術領域，具體涉及一種為減少引物間聚合非特異性擴增而采用一對中間序列大部分相同引物的核酸擴增技術。
背景技術：
核酸擴增技術起源于1971年，Korana提出的核酸體外擴增設想“經過DNA變性， 與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。也是隨著現代分子生物學的進步而一起發展、成熟的。1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis在研究核酸測序方法時產生了核酸擴增的靈感于試管中模擬天然的 DNA體內復制過程。其基本原理提供一種合適的條件一模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA 聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經過一系列探索、發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的發明、應用， Cetus公司于1987年申請了首個PCR發明專利(US Patent 4,683,202)。核酸擴增PCR反應由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性擬擴增的模板DNA經加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸升溫至72°C左右，DNA模板一引物結合物在耐熱 DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，尊循堿基反向配對與半保留復制原理，按5’ -3’方向合成一條新的與模板DNA鏈反向互補的半保留復制鏈，不斷重復循環變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。一般PCR進行30個循環就能將待擴目的基因呈指數擴增放大數百萬倍以上，超過30個循環引物二聚體非特異性擴增就極劇增加。反應最終的DNA擴增量可用Y = (1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，η代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期PCR產物逐漸增加，進入一定循環后靶序列DNA片段的增加呈指數形式即對數期，隨著擴增產物的累積及PCR成份的消耗，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，達到“停滯效應”平臺期。隨著1985-1988年Miki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐熱DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐熱聚合酶的發現應用，PCR技術逐漸成熟、實用，并因其高靈敏度、操作簡便而快速傳播全世界，因而1989年稱為“PCR爆炸年”。PCR技術已成為生命科學領域最重要的核心基礎技術，Kary Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。在以后的二十年里，多達數十種PCR新改進，新方法不斷涌現，被發明，包括反轉錄 PCR(RT-PCR)，原位 PCR,連接酶鏈反應(Ligase chain reaction, LCR)，標記 PCR(Labeled primers, LP-PCR)，反向 PCR(reverse PCR，擴增兩引物外側未知序列)，不對稱 PCR(asymmetric PCR)，降落 PCR(touchdown PCR)，重組 PCR(recombinant PCR)，巢式 PCR (nest PCR)，多重 PCR (multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差異 PCR， 鏈替換擴增(Stranddisplacement amplification, SDA)，依賴核酸序列的擴增(Nucleic acid sequence-basedamplification, NASBA), 5 Hc 1 ^ Γii^^ (Transcript-based amplification system, TAS)，Q^ 復制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 擴增，滾環擴增 (Rolling circle amplification, RCA),環介導的等溫擴增(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)等，尤其是近年來各種實時熒光PCR(Real-time PCR)技術的發展實現了從定性測定到精確定量的飛躍，如熒光染料STORGreen I實時熒光PCR和各種熒光探針 Taqman(Hydrolysisprobe),FRET Hybriditionprobes,and Molecular Beacons PCR,詳 jgi^M (Maisa L. Wong and Juan F. Medrano, BioTechniques 39 :75-85, July 2005)。 酸擴增技術不僅極大提升了基因克隆技術也提高了核酸檢測靈敏度、效率，PCR應用已拓展到生物學的眾多領域。PCR技術已不是單一技術方法，而是包括一系列理論、方法學及應用的新學科。詳細綜述于PCR書籍(黃留玉等“PCR最新技術原理、方法及應用”化學工業出版社2005年)，PCR廣泛應用于分子克隆、測序、基因重組、蛋白質工程等生命科學研究，及醫療、農林、畜牧、環保、食品等眾多檢測應用領域，已成為二十一世紀生物學最核心的基礎技術。截至目前全世界與PCR相關的專利已多達數千個以上。綜上，常規終末檢測PCR只能定性分析，靈敏度不夠，低于1000拷貝數標本測不了否則引物二聚體非特異性擴增導致假陽性結果，以及擴增產物汽霧膠再污染所致假陽性等難題，常規PCR加產物凝膠電泳檢測方法難以適用臨床檢驗等應用檢測。1992年Higuchi 等首次提出了采用動態PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數量進行分析，為解決傳統PCR的難題提出了新思路。實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產物量(產物標記熒光強度)與起始靶基因量直接相關而定量。擴增產物量增加的熒光信號達到對數期的循環數Ct值(Cycle threshold)與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關線性關系。即起始模板稀釋一倍達到同樣對數期熒光強度所需的擴增循環就要增加一個循環數(Ct)。擴增產物增加的信號既可通過產物DNA結合熒光染料顯示，如基于熒光染料STOR Green I的實時熒光PCR(US Patent6, 569, 627)；又可采用帶淬滅基團的熒光探針來檢測。被淬滅的熒光探針即可以通過降解而激活，如1995年美國PE公司研制出了 Taq酶水解的熒光標記探針及實時熒光定量 PCR 技術(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res :4 :357-362)，于 1997 年申請了水解探針(商品名AaqMan) PCR發明專禾Ij (US Patent 6，485，903)，以及Epoch公司在水解熒光探針基礎上增加結合效率的MGB探針(US Patent 7，205，105)。被淬滅的熒光探針也可以通過二級結構改變而激活，分子信標Molecular beacon(Tyagi S，et al, 1996,Nat Biotechnol 14:303-308)正是這樣一種莖環結構的雜交探針，于1999年申請了 Molecular beacon發明專利(US Patent 05925517)。其它雙雜交(FRET)探針，蝎形(Scorpion)探針， Sunrise-Primer, Lux Pimers等使用范圍局限于一定的應用，不明顯優于水解探針TaqMan 方法。熒光染料STOR Green I的實時熒光PCR法靈敏度可達數個拷貝，定量精確，但引物二聚體擴增結合熒光的假陽性限制了其臨床應用；而水解探針TaqMan實時熒光PCR增加了一道特異探針雜交，非特異性引物二聚體擴增不產生熒光，廣泛用于臨床檢驗，但也存在靈敏度低一個數量級，定量線性關系不精確。不同于常規PCR檢測終末反應-平臺期擴增產物，一般PCR只擴增25至30個循環產物量就夠用了 ；而實時熒光PCR需要檢測低至10拷貝靶分子的Ct40循環數，TaqMan 等標記探針PCR至少需要擴增40個循環，基于熒光染料STOR Green I的實時熒光PCR為了發揮更高靈敏度通常需要擴增45個循環。因此實時熒光PCR技術存在著更嚴重的引物二聚體非特異性擴增問題，極過量的僅四種堿基排列組合的一對引物存在25%以上的同源性，也具有25%的互補性，引物對3’末端少量互補雜交后在聚合酶作用下延伸形成引物二聚體，在隨后熱循環中以二聚體為模板被游離引物大量非特異性擴增、并結合染料。在不加模板的基于染料STOR Green I實時熒光PCR實驗中，絕大多數一對引物產生二聚體的本底循環閾值(Ct值)一般在30個循環附近，有些引物對本底Ct值甚至不到25個循環，位于靶分子定量檢測范圍Ct值15-37循環或“黃金檢測窗口”之內，嚴重干擾低濃度(拷貝數) 靶分子的定量和弱陽性誤讀。其實常被忽略的是TaqMan等探針實時熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見引物二聚體發射熒光，但會競爭PCR系統成份，降低擴增效率而導致靈敏度降低，弱陽性易漏檢；定量也不準確，線性關系及重復性不佳。實時熒光PCR “閉管分析”多數情況下并不完全密閉，也存在擴增產物汽霧膠再污染的難題，除螺旋蓋毛細管外，大多數0. 2ml PCR試管或96孔板，在熱循環95°C變性時，高溫高壓下就會有一些氣霧膠溢(擠)出管蓋，一個氣霧膠顆粒就含有IO5個分子拷貝，氣霧膠不僅含高濃度已擴增陽性靶分子，更多的是過量一對引物間產生的引物二聚體擴增或引物-探針聚合體的擴增，且每一個檢測反應管/孔都會產生引物二聚體非特異性指數擴增。 隨著重復同一 PCR，泄漏的污染物會得到反復地指數擴增、積聚，隨后的實時熒光PCR不是從0循環開始而是從上次PCR結束循環數開始，污染物越來越多。擴增產物汽霧膠再污染一般采用dUTP代替dTTP產物再結合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG，US Patent 6，090, 553) 選擇性降解污染產物，UDG/UNG隨后PCR熱變性失活，但在實際工作中對大量的引物二聚體含dUTP擴增產物降解作用有限，并不能消除或推后STOR Green I實時熒光PCR本底引物 Ct值。
發明內容
為了克服引物二聚體造成的PCR假陽性結果使STOR Green I實時熒光PCR等核酸擴增技術不利于臨床檢測分析的局限，本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”依據單一引物自身不形成二聚體或一對70%以上高度相似的引物PCR本底Ct值在50-60循環數以后的實驗結果。采用將一側或兩側常規引物置換成一對約70%同序的引物，再進行核酸PCR擴增，既不干擾靶分子擴增，其本底又在PCR45個循環內基本為一直線，沒有非特異性擴增值增加。再輔助以礦物油封閉下的一端引物緩釋熱啟動及PCR增強劑DMF和UNG修飾處理使核酸應用檢測在PCR反應內沒有引物二聚體累積，PCR多重封閉沒有氣霧膠產生或僅沒有擴增的氣霧膠，萬一可能的產物泄露也可進一步被UNG有效酶解，多重保證不產生假陽性非特異性反應，使核酸擴增檢測絕對可靠。本發明提供的一種同序引物置換的核酸擴增技術，其步驟包括(1)在靶特異引物5’上游連接人工序列，形成嵌合引物；( 以所述嵌合引物擴增靶模板產生兩端帶人工序列的二次模板；C3)用65% -75%同序的人工序列作為置換引物擴增二次模板。進一步，其為單側靶特異引物置換的核酸擴增技術，其置換引物設計公式以XnR 表一側直接靶特異引物一段堿基，中間&確定為應同序的堿基，則Yn代表另一側靶特異引物序列堿基，以xn、χτ、Yn代表任何A/G/C/T，A為腺嘌呤堿基；直接靶特異序列引物X :5’ -X1X2-X5Xt……)CTxAXAXn-3’，嵌合引物乙5，Inylri…yn_5)(T……X+T(A) AX^AAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，置換引物Sy :5，-ynyn-r"yn-A……)(T(A)AXn-3，，Xa 變異為 A。置換引物嵌合引物均按2-20 1預先配好。進一步，其為雙側靶特異引物置換的核酸擴增方法，其多重靶引物低濃度而過量擴增引物單一化策略，特別適合多重PCR檢測。其置換引物設計公式以Xh代表一側直接靶特異引物序列堿基，則Yh代表另一側靶特異引物序列堿基，S1^n為一對70%同序的功能序列堿基，A為腺嘌呤堿基。一側嵌合引物)(s :5，-S1-S6……Sn_1Sn+AAX1X2……XlriXnI',一側置換引物 & :5，-S1-S6……SmSn-3，，另一側嵌合引物Ys:5，-Yny^1- yn_5S6……Sn-ASjAAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，另一側置換引*SY:5’-ynyn_r"yn_5S6……SnJVSn_3’，Slri 變異為 A。置換引物嵌合引物均按5-50 1預先配好。進一步，所述擴增反應體系加入PCR增強劑-2%二甲基甲酰胺DMF。進一步，所述嵌合引物嵌合結頭處盡可能地引入脫氧腺嘌呤dA堿基，以使嵌合引物聚合體非特異性擴增產物含盡可能多、密度更集中的dUTP堿基。進一步，所述嵌合引物兩端首尾預先設計有4-6kiSe堿基互補，所述首尾互補的嵌合引物在室溫條件下形成首尾自雜交結合的類似鍋柄樣或分子燈塔樣的莖環結構。進一步，所述盒成份包括核酸提取試劑，dNTPs, DNA聚合酶及其緩沖液，逆轉錄酶及其緩沖液，上游引物F/下游引物R，標準對照物，純化水dH20和礦物油。進一步，其一端引物采用緩釋熱啟動，所述引物緩釋熱啟動是將引物預先吸附于引物緩釋劑。進一步，所述引物緩釋劑為20%葡聚糖溶液、天然粘膠、弱陰性離子交換樹脂、表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質、弱陰性離子纖維素或人工合成的低聚堿基微球。進一步，所述表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質為殼聚糖。核酸擴增PCR技術非特異性高背景主要是由引物二聚體(Primer Dimer)反復擴增、累積造成的。目前采用的種種抑制引物二聚體PD非特異性擴增的試劑、措施對引物-引物和靶-引物之間的作用缺乏特異針對性，沒有根本解決PD非特異性擴增的限制。本發明 “一種同序引物置換的核酸擴增技術”從關鍵的引物自身來解決特異問題。根據任意對引物在STOR Green I實時熒光PCR檢測中總是或多或少存在引物二聚體，而任意單一引物相互間只要沒有連續三個堿基以上的互補，就總是沒有任何二聚體形成的實驗前提，提供一種通過5’外帶人為序列靶特異引物來預擴增靶模板，產生外帶人為序列的二次模板后再采用 70%同序的一對人為序列引物PCR，其所用引物對，近似單一引物，從而大大減少二聚體形成的設計擴增方法。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其基本特征在于核酸擴增技術的同序引物置換策略，先在靶特異引物5’上游加上一段人為序列，以此預擴增靶模板而產生兩端帶人為序列的二次模板，再使用70%同序的人為序列作為PCR引物擴增二次模板。其關鍵特征還在于采用一對高度同序的人為引物代替靶特異引物擴增，部份同序引物PCR循環內不會產生引物二聚體非特異性擴增。適用于有引物結合、延伸的各種PCR技術包括等溫擴增技術。“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，核酸擴增技術的一端引物緩釋熱啟動，所述的引物緩釋是引物預先吸附于某一固體物質表面或包含在某一特定材料內，能可逆吸附吸引物的物質或材料稱為引物緩釋劑，預加樣的緩釋引物常溫下不進入PCR反應液使擴增不能進行，熱變性后引物完全釋放入PCR反應液啟動PCR運行，并且要不干擾PCR。所述的引物緩釋劑一般包括比重大且粘性強的液體如20%葡聚糖(Dextran)液，天然粘膠等，和表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質如殼聚糖(Chitosan)，弱陰性離子交換樹脂/ 纖維素，人工合成的低聚堿基微球。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，一側靶特異引物置換的核酸擴增技術，其不易產生假陽性診斷，適合臨床傳染性疾病檢測。其置換引物設計公式以Xn代表一側直接靶特異引物一段堿基，中間)(τ確定為應同序的堿基，則Yn代表另一側靶特異引物序列堿基，以xn、XT、Yn代表任何A/G/C/T，A為腺嘌呤堿基。直接靶特異序列引物X :5’ -X1X2-X5Xt……)(τΧΑΧΑΧη-3’，嵌合引物乙5'-y^···yn_5XT……Xt(A)AX^AAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，置換引物Sy :5，-YnYn^1-yn-5XT……&(A)AXn-3，，Xa 變異為 A。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，雙側靶特異引物置換的核酸擴增技術，其多重靶引物低濃度而過量擴增引物單一化策略，特別適合多重PCR檢測。其置換引物設計公式以Xh代表一側直接靶特異引物序列堿基，則Yh代表另一側靶特異引物序列堿基，S1^n為一對70%同序的功能序列堿基，A為腺嘌呤堿基。一側嵌合引物 Is :5，-Sr.. &……Sn_1Sn+AAX1X2……XlriXnI'，一側置換引物 & :5，-S1-S6……SmSn-3，，另一側嵌合引物Ys :5，-Yny^1- yn_5S6……Sn-ASjAAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，另一側置換引物Sy :5’ Inylri…yn_5S6……SnJVSn_3’，Slri 變異為 A。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”一對置換引物同序率為65% -70%, 同序率高低可調節特異擴增Ct值與本低Ct值推后與提前，以取舍平衡。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，擴增反應體系加入PCR增強劑 -2%二甲基甲酰胺(DMF)，優選終濃度-1. 2% DMF，加入增強劑DMF多少可調節特異
擴增Ct值與本低Ct值推后與提前，以取舍平衡。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，長合成嵌合引物嵌合結頭處盡可能地引入脫氧腺嘌呤dA堿基，以便使嵌合引物聚合體非特異性擴增產物含盡可能多、密度更集中的dUTP堿基，提高預加的尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG)更有效的酶解。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，長合成嵌合引物兩端首尾預先設計有4-6baSe堿基互補，首尾互補的嵌合引物在室溫條件下會形成首尾自雜交結合的類似鍋柄樣或分子燈塔(Molecular beacon)樣的莖環結構，不與其它引物或無關核酸非特異性反應，PCR熱變性啟動特異性雜交、擴增。所述的“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其技術用于基因檢測試劑盒，盒成份包括核酸提取試劑，dNTPs,Taq等DNA聚合酶及其緩沖液，逆轉錄酶及其緩沖液，上游引物F/下游引物R，標準對照物，純化水dH20，礦物油。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其基本原理、操作及應用均同于一般常規核酸擴增PCR技術，只是選擇同序引物置換的使用方式不一樣。雖然也有實驗采用將靶特異序列引物置換成不同于靶序列的引物后進行核酸PCR擴增，但目前尚未見為了減少引物二聚體非特異性擴增的大部同序引物置換擴增的方法。本發明內容主要是以熒光染料STORGreen I實時熒光PCR技術來書寫、實驗及應用，原因是基于染料STOR Green I 實時熒光PCR技術原理簡單、直觀，定量數據容易分析，并不是表示本發明技術僅限于STOR Green I實時熒光PCR這一技術。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”適用于有引物雜交、延伸的各種核酸擴增技術而解決其引物二聚體非特異性擴增的根本問題。核酸擴增系統一般由模板、引物、底物和聚合酶及相應的緩沖液組成，其中引物不僅決定著檢測的特異性，而且擴增產物直接從引物延伸而來，靶核酸擴增數百萬倍是由于過量數百億倍的引物作用所致，一對擴增引物往往使用5 μ M/L或5ρΜ/ μ 1濃度(反應終濃度 0. 1 μ M/L 或 0. IpM/ μ 1)，折算成分子數為 5 X 6. 02 X 1017/L 或 5 X 6. 02 X IO11/ μ 1，其數目遠遠過量于模板濃度，甚至較最終擴增產物分子數目也高出很多倍以上。一對引物每條必須3-5 μ M/L或3-5ρΜ/ μ 1才能有效的特異性擴增靶模版，如此極過量的一對引物3’末端有互補即相互雜交延伸產生二聚體，再大量被非特異性擴增。引物二聚體形成一般是借助其3’末端多個互補堿基反向配對、互為引物延伸形成二聚體，引物對之間多個連續反向互補堿基可通過常規引物設計方法規避，但有1-2個互補序列不可避免，DNA鏈核糖有5’3’ 方向性而堿基沒有方向性，引物對3’末端少數堿基互補可借助一條引物彎曲轉向后3’末端外的多個不連續互補堿基的合力結合、延伸產生二聚體，在隨后熱循環中以二聚體為模板被游離引物大量非特異性擴增、并結合染料，在不加模板的基于染料STOR Green I實時熒光PCR本底對照實驗中，引物二聚體非特異性擴增一般在30個左右熱循環開始進入對數增長期，非特異性擴增開始嚴重起來，對于一般PCR而言，30個熱循環擴增產物量足夠用了，大多PCR可以結束了，如果沒有二聚體擴增產物的污染以及污染被反復擴增，引物二聚體對于大多數30個熱循環以內的PCR影響不太大。絕大多數一對引物產生二聚體的本底循環閾值(Ct值)一般在30-32個循環附近，實時熒光PCR第30-40個熱循環仍位于1000-10 拷貝靶分子檢測范圍或黃金檢測窗口期，因此嚴重干擾低濃度靶分子精確定量和弱陽性標本準確定性。引物形成二聚體理論上是低于引物間雜交Tm值溫度時耐熱聚合酶部分催化作用，但是熱變性熱啟動PCR的本底引物Ct值也僅推后1-3個循環數，多在Ct33個循環左右。因此熱啟動僅能破壞一對引物3’末端個別1-2個堿基雜交，引物二聚體大部分成因還應該是源于熱循環引物退火溫度時末端少數互補堿基再借助3’末端外的引物間多個不連續正向平行互補堿基的合力結合、而延伸產生二聚體。還有常常被大家忽略的是TaqMan等探針實時熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見引物二聚體發射熒光，但會耗盡PCR系統成份，降低擴增效率。更嚴重的是TaqMan 等探針與過量引物之間亦會有互補雜交、延伸，在不加模板，僅加一對引物與TaqMan探針的STOR GreenI實時PCR的Ct值提前至25個循環左右，說明引物加探針PCR會形成一些 “帶探針序列的二聚體、三聚體”，隨后非特異性擴增的“二、三聚體1爭結合大量TaqMan探針，導致弱陽性低拷貝模板不易結合探針而共同導致靈敏度降低而弱陽性漏檢。核酸擴增系統的引物、底物和聚合酶及相應的緩沖液buffer和Mg2+離子成份均是長期實驗優化結果，允許變化的范圍非常窄，簡單的濃度改變對引物二聚體非特異性擴增和靶特異性擴增的效果基本均是平行的作用。如使用降低一半濃度的常規引物能顯著降低二聚體的形成量，但也同時平行極劇降低特異性靶模板擴增數量，使正常PCR不能進行。 改變聚合酶及相應的緩沖液buffer和Mg2+、K+離子效果基本也是同樣結果。但對于擴增 100-200bp短模板常規實時熒光PCR尤其TaqMan探針法而言，使用降低一半常規濃度dNTP 底物可提高部分擴增效率。核酸擴增技術常常采用多種PCR增強劑，如甜菜堿(Betaine)， 二甲基亞砜(DMSO)，甲/乙酰胺等增加擴增效率、平行推前約1個Ct值，更主要還是有效增進模板二級結構解鏈擴增，但Betaine雙性試劑破壞礦物油封閉作用。我們發現終濃度
二甲基甲酰胺(DMF)效果更佳，能平行推前1-3個Ct值而不干擾礦物油的封閉，但也沒有特異性。尋找解決引物二聚體非特異性擴增關鍵性措施還得從引物配對堿基互補雜交和同序堿基相互排斥的自身特異規律去探索。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其依據一是相互間沒有連續互補的任意一對常規引物，在不加陽性模板的核酸實時STOR Gree I熒光PCR擴增體系中，其僅由引物二聚體形成的本底擴增Ct值一般大多在30-32循環數左右(見圖1)，恰好位于低拷貝數模板10-1000COpy/次反應檢測范圍，干擾特異性擴增檢測；單一引物自身雙倍量的本底Ct值一般于100循環內大多是沒有擴增的一條直線，或者一對高度同源即大于70%以上同序引物的本底Ct值往往位于60-70循環以后，遠在最低拷貝數檢測范圍之外。因此一條創新思路就是盡量選擇盡量同源及最少互補的一對引物PCR，一般可以推后本底Ct值幾個循環，使之落在檢測窗口之后。但是一對天然引物的同源率不會高于50 %，仍有本底Ct值 33-37不等，并且隨著重復同一檢測的反復進行，微量氣霧膠交叉污染也會累積而本底Ct 值會逐漸前移，產生假陽性反應(見圖幻。所以采用70%同源的一對人為序列引物盡量近似單一引物，不明顯影響靶特異性擴增Ct值的前題下，在PCR反應循環內消除引物二聚體的擴增，杜絕連續、反復同一擴增時累積氣霧膠污染之源。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其依據二是PCR特異性由引物3’端一段靶特異序列決定，引物5’端可加上一段無關序列的特性，將選擇的靶特異序列一側或兩側引物5’端前面加上一段無關人為序列形成嵌合引物并不影響靶分子特異性擴增。如僅一側外加人為序列則選取另一側靶特異Ct值序列的70%部份加30%變異作為外加人為序列合成一側嵌合引物；如兩側都外加人為序列則選取一特定功能或稀有序列如T7啟動子作為外加人為序列，其中一條作30%變異，合成兩側嵌合引物。首先以1/5-1/20常規濃度的嵌合引物預擴增靶序列生成帶外加人為序列的置換模板，再以70%以上同序的外加人為序列作為置換引物進行置換模板STOR Green I實時熒光定量PCR等核酸擴增。靶特異序列引物不能置換成完全同序引物以免置換模板兩末端自身雜交干擾擴增，有些甚至置換成80%同序的一對引物也明顯干擾正常PCR的進行及精確定量，置換多少比例同序需要在特異Ct值與本底Ct值之間取舍平衡。一對70%部份同序置換引物與1/5-1/20常規濃度嵌合引物的核酸PCR擴增一般會推遲特異性Ct值1-2個循環，可以被二甲基甲酰胺(DMF)等PCR增強劑部分彌補，但換來的是整個熱循環內沒有引物二聚體擴增、本底PCR反應為一直線，解決了臨檢假陽性結果的困擾。核酸擴增假陽性結果可能的原因還包括(1)過量引物與無關DNA模版的非特異性雜交、擴增，首先引物設計除考慮靶基因外，樣本中所有核酸DNA可能交叉雜交的大段連續堿基序列均必須排除在引物選項之外，這樣即使存在個別區少量雜交也僅導致線性擴增，非特異性擴增不聚焦；幾乎不可能產生一對引物雜交的指數式擴增。其次，因靶模板濃度非常低，過量的引物與低濃度隨機無關序列DNA進行100個循環內也不見有擴增Ct值， 這種假陽性概率極低。( 擴增產物氣霧膠再污染，其主要成份是引物二聚體，也包含陽性擴增產物片段。防止氣霧膠溢出擴散的關鍵是采用螺旋蓋PCR管、加礦物油封閉等密閉措施，但即使PCR反應液表面加一層礦物油也因加樣/礦物油時濺出的或液面管壁上殘留的 PCR混合液仍然能有效PCR擴增，并有產物氣霧膠溢出，造成下次同一重復PCR交叉污染。 防止這種污染的一個措施是同時采用dUTP代替dTTP的底物(dNTP)，dUTP不影響正常PCR 擴增，但PCR產物氣霧膠污染因含dUTP的單鏈/雙鏈DNA均被擴增體系預加的UDG酶降解，理論上UDG酶可從含dUTP六個堿基以上的DNA片段切除dUTP，對于大于IOObp陽性靶分子片段比較有效，而實際PCR檢測中對于引物二聚體作用降解極其有限，可能引物二聚體太短，含dUTP密度不夠而量又大。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”，其內容關鍵是一側引物和雙側引物置換的同序引物置換PCR策略、及一側和雙側置換引物的設計，同序引物置換的核酸擴增實驗操作；輔助以礦物油封閉下的一端引物緩釋熱啟動，DMF增強劑和嵌合引物變異修飾的UNG酶解。以及核酸擴增反應條件，再結合各種PCR綜合優化措施。一側同序置換引物設計方案對于一般單個(/單重)定量檢測PCR和常規RT-PCR反應，應首選該種相對較簡易方案，選取一段靶最特異的序列片段，從有意義鏈序列篩選出盡量連續反向互補的兩段數個堿基區，上游就以有義鏈為引物序列，其下游換成反義鏈引物序列后形成局部有連續數個同序堿基的一對高度同源引物，同時考慮引物對之間盡量少地有連續互補堿基。以此對引物序列作為基礎，一側A直接用作靶特異序列引物；另一側B靶特異引物則置換成與A 引物序列70%同序的人為序列引物，也就是置換一側要合成兩條引物，一條合成B側靶特異引物并在其5’端前面再加上A側70%同序的人為序列作為靶特異的較長嵌合引物，使用1/5-1/20常規濃度(5μΜ)嵌合引物預擴增1-5個循環生成一端帶人為序列的二次(置換)模板；一條合成與A側70%同序的人為序列引物與A側靶特異序列引物進行常規PCR 擴增置換模板。嵌合引物中3’端靶特異序列選擇較另一側靶特異引物稍長一些，以便預擴增退火溫度能高6-8°C以上，使預擴增和置換擴增可以在同一試管中分步驟進行。雙鏈DNA 模板選擇那一側置換均可，主要由試驗決定，注意某些病源模板可能只是DNA正鏈或負鏈； 而RNA模板則最好選擇其反義鏈作為嵌合引物，以便于逆轉錄，嵌合引物逆轉錄cDNA鏈一個循環30-60分鐘后，常規PCR。引物置換多少同序比例及變異的位置需要根椐特異Ct值不明顯推后和本底Ct值在45左右之間取舍平衡。一側直接靶特異序列引物確定后，一般中間9-13個堿基作為“同序”不變，從其3’末端倒數第二三位堿基變成一或二個腺嘌呤堿基A和其5’端順數第一至第五個堿基一起變為嵌合引物3’最末端五個反向互補堿基的人為序列，將變異后的人為序列加在另一側靶特異序列引物5’端前面形成首尾互補的嵌合引物，嵌合接頭部位之間加上二三個腺嘌呤堿基A。之所以都變異為腺嘌呤A堿基是為了嵌合引物非特異性擴增二聚體產物氣霧膠含密度更高的dUTP，以便被UDG酶更有效降解。首尾互補的嵌合引物在室溫條件下會形成首尾雜交結合的類似鍋柄樣或分子燈塔(Molecular beacon)樣的莖環結構，不與其它引物或無關核酸非特異性反應，PCR熱變性啟動特異性雜交、擴增。變異約30%的同序人為序列合成置換引物，在嵌合引物預擴增生成帶同序人為序列的二次(置換)模板后， 與直接靶特異序列引物一起PCR擴增置換模板。如果中間同序堿基過長而干擾特異性擴增 Ct值，則可將同序堿基正中間一個堿基人為變異為腺嘌呤A以降低擴增置換模板兩端自身雜交幾率。一側同序置換引物公式以Xn代表一側直接靶特異引物一段堿基，中間&確定為應同序的堿基，則Yn代表另一側靶特異引物序列堿基，以xn、χτ、Yn代表任何A/G/C/T，A為腺嘌呤堿基。直接靶特異序列引物X :5’ -X1X2-X5Xt……)(τΧΑΧη_3’，嵌合引物Ys :5，-YnYn^1-Υη-5Χτ……XtAX^AAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，置換引物Sy :5，-YnYn^1-Υη-5Χτ……ΧτΑΧη_3，， Xa 變異為 Α。雙側同序置換引物設計適合多重PCR和等溫轉錄RNA擴增技術，近年一系列等溫(/恒溫)基因擴增技術也有了長足的發展。不像PCR反應那樣，需要經歷幾十個溫度變化的循環過程。等溫擴增反應的全過程均在單一溫度，無需專門的擴增儀器下進行，使得它們對所需儀器的要求大大簡化，檢測時間顯著縮短，因而適合于現場快檢或床邊檢測。其中轉錄RNA擴增技術又因 RNA和DNA雙重模板擴增而靈敏度極高，成為臨床應用檢測首選。轉錄介導的擴增方法(即轉錄 RNA 擴增技術)包括 TMA 和 NASBA，TMA (US Patent :5，766，849)是一種利用 AMV/M-MLV 逆轉錄酶和T7 RNA多聚酶2種酶的共同作用，在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應系統， 基本擴增原理為目標序列在逆轉錄酶作用下，以與T7啟動子嵌合的引物為引導進行逆轉錄，逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后，合成末端帶T7啟動子的雙鏈DNA， 并在T7 RNA多聚酶作用下，一個DNA分子轉錄出七百條目標RNA序列，部分RNA又可以作為模板進行下一個循環，整個反應是一個自催化過程。NASBA[US Patent :7,074, 558]的原理與TMA相似，但僅一條引物5’端加上T7啟動子序列，進而DNA僅一條鏈轉錄；在核酸提取和擴增產物及信號檢測方法上也有所不同。然而，等溫(/恒溫)基因擴增技術反應溫度一般明顯低于熱循環PCR反應，使一對過量、過長嵌合引物間雜交結合幾率顯著高于傳統PCR 反應的熱啟動情況，增加的引物二聚體非特異性指數擴增進一步被極高靈敏度的轉錄介導雙重擴增高效放大，極易產生假陽性。本發明“一種同序引物置換的核酸擴增技術”整合這兩種轉錄RNA擴增技術，選取一段靶最特異的序列片段，從中篩選出盡量連續反向互補的兩段數個堿基區，上游就以有義鏈為引物序列，其下游換成反義鏈引物序列后形成局部有連續數個同序堿基的一對高度同源引物，同時考慮引物對之間盡量少地有連續互補堿基。以此對引物序列作為基礎，將反義鏈引物5’端加上完整T7啟動子序列嵌合為逆轉錄引物；另一側有義鏈引物5’端加上 30%變異的T7啟動子序列，T7序列中間9-13個堿基作為“同序”不變，從其3’末端倒數第二三位堿基變成一或二個腺嘌呤堿基A和其5’端順數第一至第五個堿基一起變為有義鏈引物3’最末端五個反向互補堿基的人為序列，將變異后的T7序列加在有義鏈引物5’端形成首尾互補的嵌合引物，嵌合接頭部位之間加上二三個腺嘌呤堿基A。使用一對1/5-1/20 常規濃度(5μΜ)嵌合引物，其中嵌合逆轉錄引物逆轉合成5’端帶Τ7啟動子的cDNA，并在 Τ7 RNA多聚酶作用下，一條DNA轉錄出數百倍大量的靶RNA序列，部分RNA又可以作為模板進行下一個循環，逆轉錄成帶Τ7啟動子的cDNA和被有義鏈嵌合引物擴增合成二次模板 DNA，并由一對70%同序Τ7置換引物進行PCR擴增二次(置換)模板。如此進行雙重DNA 和RNA模板擴增高效放大。多重PCR是將多個靶基因和多套靶特異引物PCR系統放在一個反應管中同時擴增檢測的PCR技術，現存“多重PCR”方法不僅存在非平行的、不對稱競爭的擴增問題，難以進行較多靶基因并行擴增的“面”的系統檢測，最根本的還是極過量的多對靶特異引物混在一個PCR反應系統產生嚴重的引物聚合體非特異性擴增問題。為了解決多重PCR引物過多過雜，將多對靶特異引物5’端都加上同一對70%同序的功能序列合成系列多個嵌合引物，所有嵌合引物3’端一半是含各種多套靶特異引物序列，5’端一半均含同一對70%同序的功能序列，合成一對70%同序的人為功能序列作為多重置換引物。采用多對1/10-1/50常規濃度(5μΜ)嵌合引物預擴增或逆轉錄多重靶基因，產生兩端均帶同一對70%同序人為序列的多重置換靶模板，同一對常規濃度70%同序置換引物PCR擴增多重置換靶模板。如此一來，多對靶特異引物減少了過高濃度，最后一對高濃度擴增引物減少了過多種類，大大減少引物聚合體非特異性擴增。預先選擇多重靶模板大小，擴增產物就可以根據產物片段大小進行多重PCR檢測。采用STOR Green I實時熒光PCR并結合熔解曲線分析，根據產物片段不同大小及結構有不同Tm值，可進行3-4重多重PCR檢測；采用多重PCR加產物瓊脂糖凝膠電泳檢測方法可進行4-5重多重PCR檢測；采用多重熒光標記TaqMan實時熒光PCR目前可進行5-6重多重PCR檢測；采用多重PCR結合固相探針雜交可進行50-100重多重PCR 檢測；采用多重PCR結合編碼微球液態檢測芯片Luminex技術論上可達140重多重檢測。 但多重PCR —般僅能同時進行50重內的多重反應。等溫轉錄RNA擴增技術也可以采用本發明進行同序引物置換多重擴增檢測。雙側同序置換引物公式以代表一側直接靶特異引物序列堿基，則Yh代表另一側靶特異引物序列堿基，S1^n為一對70%同序的功能序列堿基，A為腺嘌呤堿基。一側嵌合引物 Is :5，-Sr.. &……Sn_1Sn+AAX1X2……XlriXnI'，一側置換引物 & :5，-S1-S6……SmSn-3，，另一側嵌合引物Ys :5，-Yny^1- yn_5S6……Sn-ASjAAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，另一側置換引物Sy :5，Inylri…yn_5S6……SnJVSn_3，， Slri 變異為 A。本發明同序引物置換擴增技術還可應用于報告基因置換的多重擴增檢測。截止目前，所有PCR技術及各種改進方法均是直接擴增兩端已知序列之間的一段大于IOObp DNA 的直接PCR，即檢測A基因就擴增A基因整個片段，特異性是由兩端引物序列來決定的。對于許多不需要拿到全長基因序列的臨床檢驗、食品安檢等應用檢測來說，除引物序列外的長長中間序列部分是沒有起特異作用的。而其它一般核酸檢測方法如核酸探針雜交檢測技術采用同位素、熒光等標記的短核酸Oligo與靶基因特異序列雜交都只需一段20至30kiSe長的序列即可；但是，雜交探針信號相加的靈敏度遠遠低于PCR的指數式擴增。本發明采用報告基因置換的PCR途徑是只選擇一小段靶基因特異序列G0-60bp長)，通過靶特異序列雜交置換成帶小段靶序列的與靶不同源的100_300bp報告序列(種系最遠的保守序列)，再擴增報告序列，間接指示靶基因的間接PCR。類似于同序引物雙側置換PCR，將一小段靶基因特異序列分成類似上游引物和下游引物的左右兩部分，左半以有義鏈為上游探針，右半以反義鏈為下游探針，以此對探針序列作為基礎，將一側探針5’端加上完整功能或短稀有序列作為嵌合探針/引物；另一側探針5’端前面加上一段長無關序列和30%變異的功能或稀有序列作為嵌合報告序列，嵌合報告序列是一端含靶特異探針和另一端含30%變異的功能或稀有序列的一段60-250bp靶特異性無關的雙鏈DNA，由擴增無關DNA引物外側加上靶特異探針和功能序列而擴增制得。使用一對1/5-1/20常規濃度(5μΜ)短嵌合探針和嵌合報告長DNA預擴增或逆轉錄獲得二次全長報告模板，再常規PCR擴增二次報告模板來間接指示靶基因。一對短嵌合探針和5’端磷酸化的嵌合報告長DNA與特異性靶基因雜交后經連接酶/耐熱連接酶連接嵌合探針與嵌合報告DNA之間缺口，形成/置換成二次完整報告模板，再常規PCR擴增二次報告模板來間接指示靶基因。不論多重靶基因大小均可置換成相應多個不同人為設計大小的報告DNA，進行常規多重PCR結合產物瓊脂糖凝膠電泳檢測方法作不同大小報告DNA多重檢測；或結合固相報告探針(逐漸大一點的報告序列)雜交作多重報告探針雜交檢測。不足的是此方法不能適用熒光染料STOR Green I等實時熒光PCR。但對降解的陳舊性標本法醫痕跡檢驗，深熟加工的食品成份或污染物痕量檢驗，及非平行的、不對稱競爭的多重擴增等高通量多重檢測尤其獨特有效。本發明同序引物置換的核酸擴增實驗操作，與一般常規PCR基本一樣，標本核酸提取純化，采用常規方法制備，沒有特殊要求。樣本DNA提取制備方法包括煮沸法，PEG沉淀法，酒精沉淀法，堿裂解法，旦白酶K消化法，酚氯仿抽提法，離心結合柱法，及磁微珠結合法。樣本總RNA提取制備一般采用異硫氰酸胍一步法或Trizol試劑快速抽提，一般不用純化mRNA，必要時采用PolyA纖維素或磁微珠固相法純化。反轉錄(RT)即可分步反應，亦可與PCR —步反應。快速檢測選擇一步RT-PCR單管反應，單管加入兩種不同的酶，即用于 RT的反轉錄酶(如AMV或M-MLV突變體、Superscript ΙΙ/Supei^cript反轉錄酶等)，常規 PCR時DNA聚合酶沒有限制，用于實時PCR采用熱穩定DNA聚合酶(如Taq、Taq Plus等)。 熱穩定DNA聚合酶活性在反轉錄過程中被其抗體所抑制，進入PCR過程的高溫變性使反轉錄酶失活，同時也使熱穩定DNA聚合酶抑制抗體失活，使擴增反應順利進行。還有一種策略是使用既具有反轉錄酶活性，又具有DNA聚合酶活性的Tth耐熱聚合酶。本發明同序引物置換的核酸擴增PCR反應體系的底物和聚合酶及相應的緩沖液 buffer和Mg2+離子濃度與一般普通PCR反應體系通用。底物dNTP采用dUTP代替dTTP為防止產物氣霧膠交叉污染(被UNG酶解)，對IOObp短模板擴增dNTP量可減少一半加樣。 再輔助以礦物油封閉下的一側引物緩釋熱啟動，將直接靶特異序列引物(5μΜ)用20%葡聚糖(Dextran)稀釋2_4倍后最先加到PCR管底(相應多加2_4倍體積)作為緩釋引物， 引物借助葡聚糖粘性和高比重沉于管底使后加的PCR反應液及濺到封閉礦物油表面上的液體因缺失成份而不能擴增，變性94°C使反應液自混勻后熱啟動PCR。緩釋引物還可加入終濃度10% -20%的近納米級殼聚糖(Chitosan)微珠(< 3(^111或> 400目顆粒，便于用微量加樣頭吸取)，殼聚糖微珠表面正電荷常溫下吸附引物而高溫完全解吸熱啟動，微珠結合引物如因加樣/礦物油時濺出至液面管壁上的殘留顆粒可快速離心沉底，提升緩釋高可靠性。另一側嵌合引物有熱啟動尾結構，和置換引物直接加入PCR反應混合液。由于普通PCR緩沖液K+離子允許變化的范圍太窄，本發明選用一創新的10XPCR buffer 含 0.6M Tris-Cl (pH8. 2) ,0. IM KCl, 50mM(NH4)2S04, 20mM MgCl 禾口 0· 5% (v/v) Tween20 (或 1 % Triton X-100)可承受更強離子等雜質的干擾和具有更高擴增效率。然后配制不含模板的 PCR反應液加到PCR試管底部的緩釋引物上面隔開一點距離的管壁上，隨后加對照或模板樣本DNA/RNA到PCR試管再退上一點的管壁上，最后加反應液等體積的礦物油(又稱石蠟油)到PCR試管口附近的管壁上，短速離心沉降液體，注意加完所有試劑后切記不要混勻No Vortex ！以免破壞引物緩釋層，導致混勻反應液擴增泄漏。由于本發明同序引物置換PCR對部分模板特異性擴增Ct值準確性有干擾，使定量標準曲線的線性不好，精確定量有誤差。PCR反應液采用終濃度-1.2% (v/v)DMF增強劑(預加入嵌合引物)顯著增加擴增Ct值1-5個循環數，標準曲線的線性關系明顯改善。 但DMF等PCR增強劑缺乏特異性，對靶模板特異Ct值與引物二聚體本底Ct值平行促進擴增，必須在靶特異性靈敏度與引物二聚體本底之間小心取舍平衡。由于本發明長嵌合引物中間預設了高密度連續的多個脫氧腺嘌呤dA堿基，合成的引物二聚體中間產生高密度的 dU堿基，PCR反應液(Taq酶中預加入1/10的UNG)預防性在PCR反應前UNG50°C預處理2 分鐘消化可能的氣霧膠污染，加上PCR引物緩釋熱啟動，加礦物油與螺蓋或反扣蓋PCR管多重封閉沒有氣霧膠產生或僅沒有擴增的氣霧膠，萬一可能的產物泄露又進一步被UNG有效酶解，多重保證不產生假陽性非特異性反應，使核酸擴增檢測絕對可靠。實時熒光PCR單個反應混合液
置換弓丨物S (5 μ M)0.5 μ 1
嵌合引物SY1G μ Μ)0.5 μ 1
IOmMdNTP0.5 μ 1
IOXPCRbuffer2.5 μ 1
Taq0.5-1 μ 1
SYBR Green 1(20Χ)1.0 μ 1
dH20_13 μ 1
19 μ 1實際操作時，首先配制不加模板的100次X 19 μ 1 = 1. 9ml反應混合液，既每個成份加100倍單個反應體積，混勻，平行分裝96 X 19 μ 1于96孔板或0. 2ml的PCR反應管，每孔或每管再分別加4 μ 1標本DNA/RNA或模擬標準品。每個檢測可平行2_3份X 25 μ 1計平均Ct值。質粒模擬標準曲線:1μ g/ml X ΚΓ1，X 1(Γ2，X 1(Γ3，X 1(Γ4，X 1(Γ5，X 1(Γ6，X 1(Γ7 稀釋。每個反應管小心加入與反應液等體積的礦物油短速離心沉降、封閉反應液，上實時熒光 PCR 儀(西安天隆公司 TL988、TL988-II 型和 MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。首先預反應50°C 2分鐘94°C 2分鐘，然后45個循環94°C 20秒，M_57°C 30秒，72_74°C 30秒。于72-74°C讀取熒光值。本發明的優點在于(1)適合臨床分子診斷，基本上可以通過引物設計來控制不產生假陽性結果，特別適用于傳染性疾病的核酸檢測及準確診斷。(2)尤其適合多重PCR擴增技術，本發明幾乎就是為多重PCR擴增技術量身定做的，多重PCR擴增技術過多過雜的引物只能采用本發明引物置換設計來消除引物聚合體非特異擴增。
圖1.為沒加DNA模板，僅含各種引物的熒光PCR系統擴增本底Ct值。按一般引物設計原則優選的HBV含部分同序引物本底Ct值在33-34左右，一對引物加探針的本底Ct 值前移至25個循環左右。本發明同序置換引物本底Ct值一般在45-50循環之后，而任意多數引物加單一引物自身雙倍量本底均為一條直線，無Ct值。圖2.為采用一對普通引物設計原則優化的HBV引物實時熒光PCR作10倍稀釋模板的標準定量曲線，最左邊第一條擴增曲線為0. 1 μ g/ml模板約IO8拷貝，隨之10倍稀釋， 最后一條擴增曲線為沒有模板的本底對照，結果本底對照Ct值30循環與IO1-IO3拷貝分不開，全重疊在一起，檢測不準和假陽性。圖3.為已知定量的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原質粒對照pUC-HBcorel μ g/ml 約IO9拷貝，作10倍稀釋模板的標準定量曲線，最左邊第一條擴增曲線為0. 1 μ g/ml模板約IO8拷貝，隨之作10倍稀釋，最后一條擴增曲線為沒有模板的本底對照，結果本底對照Ct 值在43-45循環有一點上升，在PCR循環內幾乎沒有擴增Ct值。標準定量曲線梯度分布接近普通熒光PCR，尤其低拷貝梯度拉得開，拷貝數10倍梯度稀釋可以準確測定。多次重復性非常好。圖4.為EV總致病珠與71亞型二重實時熒光PCR分析，兩套PCR系統共一質粒模板單管反應，雙份擴增仍得到較好的梯度。圖5.為EV總與EV71型二重實時熒光PCR熔解曲線，EV總Tm值為87°C與EV71Tm 為90. 6°C，二者可以明顯區分鑒定，并與引物二聚體Tm值為78°C間隔較遠，不會誤讀。
具體實施例以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、條件、步驟及應用所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。實例一人乙型肝炎病毒同序引物置換熒光PCR檢測乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)由乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)引起的一種世界性的傳染性疾病。在我國人群中乙肝感染率非常高，極大的危害了人們的身體健康。目前乙肝的檢測方法主要有酶免疫法、放免法、化學發光法、免疫熒光法、核酸擴增 (PCR)熒光定量法等。酶免疫法應用較廣，但是實時熒光PCR分析法可以精確測定乙型肝炎病人的病毒基因，對感染者病毒復制水平的判斷，病情傳染性及抗病毒藥物療效監測具有無法替代的重要作用。
乙型肝炎病毒(HBV)為部分雙鏈DNA病毒，主要有三段種型特異保守區，分別位于表面抗原HBsAg區，X區和核心Core區，大部分HBV實時熒光PCR研究集中選擇核心Core 區和表面抗原HBsAg區。HBV核心Core區有正負雙鏈DNA，表面抗原HBsAg區僅含負鏈DNA 單鏈，且大量二級結構亦集中于此區域，影響PCR擴增效率。比較大多數發表的核心Core區 PCR引物序列，仍存在一些明顯的引物間形成二聚體堿基互補序列，甚至不符合一般引物設計通用原則，試用PCR實際引物二聚體大都在Ct值30循環處。本發明精選乙型肝炎病毒(HBV)核心Core區(CDR =2306-2444) 一段序列作為HBV 同序引物置換的核酸擴增靶特異序列，展示兩端各20堿基Core區(nt =2306-2444)序列如下AB540584 Core 區(nt :2306-2444)CAAATGCCCC TATCTTATCA AC------GCAGAAGATCTCAATCTCHBV同序引物置換熒光PCR引物設計根椐本發明一側同序置換引物設計方案及對照其公式，直接靶特異序列引物X :5，-X1X2-X5Xt……)CTXAXn_3，，嵌合引物Ys :5，-YnYn^1-Υη-5Χτ……XtAX^AAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，置換引物Sy :5，-ynynyyn-5)(T……XTAXn-3，，Xa 變異為 A。HBVc同序置換引物序列如下HBVcFs :5，-Rtt Ra att gag ate ttc aac aaa tgc ccc tat ctt ate aac~3'HBVcSf 5' -gt tga att gag ate ttcaac-3，HBVcR :5，-gag att gag ate ttc tgc_3，其中F代表上游引物序列，Fs就為上游嵌合引物；R代表下游直接靶特異引物，粗體代表同序堿基，下劃線為嵌合引物兩末端自雜交序列。另一套替補嵌合引物及置換引物如下其大寫斜體J為同序太長而人為引進一變異堿基，2HBVcF。5，-gtt gat tga A ate ttc t aa caa atg ccc ct a tct t at caac~3'2HBVcSf 5' -gtt gat tga A ate ttc t aa c_3，另以臨床檢驗的已知HBV陽性標本血清煮沸法上清為模板，選定全長Core區 (1900-2450)片段兩側序列合成帶酶切位點引物擴增模板450bp片段，將該片段酶切并克隆至pUC19載體作為乙肝模擬陽性對照DNA。(1)采用一步煮沸法取50μ1血清加50μ1的2X煮沸緩沖液(室溫存放，用前充分混勻微珠)，輕混，置沸水浴5分鐘，經4°C短暫預冷后高速離心5分鐘，取上清加樣 4μ 1。弱陽性標本采用PEG沉淀HBV濃縮，取血清500 μ 1加500 μ 1 PEG液，Vortex混勻，高速離心10分鐘，棄上清，沉淀加25 μ 1 dH20混勻后加25μ 1的2Χ煮沸緩沖液，余同上煮沸法，加樣4μ1。但PEG沉淀回收率平均為60%，定量檢測必須計算損失。2X 煮沸緩沖液0. IM Tris, 2 % NP40，0. 01 % SDS,50mM KoAc 及 8 % Chelax-100(400mesh)。(2)實時熒光PCR反應
首先制備緩釋引物，將漂洗好的殼聚糖粉沫溶于2N鹽酸HCl數小時至過夜，完全溶解后，最快速倒入正快速磁力攪拌的含大體積等當量的氫氧化鈉NaOH燒杯中，殼聚糖再凝聚成數微米至二十微米的微顆粒，反復用中性Tris-Glycine緩沖液離心漂洗。HBVcR引物先溶于純化水至100 μ M貯存液，用20%匍聚糖稀釋成5 μ M應用液，濃度5 μ M引物與等體積的20% -40% (ν/ν)殼聚糖微顆粒混勻生成2. 5 μ Μ，或再與等體積的20%匍聚糖混合形成稀四倍緩釋HBVcR。用前搖一搖！以免長時間存放顆粒沉淀致引物不均勻。每個PCR 反應管加2 μ 1稀四倍緩釋HBVcR至管底。按以下配方比例，
權利要求
1.一種同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，其步驟包括⑴在靶特異引物5’ 上游連接人工序列，形成嵌合引物；( 以所述嵌合引物擴增靶模板產生兩端帶人工序列的二次模板；(3)用65% -75%同序的人工序列作為置換引物擴增二次模板。
2.按照權利要求1所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，其為單側靶特異引物置換的核酸擴增技術，其置換引物設計公式以Xn代表一側直接靶特異引物一段堿基，中間&確定為應同序的堿基，則Yn代表另一側靶特異引物序列堿基，以Xn、XT、Yn代表任何A/G/C/T，A為腺嘌呤堿基；直接靶特異序列引物X :5’ -XJ^X5Xt……)CTxAXAXn-3’，嵌合引物Ys :5，-ynyn_r·· yn_5XT……Xt(A)AX^AAY1Y2……YlriYnI'，小寫y代表Y互補堿基，置換引物 Sy :5，-ynyn-r"yn-5XT……XT(A)AXn-3',、變異為 A。置換引物嵌合引物均按2-20 1預先配好。
3.按照權利要求1所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，其為雙側靶特異引物置換的核酸擴增方法，其多重靶引物低濃度而過量擴增引物單一化策略，特別適合多重PCR檢測。其置換引物設計公式以代表一側直接靶特異引物序列堿基，則Yh代表另一側靶特異引物序列堿基，S1^n為一對70%同序的功能序列堿基，A為腺嘌呤堿基。一側嵌合引物 I :5，……SlriSJAAX1X2……ΧπΧη-3，，一側置換引物St :5，……SlriSnI',另一側嵌合引物Ys:5，-YnYn-!- yn-5S6……Sn_ASn+AAY1Y2……YlriYnI'，小寫 y 代表 Y 互補堿基，另一側置換引物Sy :5’ -Yny^1- yn_5S6……SnAS-3',Slri變異為A。置換引物嵌合引物均按5-50 1預先配好。
4.按照權利要求1所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，所述擴增反應體系加入PCR增強劑-2%二甲基甲酰胺DMF。
5.按照權利要求1所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，所述嵌合引物嵌合結頭處盡可能地引入脫氧腺嘌呤dA堿基，以使嵌合引物聚合體非特異性擴增產物含盡可能多、密度更集中的dUTP堿基。
6.按照權利要求1所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，所述嵌合引物兩端首尾預先設計有4-6kiSe堿基互補，所述首尾互補的嵌合引物在室溫條件下形成首尾自雜交結合的類似鍋柄樣或分子燈塔樣的莖環結構。
7.一種同序引物置換的核酸擴增基因檢測試劑盒，其特征在于，所述盒成份包括核酸提取試劑，dNTPs,DNA聚合酶及其緩沖液，逆轉錄酶及其緩沖液，上游引物F/下游引物R， 標準對照物，純化水dH20和礦物油。
8.—種核酸擴增技術，其特征在于，其一端引物采用緩釋熱啟動，所述引物緩釋熱啟動是將引物預先吸附于引物緩釋劑。
9.按照權利要求8所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，所述引物緩釋劑為20%葡聚糖溶液、天然粘膠、弱陰性離子交換樹脂、表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質、弱陰性離子纖維素或人工合成的低聚堿基微球。
10.按照權利要求9所述的同序引物置換的核酸擴增技術，其特征在于，所述表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質為殼聚糖。
全文摘要
本發明提供的一種同序引物置換的核酸擴增技術，其步驟包括(1)在靶特異引物5’上游連接人工序列，形成嵌合引物；(2)以所述嵌合引物擴增靶模板產生兩端帶人工序列的二次模板；(3)用65％-75％同序的人工序列作為置換引物擴增二次模板。本發明適合臨床分子診斷，基本上可以通過引物設計來控制不產生假陽性結果，特別適用于傳染性疾病的核酸檢測及準確診斷。尤其適合多重PCR擴增技術，本發明幾乎就是為多重PCR擴增技術量身定做的，多重PCR擴增技術過多過雜的引物只能采用本發明引物置換設計來消除引物聚合體非特異擴增。
文檔編號C12Q1/68GK102352350SQ20111029730
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者岳素文, 曲越, 江必勝, 江洪, 阮志強 申請人:北京萬達因生物醫學技術有限責任公司