蛙皰疹病毒1型的lamp快速檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法及試劑盒，屬于農業科學生物技術應用領域。所述快速檢測方法，包括下述步驟：(1)提取待測樣本總的DNA核酸作為反應模板；(2)配置LAMP反應溶液，其中LAMP反應溶液由下列體積比的組分組成，Bst DNA聚合酶:水霉菌:滅菌水:2×反應緩沖液:引物混合物＝1:2:8.6:12.5:0.9；(3)將步驟(1)提取的樣本總DNA加入到步驟(2)配制的LAMP反應溶液中，混合；(4)在60℃恒溫水浴中反應30分鐘；(5)診斷結果：將步驟(4)擴增反應后產物用電泳檢測或熒光染料技術進行鑒定。本方法具有操作簡單、低成本，反應快速、特異性強、靈敏度高的優點，且用時短，靈敏度比普通PCR高100倍，對壺菌早期診斷準確性更高的特點。
【專利說明】蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業科學生物技術應用領域，具體涉及娃皰疫病毒1型的LAMP快速檢 測方法以及與該方法配套實用的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 皰疹病毒在哺乳類、鳥類、爬行類等多種動物中均有發現，并且均可導致嚴重的傳 染病。根據宿主種類的不同，可將皰疹病毒分為三組：感染哺乳類、鳥類和爬行類的；感染 兩棲類和硬骨魚類的以及單獨一類可感染無脊椎動物中的雙殼綱動物的。這其中，能感染 兩棲動物的兩類分別為娃皰疫病毒1型（RaHV-I ;又稱盧克皰疫病毒）和娃皰疫病毒2型 (RaHV-2 ;又稱蛙病毒4)。
[0003] 蛙皰疹病毒1型首次發現于南美豹蛙（Rana pipiens)的一種腎腺癌（即盧克 腫瘤）組織中，經研究發現該病毒即為這種腎腺癌的病原體，蛙皰疹病毒1型具有非常獨 特的溫度依賴機制：低溫條件會促進其進行復制，但會抑制其轉移和擴散。蛙皰疹病毒1 型的DNA大小約為220kbp左右，經序列比對后證明其與海水鯰魚皰疹病毒（Ictalurid herpesvirus 1，IcHV-I)親緣關系較為相近。由于盧克腫瘤在野生豹娃中的發生頻率非常 高,對野生豹蛙的種群數量產生了非常嚴重的危害，因此,進一步研究蛙皰疹病毒的生物學 特性并開發出簡便、快速的檢測手段對于保護和避免野生蛙類受到該病害威脅具有重要作 用。
【發明內容】
[0004] 環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種 新型核酸擴增技術，由日本學者Notomi等發明的一種新型的基因擴增技術，相較于傳統的 PCR技術，具有操作簡便，特異性強，結果易觀察等特點。
[0005] 本發明利用LAMP技術，首次開發出針對蛙皰疹病毒的LAMP快速檢測方法，對及時 發現和診斷出蛙的盧克腫瘤具有重要意義。
[0006] 本發明的目的在于公開了蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法。
[0007] 本發明的第二個目的在于公開了用于蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法的試劑 盒。
[0008] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] 蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法，包括下述步驟：
[0010] (1)、提取待測樣本總DNA作為反應模板；
[0011] (2)、配置LAMP反應溶液，其中LAMP反應溶液由Bst DNA聚合酶、水霉菌、滅菌水、 2X反應緩沖液和引物混合物組成，體積比為：
[0012] Bst DNA聚合酶：水霉菌：滅菌水：2X反應緩沖液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ；
[0013] (3)、將步驟（1)提取的樣本總DNA加入到步驟⑵配制的LAMP反應溶液中，混 合；
[0014] (4)、在60°C恒溫水浴中反應30分鐘；
[0015] (5)、診斷結果：將步驟（4)擴增反應后產物用電泳檢測或熒光染料技術進行鑒 定，呈陽性的表不樣本含有娃皰疫病毒1型，呈陰性的表不樣本不含有娃皰疫病毒1型。
[0016] 上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟（2)中的 2X反應緩沖液由900 μ L 2XLAMP反應緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP混合液組 成；其中 2XLAMP 反應緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl I. 49g，MgSO4L 93g， (順4)25042.648，了￥661120211^和86七31116 187.48;其中10(^1^的(1階13混合液由25 4 1^^丁？、 25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0017] 所述引物混合物由20μ L FIP、20y L ΒΙΡ、2· 5μ L F3和2· 5μ L Β3組成，其中 FIP、BIP、F3和Β3的濃度均為100 μ M ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物Β3序列如 SEQNo. 3所示，內引物FIP序列如SEQ No. 4所示和內引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
[0018] 上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟（3)中樣本 總DNA與LAMP反應溶液之間的體積比為1:25。
[0019] 上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟（5)中電泳 檢測的過程為：取產物5 μ L進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V，20min ;電泳圖 出現條帶的為陽性，沒有出現條帶的為陰性。
[0020] 上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟（5)中的熒 光染料技術鑒定過程為：在步驟（2)配置的LAMP反應溶液中加入染色劑，反應后在紫外燈 下呈現綠色為陽性，不呈現綠色的為陰性。
[0021] 上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，所述染色劑為FD， 染色劑與步驟（2)配置的LAMP反應溶液的體積比為0. 2:25。
[0022] 用于上述技術方案中任一技術方案所述的蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法 的試劑盒，其中：所述試劑盒由Bst DNA聚合酶、水霉菌、滅菌水、2X反應緩沖液和引物混 合物組成，體積比為：
[0023] Bst DNA聚合酶：水霉菌：滅菌水：2X反應緩沖液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ；
[0024] 所述2 X反應緩沖液由900 μ L 2 X LAMP反應緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP 混合液組成；其中2XLAMP反應緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g， MgSO4L 93g，（NH4)2S042. 64g，Tween202mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液 由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0025] 所述引物混合物由20μ L FIP、20y L ΒΙΡ、2· 5μ L F3和2· 5μ L Β3組成，其中 FIP、BIP、F3和Β3的濃度均為100 μ M ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物Β3序列如 SEQNo. 3所示，內引物FIP序列如SEQ No. 4所示和內引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
[0026] 本發明操作步驟中的步驟（1)中待測樣本總DNA提取的操作按照TIANGEN組織 DNA提取試劑盒說明書進行操作。
[0027] 本發明具有以下有益效果：
[0028] 1、本發明根據GenBank公布的蛙皰疹病毒1型標準株一 NC_008211. 1的基因序列， 針對序列保守區域設計了蛙皰疹病毒1型的LAMP檢測方法的特異性引物2對，一對外引物 F3、B3和一對內引物FIP、BIP，4條引物序列分別如SEQ No. 2?No. 5所示。以提取樣本總 DNA為模板，建立了快速檢測蛙皰疹病毒1型的LAMP技術。
[0029] 2、本發明LAMP檢測技術利用特異引物（4條），以識別蛙皰疹病毒1型靶基因的幾 個特定區域，特異性更強。反應在等溫（60°C )條件下進行，不需要循環儀等昂貴的儀器，擴 增反應極快，一般30分鐘完成，擴增產物量大，利用電泳檢測或熒光染料技術鑒定出待測 樣本是否含有蛙皰疹病毒1型；靈敏度高、特異性強，適合蛙皰疹病毒1型的快速準確檢測。
[0030] 3、本發明LAMP技術不需要單獨反轉錄過程和巢式PCR的二次擴增，減少分子檢測 的一些環節，降低了檢測的污染率；且實驗證明檢測靈敏度比PCR高100倍，使用本發明的 方法對蛙盧克腫瘤的早期診斷更準確。
[0031] 4、本方法具有操作簡單、低成本，反應快速、特異性強、靈敏度高的優點，且用時 短，靈敏度比普通逆轉錄-聚合酶鏈鎖反應（PCR)高100倍，對蛙皰疹病毒1型早期診斷準 確性更高。可廣泛用于樣本快速檢測、流行監控。
[0032] 5、本發明還根據檢測方法相應地建立了檢測試劑盒，本發明方法和試劑盒可快 速、準確、靈敏地檢測蛙皰疹病毒1型，適合樣本快速檢測、蛙皰疹病毒1型流行監控等。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0033] 1、圖1為實施例1中LAMP快速檢測方法所用試劑盒對蛙皰疹病毒1型檢測的電 泳圖。
[0034] 2、圖2為蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的引物特異性檢測電 泳圖。
[0035] 3、圖3為蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗電泳圖。
[0036] 4、圖4為蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗熒光顯 示圖。
【具體實施方式】：
[0037] 為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明蛙皰疹病毒1型 的LAMP快速檢測方法及試劑盒作進一步的說明。
[0038] 本發明提供一種蛙皰疹病毒1型的快速檢測方法。根據GenBank公布的蛙皰疹病 毒1型標準株 NC_008211. 1的基因序列，針對保守區域的序列（序列如SEQ No. 1所不） 設計了蛙皰疹病毒1型的LAMP檢測方法的4條特異性引物分別為外引物F3(序列如SEQ No. 2所示）、外引物B3(序列如SEQ No. 3所示）、內引物FIP (序列如SEQ No. 4所示）和內 弓丨物BIP(序列如SEQ No. 5所示），以蛙皰疹病毒1型標準株--NC_008211. 1為模板，建 立了檢測所有蛙皰疹病毒1型的LAMP方法。然后依據電泳圖譜診斷。
[0039] 以下實施例中涉及的各種真菌均可從市場直接購買。
[0040] 實施例1 :蛙皰疹病毒1型的LAMP方法檢測：
[0041] 本實施例中待測樣本中的陽性樣本即蛙皰疹病毒1型由東北林業大學保護醫學 與生態安全研究中心保存也可以從市場購買獲得，陰性樣本為純水。
[0042] 具體的檢測方法步驟為：
[0043] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟提取陽性樣本和陰性樣本的 總DNA核酸作為反應模板；
[0044] (2)、配置LAMP反應溶液：按總反應體積25 μ L為例，擴增體系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L滅菌水、12. 5 μ L 2Χ反應緩沖液和0. 9 μ L引物混合物組成；
[0045] 其中2 X反應緩沖液由900 μ L 2 X LAMP反應緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP 混合液組成；其中2XLAMP反應緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g， MgSO4L 93g，（NH4)2S042. 64g，Tween202mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液 由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0046] 所述引物混合物由 20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3 和 2.5yL Β3 組成，其中 FIP、 BIP、F3和B3的濃度均為100 μ M ;
[0047] (3)、取步驟（1)提取的樣本總DNA 1 μ L加入到步驟⑵配制的25 μ L LAMP反應 溶液中，混合；
[0048] (4)、在60°C恒溫水浴中反應30分鐘；
[0049] (5)、診斷結果：取產物5 μ L進行2. 0 %核酸瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V， 20min ;電泳圖出現條帶的為陽性，沒有出現條帶的為陰性。
[0050] 凝膠電泳圖如圖1所示，其中泳道1、2和3為待測樣本，結果為陽性；泳道4為陰 性對照，結果為陰性。
[0051] 實施例2 :蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的特異性實驗：
[0052] 本實施例中的引物和操作步驟與實施例1完全相同。
[0053] 用實施例1的引物和操作步驟在虹彩病毒基因組、偽狂犬病毒基因組、蛙皰疹病 毒1型基因組、毛霉菌基因組、壺菌基因組、水霉菌基因組、青霉菌基因組、酵母菌基因組、 豬細小病毒共9個樣本檢測皰疹病毒LAMP的特異性，陰性樣本為純水。
[0054] 具體的檢測方法為：
[0055] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟分別提取虹彩病毒基因組、 偽狂犬病毒基因組、蛙皰疹病毒1型基因組、毛霉菌基因組、壺菌基因組、水霉菌基因組、青 霉菌基因組、酵母菌基因組、豬細小病毒和純水的總DNA作為反應模板；
[0056] (2)、配置LAMP反應溶液：按總反應體積25 μ L為例，擴增體系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L滅菌水、12. 5 μ L 2Χ反應緩沖液和0. 9 μ L引物混合物5 μ L溶 液1、5 μ L溶液2和15 μ L溶液3組成；
[0057] 其中溶液1為2Χ反應緩沖液，所述2Χ反應緩沖液由900yL 2XLAMP反應 緩沖液和IOOuL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應緩沖液的組成 為：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgS041.93g，（NH4)2S042.64g，Tween202mL 和 Betainel87.4g;其中 IOOyL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0058] 溶液2為引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ LBIP、2. 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 組成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的濃度均為 100 μ M ;
[0059] (3)、分別將步驟⑴提取的總DNA 1 μ L加入到步驟⑵配制的25 μ L LAMP反應 溶液中，混合；
[0060] (4)、在60°C恒溫水浴中反應30分鐘；
[0061] (5)、診斷結果：取產物5以1^進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為12(^，2〇1^11。 電泳圖出現條帶的為陽性，沒有出現條帶的為陰性。
[0062] 如圖2所示，其中圖2中，M :marker (分子標尺）；泳道1 :虹彩病毒基因組；泳道 2 :偽狂犬病毒基因組；泳道3 :蛙皰疹病毒1型基因組；泳道4 :毛霉菌基因組；泳道5 :壺菌 基因組；泳道6 :水霉菌基因組；泳道7 :青霉菌基因組；泳道8 :酵母菌基因組；泳道9 :豬細 小病毒；泳道10 :純水。由圖2所示，只有蛙皰疹病毒1型基因組呈陽性，說明該方法對蛙 皰疹病毒1型檢測特異。本試驗例中的各種真菌及病毒基因均可從市場購買并通過常規方 法進行提取或者由東北林業大學保護醫學與生態安全研究中心保存和提取，東北林業大學 保護醫學與生態安全研究中心保證從申請日起二十年內向公眾發放生物材料。
[0063] 實施例3 :蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗：
[0064] 本實施例中的引物和操作步驟與實施例1完全相同，待測樣本中的陽性樣本即蛙 皰疹病毒1型由東北林業大學保護醫學與生態安全研究中心保存也可以從市場購買獲得， 陰性樣本為純水
[0065] 為蛙皰疹病毒1型病毒LAMP引物擴增不同濃度梯度基因后瓊脂糖凝膠電泳檢測 結果，擴增條件為60°C，擴增時間為30min。IX IO7-I X IO3個拷貝的模板均有特異性產物 產生，和對照組均無條帶產生，此圖可看出本研究所設計的通用LAMP引物在60°C下，擴增 30min之后最少可檢出IX IO3個拷貝的模板（如附圖3和圖4)。
[0066] 具體檢測步驟如下：
[0067] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟提取待測樣本總的DNA核 酸，將提取的DNA分別加水稀釋從IO 7到ΚΓ1，稀釋后的DNA作為反應模板；
[0068] (2)、配置LAMP反應溶液：按總反應體積25 μ L為例，擴增體系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L滅菌水、12. 5 μ L 2Χ反應緩沖液和0. 9 μ L引物混合物5 μ L溶 液1、5 μ L溶液2和15 μ L溶液3組成；
[0069] 其中溶液1為2Χ反應緩沖液，所述2Χ反應緩沖液由900yL 2XLAMP反應 緩沖液和IOOuL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應緩沖液的組成 為：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgS041.93g，（NH4)2S042.64g，Tween202mL 和 Betainel87.4g;其中 IOOyL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0070] 溶液2為引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ L ΒΙΡ、2· 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 組成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的濃度均為 100 μ M ;
[0071] (3)、當結果需要用熒光染料技術檢測時，在步驟（2)的25 μ L LAMP反應中加入 〇· 2 μ L熒光染料FD ;
[0072] (4)、取步驟⑴提取的樣本總DNA 1 μ L加入到步驟⑵配制的25 μ L LAMP反應 溶液中，混合；
[0073] (5)、在60°C恒溫水浴中反應30分鐘；
[0074] (6)、診斷結果：1.瓊脂糖電泳觀察結果；
[0075] 2.在紫外燈的直接照射下，觀察實驗結果。
[0076] 結果如圖3所示，其中圖3中，M:marker (分子標尺）；泳道I :1X107個拷貝；泳 道2 :1 X IO6個拷貝；泳道3 :1 X IO5個拷貝；泳道4 :1 X IO4個拷貝；泳道5 :1 X IO3個拷貝； 泳道6 :1 X IO2個拷貝；泳道7 = IXlO1個拷貝；泳道8 :1 X 10°個拷貝；泳道9 = IXKT1個拷 貝；10泳道：陰性對照。
[0077] LAMP反應過程中可通過熒光染料使其顯色，在I X IO6個拷貝?I X 10°個拷貝以及 純水中按照步驟（3)在LAMP反應液中加入熒光染料，并將步驟（1)提取的樣本總DNA 1 μ L 加入到步驟（2)配制的25μ L LAMP反應溶液中，混合；結果如圖4所示，最低可以看出IO3 個拷貝的蛙皰疹病毒1型濃度，與靈敏度后瓊脂糖電泳結果檢測一致。
[0078] 以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何形式上和實質上的限 制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技 術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依 據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發明的技術方案的范圍內。
【權利要求】
1. 蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法，包括下述步驟： (1) 、提取待測樣本總DNA作為反應模板； (2) 、配置LAMP反應溶液，其中LAMP反應溶液由Bst DNA聚合酶、水霉菌、滅菌水、2 X 反應緩沖液和引物混合物組成，體積比為： Bst DNA聚合酶：水霉菌：滅菌水：2X反應緩沖液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ； (3) 、將步驟⑴提取的樣本總DNA加入到步驟⑵配制的LAMP反應溶液中，混合； (4) 、在60°C恒溫水浴中反應30分鐘； (5) 、診斷結果：將步驟（4)擴增反應后產物用電泳檢測或熒光染料技術進行鑒定，呈 陽性的表不樣本含有娃皰疫病毒1型，呈陰性的表不樣本不含有娃皰疫病毒1型。
2. 根據權利要求1所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（2)中 的2 X反應緩沖液由900 μ L 2 X LAMP反應緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP混合液組 成；其中2父1^1^反應緩沖液的組成為：1]\1?!18.81'1^-!1(：14〇1^，1((：11.498，]\%50 4 1.938， (NH4)2S04 2 . 64g，Tween20 2mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成； 所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3和2.5yL B3組成，其中FIP、BIP、 F3和B3的濃度均為100 μ Μ ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物B3序列如SEQ No. 3 所示，內引物FIP序列如SEQ No. 4所示和內引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
3. 根據權利要求1所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（3) 中樣本總DNA與LAMP反應溶液之間的體積比為1:25。
4. 根據權利要求1所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（5) 中電泳檢測的過程為：取產物5 μ L進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V，20min ; 電泳圖出現條帶的為陽性，沒有出現條帶的為陰性。
5. 根據權利要求1所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（5) 中的熒光染料技術鑒定過程為：在步驟（2)配置的LAMP反應溶液中加入染色劑，反應后在 紫外燈下呈現綠色為陽性，不呈現綠色的為陰性。
6. 根據權利要求5所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其特征在于：所述染色 劑為FD，染色劑與步驟（2)配置的LAMP反應溶液的體積比為0. 2:25。
7. 用于權利要求1?5中任一權利要求所述的娃皰疫病毒1型的LAMP快速檢測方法 的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由Bst DNA聚合酶、水霉菌、滅菌水、2X反應緩沖液和 引物混合物組成，體積比為： Bst DNA聚合酶：水霉菌：滅菌水：2X反應緩沖液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ； 所述2 X反應緩沖液由900 μ L 2 X LAMP反應緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP混 合液組成；其中2XLAMP反應緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KC1 1. 49g，MgS04 1. 93g，（NH4)2S042 . 64g，Tween20 2mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成； 所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3和2.5yL B3組成，其中FIP、BIP、 F3和B3的濃度均為100 μ Μ ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物B3序列如SEQ No. 3 所示，內引物FIP序列如SEQ No. 4所示和內引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
【文檔編號】C12Q1/70GK104293983SQ201410631647
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】王曉龍, 汪環 申請人:東北林業大學