專利名稱：抗豬O型口蹄疫病毒病shRNA設計及載體的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA及載體的構建方法，特別是涉及一種利用基因工程技術，通過shRNA的設計、合成及載體構建、攻毒、RT-PCR等過程及利用RNA 干擾技術進行抑制豬0型口蹄疫病毒復制，屬于抑制口蹄疫病毒(FMDV)復制技術領域。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一種嚴重危害偶蹄動物的急性、熱性和高度接觸性傳染病。 該病在世界各國廣泛流行。本病以傳播迅速、發病率高、經濟損失巨大而成為家畜疾病中的頭號“經濟病”，國際獸疫局(OIE)將其列為A類家畜傳染病之首，我國農業部將其列為第一類動物疫病的第一病。對口蹄疫的防治，發展中國家主要以疫苗防治為主，但在該病的免疫防控中存在疫苗的研制落后于病毒的變異、毒力反強、滅活不徹底、活病毒逃逸生產車間等的弊端，這就要求人們探索新的抗口蹄疫病毒的策略與手段。口蹄疫病毒有A、0、C ,Asial和南非1、2、3型7個血清型，不同亞型有70多個。近年來，在我國不同地區又不斷出現了很多口蹄疫病毒變異株，這給該病的防控帶來了很大的困難。對口蹄疫的防治，發達國家大多采取撲殺銷毀的措施，而我國主要依靠疫苗免疫接種。FMD常用疫苗包括滅活疫苗和弱毒疫苗，FMD滅活疫苗免疫原性較差，且抗原譜較窄；弱毒疫苗雖然具有良好的免疫原性，在預防和控制FMD的過程中發揮著重要的作用，但由于口蹄疫存在毒力返祖、病毒滅活不徹底、活病毒逃逸疫苗加工廠等不安全因素限制了此類疫苗的應用。同時，由于FMDV是一種高度變異性的RNA病毒血清型，而各型間不存在交叉保護作用，通過免疫接種來預防和控制口蹄疫的流行變得越來越困難。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是最早發現于植物細胞中的一種轉錄后的基因沉默技術，它是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，也即通過對目的基因轉錄后產生的mRNA的降解而使目的基因不能表達，即所謂的基因沉默，其原理是通過導入或細胞內產生與靶mRNA序列特異互補的小分子雙鏈RNA， 這種RNA稱為小分子干擾RNA(S卩siRNA)。siRNA產生后，通過siRNA中的一條鏈與靶mRNA 序列互補配對，再在一系列酶的作用下將靶mRNA降解，從而使靶mRNA不能翻譯、表達，使其表型沉默。自從RNAi發現后，RNAi技術已被廣泛應用于基因功能、遺傳規律、生長發育、信號轉導、抗腫瘤和抗病毒等領域，在抗病毒研究中充分顯示出其巨大的應用潛力，有望成為防控病毒性疫病的一種新手段。因此，利用RNA干擾技術構建表達載體能抑制口蹄疫病毒復制，為下一步培育具有抗口蹄疫病毒的轉基因動物提供了有力保障。參考文獻
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發明內容
本發明的目的在于提供一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA及載體的構建方法，其釆用合成法并利用基因工程技術構建質粒并將優秀的干擾片段篩選出來，此質粒具有抑制口蹄疫病毒復制的能力，且在細胞水平上能夠明顯抑制FMDV的復制；根據RNA干擾技術原理我們選擇FMDV基因開放閱讀框中的VP1和3D基因為進行RNA干擾的靶位點。其中VP1 編碼區是主要抗原區，能誘導動物產生中和抗體。3D為RNA依賴的RNA聚合酶(3Dpol)，又稱病毒相關抗原(VIAA)，催化病毒RNA的合成。病毒RNA復制時首先是正鏈RNA在3D作用下，從其3’端合成其互補鏈；再以負鏈為模板合成子代正鏈RNA。3Dpol的核苷酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性。本發明應用RNAi技術在細胞水平篩選得到能明顯抑制FMDV 復制的shNRA序列。本發明的技術方案是這樣實現的一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于合成抗口蹄疫病毒帶shRNA載體的方法如下
1.根據GenBank中公布的0型口蹄疫基因組序列，選擇VP1和3D基因中的保守區段， 選取一段19bp長的核酸序列；該序列不要在5’和3’非翻譯區及起始密碼子后7^p，因為這些區域富含調控蛋白，可能會影響RNA干擾效果；
2.選取19bp核酸序列時要按下列要求進行
1)計算該19bp核酸序列的GC含量，GC含量必須在40%-60%之間。GC含量大約在45% 時最佳；
2)在15-19位點中至少有3個A或T核酸殘基，可以增強RNA干擾活性；
3)保證19bp核酸序列不會形成二級結構；
4)在正義鏈和反義鏈寡核苷酸序列之間加入間隔序列TTCAAGAGA，使其能形成發夾結構，在反義鏈的3’端加入RNA polymerase的終止序列TTTTTT ；
3.19bp核酸序列是特異性的只針對豬口蹄疫毒病目的基因，與其他基因沒有太大的相似性，根據載體特性，合成發卡結構shRNA對應的DNA序列。所述的抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA的序列如下，其中的核苷酸序列為5’ _3’ ； pSIREN-FMDV- VP1-I
正義鏈
GATCCAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTG pSIREN-FMDV- VP「2 正義鏈
GATCCAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTG pSIREN-FMDV- VP「3 正義鏈
GATCCAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTMGCTGTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTG pSIREN-FMDV- VP「4 正義鏈GATCCAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTG pSIREN-FMDV- VP「5 正義鏈
GATCCAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTG pSIREN-FMDV- VP「6 正義鏈
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AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTG
PSIREN-FMDV-3D-1
正義鏈
GATCCATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATG
PSIREN-FMDV-3D-2
正義鏈
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AATTCACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTG
PSIREN-FMDV-3D-3
正義鏈
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AATTCACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTG
PSIREN-FMDV-3D-4
正義鏈
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AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTG
PSIREN-FMDV-3D-5
正義鏈
GATCCAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTG PSIREN-FMDV-3D-6正義鏈
GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈
AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTG 將上述 shRNA 連接到 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector (購自 clontech 公司)上，然后將干擾載體大提質粒、線性化、乙醇沉淀、轉染BHK-21細胞內，再對轉染的細胞感染0型口蹄疫病毒，然后收毒，并提取毒液RNA，最后通過Real-time PCR篩選出高效抑制口蹄疫病毒復制的表達載體，這些載體就具有抗0型口蹄疫病毒病的能力。所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector 作為 RNA 干擾載體，首先將上述人工合成的shRNA序列合鏈，合鏈的條件是95°C 30s, 72°C 2min,37°C 2min,25°C 2min，這些雙鏈具有粘性末端，可以直接連接到干擾載體上，本發明所篩選的RNA干擾載體含有很好抑制口蹄疫病毒復制的shRNA。本發明的積極效果是通過設計shRNA，然后將人工合成的DNA合鏈，克隆到 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector上，最后將載體線性化后轉染BHK-21細胞，利用表達的shRNA來抑制口蹄疫病毒的復制，從而起到預防的作用；近年來，在我國不同地區又不斷出現了很多口蹄疫病毒變異株，又因為口蹄疫病毒存在毒力返祖、病毒滅活不徹底、 活病毒逃逸疫苗加工廠等不安全因素，所以通過免疫接種來預防和控制口蹄疫的流行變得越來越困難，而本發明能通過RNA干擾來預防口蹄疫病毒，這將會對養豬業的發展產生深遠影響，為人類帶來更大的利益。
圖1是載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen及連入干擾片段結構圖。圖2是shRNA合鏈結果瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3是表達質粒轉染BHK-21細胞22h時的熒光圖。圖4是接毒不同時間段后BHK-21細胞病變圖。圖5是攻毒后細胞總RNA的提取結果瓊脂糖凝膠電泳圖。圖6是內參標準曲線和樣品標準曲線繪制結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。這些實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。實施例1，抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA的設計，如圖1所示
(1)根據GenBank中公布的0型口蹄疫基因組序列，選擇VP1和3D基因中的保守區段， 選取一段19bp長的核酸序列。設計分別包含目的基因siRNA序列的正義鏈和反義鏈寡核苷酸序列，該核苷酸序列的GC含量為40%-60% ；在15-19位點中至少有3個A或T核酸殘基，可以增強RNA干擾活性；保證19bp核酸序列不會形成二級結構。(2)在正義鏈和反義鏈寡核苷酸序列之間加入間隔序列TTCAAGAGA，使其能形成發夾結構，在反義鏈的3’端加入RNA polymerase的終止序列TTTTTT，后再加上ECORI和 BamHI酶切位點適配序列；委托上海生工生物有限公司進行單鏈DNA的人工合成，共120對，其中包括兩個亂序干擾片段。(3) 19bp核酸序列是特異性的只針對豬口蹄疫毒病目的基因，與其他基因沒有太大的相似性，根據載體特性，合成發卡結構shRNA對應的DNA序列。實施例2 抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA的合成
將人工合成的正、反義鏈DNA片段，以去離子水溶解，終濃度為ΙΟΟμΜοΙ/L，各取10 μ 1 后 PCR 儀上合成雙鏈95°C 30s, 72°C 2min，37°C 2min，25°C 2min，冰上放置后 _20°C儲存備用。部分合鏈結果如圖2所示。實施例3 設計和合成的抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA pSIREN-FMDV- VP1-I
5’-GATCCAAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGT
G-3'
5' -AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATT
G-3'
pSIREN-FMDV- VP「2
5' -GATCCAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5' -AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTT
G-3，
pSIREN-FMDV- VP「3
5' -GATCCAAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5' -AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTT
G-3，
pSIREN-FMDV- VP「4
5'-GATCCAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTT
G-3，
pSIREN-FMDV- VP「5
5' -GATCCAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5' -AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTT
G-3，
pSIREN-FMDV- VP「6
5'-GATCCAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTT
G-3'
PSIREN-FMDV-3D-15’-GATCCAATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGT
G-3，
5’-AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTAT
G-3，
PSIREN-FMDV-3D-2
5’-GATCCAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTTCAAGAGACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5’-AATTCACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTT
G-3，
PSIREN-FMDV-3D-3
5’-GATCCAAAGTGACTACGACCTGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5’-AATTCACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTT
G-3'
PSIREN-FMDV-3D-4
5'-GATCCAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATTCAAGAGATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTT
G-3'
PSIREN-FMDV-3D-5
5' -GATCCAAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGT
G-3，
5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTT
G-3，
PSIREN-FMDV-3D-6
5'-GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGT
G-3'
5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTT
G-3'
實施例4 抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA連接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 載體及其鑒定
將退火雙鏈shRNA與載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-hGreen混合連接。連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 α，涂板后挑取單克隆在LB培養液中過夜，然后提取菌液質粒，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，鑒定序列是否成功連接到載體并鑒定shRNA是否正確。 實施例5 口蹄疫病毒TCID5tl的測定
小倉鼠腎細胞系(ΒΗΚ-21)細胞復蘇后，用含有10%小牛血清不含抗生素的DMEM營養液傳代，放置37°C、5 %、0)2培養箱中培養待用。0型口蹄疫病毒毒株0S-99的生長和滴定都通過ΒΗΚ-21細胞進行。滴定由以下方法進行，ΒΗΚ-21細胞在感染前一天被植入96孔板，將原毒液在滅菌小試管內作連續的10倍稀釋，吸取每一稀釋度的病毒液0. 1ml，加入于96孔已長成單層的敏感BHK-21細胞中，每個稀釋度的病毒液接種8個孔。于37°C靜止培養，逐日觀察(一般需7-10d左右)，直至終點，也就是看到能夠引起病毒增值的病毒最高稀釋度。 用Reed-Muench公式及原理測原病毒的TCID5tl應是0. Imll0_3 95稀釋的病毒液。查反對數， 得8913，即該病毒8913倍稀釋液0. Iml等于1個TCID500實施例6 抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA轉染BHK-21細胞及攻毒實驗
將構建好的表達載體擴大培養，大劑量提取質粒，線性化后乙醇沉淀，然后在M孔板上設轉染表達質粒組、陰性對照組、不轉染組和空白正常細胞組如圖3所示。用含有10% 小牛血清不含抗生素的DMEM營養液傳代BHK-21細胞于M孔培養板，每孔5. OX IO4細胞 /500 μ 1個，37°C、5%、CO2培養箱中培養20-24 h，使細胞貼壁生長滿度達到90-95%，按照Transf ectamine2000 Reagent試劑說明書操作步驟進行轉染。轉染表達質粒的BHK-21 細胞培養20-24 h后，以2X IO3TCID5tl/孔的FMDV感染，繼續培養，分別于接毒10、20、40、80 h后觀察CPE的變化如圖4所示并收集不同時間段的細胞毒液_80°C儲存備用。實施例7 攻毒細胞RNA的提取及Real-time PCR
從_80°C取出攻過毒的BHK-21細胞，用TRIZOL試劑提取細胞RNA如圖5所示。取5 μ 1 DNase I處理的RNA，用試劑盒進行常規的反轉錄反應使RNA逆轉錄成為cDNA。設計 VP”3D、β -actin基因序列(表1)，以克隆正確的VP1JD和β -actin質粒為模板，各建立6 個10倍梯度稀釋，繪制目標基因和內參基因標準曲線如圖6所示。結果顯示目標基因和內參基因相關系數均為0. 998，說明6個點都在一條直線上，線性關系好，準確性比較高。
權利要求
1.一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于合成抗口蹄疫病毒帶ShRNA載體的方法如下根據GenBank中公布的0型口蹄疫基因組序列，選擇VP1和3D基因中的保守區段，選取一段19bp長的核酸序列；該序列不要在5’和3’非翻譯區及起始密碼子后7^p，因為這些區域富含調控蛋白，可能會影響RNA干擾效果； 選取19bp核酸序列時要按下列要求進行1)計算該19bp核酸序列的GC含量，GC含量必須在40%-60%之間，GC含量大約在45% 時最佳；2)在15-19位點中至少有3個A或T核酸殘基，可以增強RNA干擾活性；3)保證19bp核酸序列不會形成二級結構；4)在正義鏈和反義鏈寡核苷酸序列之間加入間隔序列TTCAAGAGA，使其能形成發夾結構，在反義鏈的3’端加入RNA polymerase的終止序列TTTTTT ；19bp核酸序列是特異性的只針對豬口蹄疫毒病目的基因，與其他基因沒有太大的相似性，根據載體特性，合成發卡結構shRNA對應的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于所述的抗豬 0型口蹄疫病毒病shRNA的序列如下，其中的核苷酸序列為5’-3’ ；pSIREN-FMDV-VPl-1 正義鏈GATCCAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTGpSIREN-FMDV-VPl-2正義鏈GATCCAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTGpSIREN-FMDV-VPl-3正義鏈GATCCAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTGpSIREN-FMDV-VPl-4正義鏈GATCCAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTGpSIREN-FMDV-VPl-5正義鏈GATCCAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTGpSIREN-FMDV-VPl-6正義鏈GATCCAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTGPSIREN-FMDV-3D-1正義鏈GATCCATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATGPSIREN-FMDV-3D-2正義鏈GATCCAAGACTCTAGTGAACACGGAGTTCAAGAGACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTGPSIREN-FMDV-3D-3正義鏈GATCCAAGTGACTACGACCTGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTGPSIREN-FMDV-3D-4正義鏈GATCCAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATTCAAGAGATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTGPSIREN-FMDV-3D-5正義鏈GATCCAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGPSIREN-FMDV-3D-6正義鏈GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTG 反義鏈AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTG。
3.根據權利要求1所述的一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于所述的shRNA 載體構建方法為將上述shRNA連接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector上，然后將干擾載體大提質粒、線性化、乙醇沉淀、轉染BHK-21細胞內，再對轉染的細胞感染0型口蹄疫病毒，然后收毒，并提取毒液RNA，最后通過Real-time PCR篩選出高效抑制口蹄疫病毒復制的表達載體，這些載體就具有抗0型口蹄疫病毒病的能力。
4.根據權利要求3所述的一種抗豬0型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于所述的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector作為RNA干擾載體，首先將上述人工合成的 shRNA序列合鏈，合鏈的條件是95°C 30s, 72°C 2min，37°C 2min，25°C 2min，這些雙鏈具有粘性末端，可以直接連接到干擾載體上，本發明所篩選的RNA干擾載體含有很好抑制口蹄疫病毒復制的shRNA。
全文摘要
本發明涉及一種抗豬O型口蹄疫病毒病shRNA及載體的構建方法，其特征在于根據GenBank中公布的O型口蹄疫基因組序列，選擇VP1和3D基因中的保守區段，選取一段19bp長的核酸序列；19bp核酸序列是特異性的只針對豬口蹄疫毒病目的基因，與其他基因沒有太大的相似性，根據載體特性，合成發卡結構shRNA對應的DNA序列。其采用合成法并利用基因工程技術構建質粒并將優秀的干擾片段篩選出來，此質粒具有抑制口蹄疫病毒復制的能力，且在細胞水平上能夠明顯抑制FMDV的復制；根據RNA干擾技術原理我們選擇FMDV基因開放閱讀框中的VP1和3D基因為進行RNA干擾的靶位點。病毒RNA復制時首先是正鏈RNA在3D作用下，從其3'端合成其互補鏈；再以負鏈為模板合成子代正鏈RNA。3Dpol的核苷酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性。
文檔編號C12N15/10GK102352359SQ20111032462
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者喬軍, 哈孜, 王鵬雁, 賽務加甫, 陳創夫, 馬鈰委 申請人:石河子大學