專利名稱：柑桔衰退病毒的rt-lamp快速檢測方法
技術領域：
本發明屬于農業科學生物技術應用領域，涉及一種檢測柑桔衰退病毒RT-LAMP檢測技術和依據該技術建立的試劑盒。
背景技術：
柑桔衰退病毒(CTV)引起的柑桔衰退病是柑桔主要病害之一，嚴重危害著柑桔產業。CTV檢測是病毒防治、流行趨勢研究、柑桔無病毒苗木鑒定、弱毒株系篩選等的重要前提和環節。現有技術中，依據病癥誤判率較高、血清學技術靈敏度低、反轉錄聚合酶鏈鎖擴增 (RT-PCR)檢測技術操作復雜用時長，費用高，且需要昂貴的PCR儀器等缺點。LAMP技術的全稱是環介導恒溫擴增技術(loop-mediatedi sothermal amplification) 0由日本學者Notomi等發明的一種新型的基因擴增技術。但是，目前尚沒有將RT-LAMP技術應用在柑桔衰退病毒(CTV)的檢測上。
發明內容
針對現有技術中，柑桔衰退病毒常用檢測技術中酶聯免疫檢測技術靈敏度低、逆轉錄和巢式PCR技術操作復雜、用時長等問題，本發明的目的是提供一種操作簡單、成本低，用時少、特異性強、靈敏度高的柑桔衰退病毒的RT-LAMP檢測方法。實現上述目的，本發明采用的技術方案是一種柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于根據CTV的保守序列設計RT-LAMP檢測的特異性引物2對一對外引物F3、B3和一對內引物FIP、BIP，4條引物序列如下所示；利用特異性引物，在63 65°C條件下恒溫反應45 60分鐘，利用電泳檢測或熒光染料技術鑒定出待測樣品中是否含有柑桔衰退病毒。利用該方法建立的試劑盒，包含有LAMP反應液和LAMP特異引物的混合液構成的檢測體系。該試劑盒可快速、靈敏、特異地檢測出柑桔衰退病毒。CTV保守序列以及根據該序列設計的引物F3、B3、FIP、BIP如下所示
權利要求
1.一種柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于根據CTV的保守序列設計RT-LAMP檢測的特異性引物2對一對外引物F3、B3和一對內引物FIP、BIP，4條引物序列如下所示；利用特異性引物，在63 65°C條件下恒溫反應45 60分鐘，利用電泳檢測或熒光染料技術鑒定出待測樣品中是否含有柑桔衰退病毒；利用該方法建立的試劑盒，包含有LAMP反應液和LAMP特異引物的混合液構成的檢測體系；CTV保守序列以及根據該序列設計的引物F3、B3、FIP、BIP如下所示
2.根據權利要求1所述檢測柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速檢測方法，包括如下步驟1)提取待測樣品總RNA核酸作為反應模板；2)配制RT-LAMP反應溶液按總反應體積25μ 1為例，擴增體系分別加入5 μ 1溶液 1 (5 X反應緩沖液)，5 μ 1溶液2 (引物混合液)，14 μ 1溶液3 (超純水)；3)取步驟1)提取的樣品總RNA1 μ 1加入到步驟2)配制的RT-LAMP反應液中，混合；4)在63°C恒溫水浴中反應45-60分鐘；5)結果診斷將步驟4)擴增反應后產物進行判斷，呈陽性的表示樣本含有柑桔衰退病毒，呈陰性的表示樣品不含有柑桔衰退病毒。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，公開了一種柑桔衰退病毒的環介導逆轉錄等溫擴增(RT-LAMP)檢測方法。應用環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)，根據GenBank公布的柑桔衰退病毒(CTV)不同株系的基因序列，針對病毒序列保守區域設計了CTV的RT-LAMP檢測方法的特異性引物4條，其序列為，F3CGAAGTGGATTTGTCTGACA；B3GGAATCCCTGCATCTAGCG；FIPACTCGAAGGGCGTTAGTACGGCTTTGGACTGACGTCGTGTT；BIPCTGGGGTAGGACTAACGATGCCGACGTCCGCCATAACTCAA。4條引物分別完全與識別的靶序列中6個區序列匹配。實驗結果表明靈敏度比普通逆轉錄-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)高100倍，對病毒早期診斷準確性更高。本發明與RT-PCR方法檢測結果一致，比DTBIA方法靈敏、準確。本發明方法可快速、準確、靈敏地檢測柑桔衰退病毒，適合樣品快速檢測、CTV流行監控、脫毒苗木鑒定和衰退病毒的鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK102296128SQ20111030077
公開日2011年12月28日 申請日期2011年10月8日 優先權日2011年10月8日
發明者周常勇, 周彥, 唐科志, 李中安, 王永江, 蘇華南, 黃愛軍 申請人:中國農業科學院柑桔研究所